CN112063672A - 一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷ⅱ的工艺 - Google Patents

一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷ⅱ的工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的工艺，属于分子生物学领域，它包括从淫羊藿中提取淫羊藿苷的方法、制备用于淫羊藿次苷Ⅱ酶解反应的外切葡聚糖酶，以及通过酶解制备获得淫羊藿次苷Ⅱ；本发明同时公开了该外切葡聚糖酶的氨基酸序列以及相应的核苷酸序列，本发明还提供了包含所述基因的表达盒、重组质粒和转化子；本发明优化了淫羊藿苷的提取工艺，通过采用乙醇等绿色环保试剂，降低了环境污染，并通过增加重结晶步骤，提高了产物的纯度，通过在毕赤酵母中表达一种具有高催化活性的外切葡聚糖酶，可将反应的转化率达到98％以上，具有良好的应用前景。

Description

一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的工艺
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及外切葡聚糖酶在淫羊藿次苷II制备中的应用。
背景技术
勃起功能障碍(ED)是男性常见疾病，多由心理性或器质性原因引起，严重影响了夫妻身心健康。据世卫组织统计，全球患有ED的男性约占10％，成年男子中ED患者的比例则达到1/4以上。
据统计，全球每年抗ED一线药物全球市场规模超过40亿美元。我国抗ED市场已超过了百亿元规模，在2012-2016这五年间年平均增长率达到了28.80％。目前抗ED药物主要产品包括西地那非、他达那非、伐地那非等，它们都属于5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制剂，可提高性刺激下cGMP浓度而增强勃起功能。但是由于这些口服选择性PDE5抑制剂只可一次性强烈松弛海绵体平滑肌而促进阴茎勃起，治标不治本，同时会引起低血压等副作用，特别是对有心血管疾病患者的安全性颇有争议。因此，开发安全、标本兼治的抗ED新药成为一种必然的要求。
淫羊藿为小檗科淫羊藿属草本植物，其作为壮阳药应用至今已有两千多年的历史。淫羊藿的有效成分淫羊藿苷单体具有显著的抗ED效果，同时对血压没有显著影响，动物实验表明其毒性很低。淫羊藿苷在体内的代谢衍生物淫羊藿次苷Ⅱ具有更显著的生物学功能。分子研究表明，淫羊藿次苷Ⅱ单体不仅是PDE5的特异性抑制剂，同时具有西地那非没有的一些生物学效应，如促进阴茎神经的再生，提高阴茎海绵体神经nNOS的表达等。因此，淫羊藿次苷Ⅱ有望成为新药研究制备用于治疗和预防勃起功能障碍的新药物和保健品，市场前景广阔。
目前国内外关于淫羊藿次苷Ⅱ的研究主要集中在药理和功能方面的研究，但关于淫羊藿次苷Ⅱ的生物制备方面研究较少。随着技术的进步，一些真菌以及分泌酶被发现具有糖基水解酶活性，可用于淫羊藿次苷Ⅱ的制备，但仍然存在真菌培养条件复杂、分泌酶产率低且多为混合物、水解效率低等问题，因为真菌遗传背景复杂，通过基因工程技术大幅提高水解酶在真菌中的表达量和活性较为困难。因此，直接寻找高活性的外切葡聚糖酶，并通过基因工程方法大量表达直接用于生物催化反应的外切葡聚糖酶逐渐成为重要的研究领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的工艺，具有反应高效、条件温和、成本低、产物纯度高，适合工业化生产等优点。
为了达成上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的工艺，该制备工艺包括：
从淫羊藿中提取淫羊藿苷的步骤、制备用于淫羊藿次苷Ⅱ酶解反应的外切葡聚糖酶；以及通过酶解制备获得淫羊藿次苷Ⅱ。
作为优选的方案，所述制备工艺具体包括以下步骤：
(1)淫羊藿苷的提取：选取淫羊藿植物并粉碎至40-60目，并将粉碎物加入至浓度为45-85％的乙醇中进行加热回流1-4小时后得到淫羊藿粗浸膏；将淫羊藿粗浸膏加入至水和乙酸乙酯中溶解并等待其分层，将水相用乙酸乙酯萃取3-5次后合并乙酸乙酯相，并用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干，得干燥物；将干燥物加入至混合溶剂中进行加热回流1-4小时，过滤取滤液干燥后即得淫羊藿苷；
本发明改进了淫羊藿苷提取工艺，其优点是：直接采用混合溶剂反复结晶法，混合溶剂为水与甲醇按照1:2-3的体积比的混合物，较之传统的色谱柱或者大孔吸附树脂分离方法成本更低，溶剂用量少、生产周期短、避免价格昂贵的柱料，便于工厂大规模生产。
(2)外切葡聚糖酶的制备：将含外切葡聚糖酶基因的毕赤酵母进行发酵，甲醇诱导3～5天，离心，取发酵液上清，即获得外切葡聚糖酶粗酶液。
(3)酶解制备淫羊藿次苷Ⅱ：将5-15mg淫羊藿苷加入到pH＝6-7的磷酸钠或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，向反应体系中加入约1-10％的助溶剂二甲基亚砜和50ml外切葡聚糖酶粗酶液，得总体积200mL反应体系，500rpm条件下反应至结束，乙酸乙酯萃取3-5次，合并有机相，水洗，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸去除乙酸乙酯后得产品。
作为优选的方案，所述外切葡聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示。
作为优选的方案，编码所述SEQ ID NO.2氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述SEQ ID NO.4氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了包含所述基因的表达盒、重组质粒和转化子。
作为优选的方案，所述表达盒的启动子为AOX1启动子或GAP启动子，在这些启动子的作用下，外切葡聚糖酶基因可以直接在大肠杆菌宿主细胞中实现胞内可溶表达。
作为优选的方案，所述重组质粒的原始载体为质粒pPICZα、pPIC9K、pGAPZα。
作为优选的方案，所述转化子的宿主细胞为毕赤酵母。
作为优选的方案，所述步骤(1)中，将干燥物加入至混合溶剂中进行加热回流1-4小时过滤取滤渣的操作为两次，将两次滤液合并后干燥即得淫羊藿苷；
所述混合溶剂为水与甲醇按照1:2-3的体积比混合后的混合溶剂。
作为优选的方案，所述步骤(2)中，酵母发酵后的上清液可直接用于淫羊藿次苷Ⅱ的制备。
作为优选的方案，所述步骤(3)中，底物质量与发酵上清液用量比为1:5(质量体积比mg/ml)。
本发明的有益效果是：
本发明优化了淫羊藿苷的提取工艺，通过采用乙醇等绿色环保试剂，降低了环境污染，并通过增加重结晶步骤，提高了产物的纯度，达98.9％。本发明通过在毕赤酵母中表达一种具有高催化活性的外切葡聚糖酶，可将反应的转化率达到98％以上，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明的外切葡聚糖酶催化反应的过程的液相色谱检测图；
图2为本发明外切葡聚糖酶的催化产物液质联用鉴定图谱；
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
淫羊藿苷的制备
淫羊藿草(40-60目)100g，75％乙醇400ml加热回流1h，得15.5g淫羊藿粗浸膏(HPLC淫羊藿苷含量10％)，用150ml水和150ml乙酸乙酯溶解并分层，水相每次用150ml乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干得8.5g黄褐色固体。用水：甲醇＝1:2的混合溶剂100ml加热回流1h，过滤，滤渣再用100ml混合溶剂回流1h，合并两次的母液，旋干，烘干得1.49g浅黄色固体(HPLC淫羊藿苷含量98.5％)，收率96.1％。
实施例2
一、外切葡聚糖酶基因的获得
外切葡聚糖酶基因在多种真菌中都有分布，本发明所采用的外切葡聚糖酶(cbh1)的基因序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示，分别来源于粗糙脉孢菌和绿色木霉，根据毕赤酵母密码子使用的有关特性对序列进行优化后，由人工合成来的。利用该人工合成基因的目的是为了在毕赤酵母等真核表达系统中获得外切葡聚糖酶。
二、酵母工程表达菌株的构建
将包含外切葡聚糖酶(cbh1)基因的质粒线性化后，琼脂糖凝胶纯化回收，取10μl线性化的质粒与80μl毕赤酵母X33感受态细胞混合，转入预冷的电击杯中，冰上放置5分钟，1500v进行电击5ms，电击结束后立即加入1ml冰预冷的山梨醇至电击杯中，30℃静置培养1-2h，分别取100μl的上述转化液涂布在含有100μg/ml Zeocin和500μg/ml Zeocin YPDS平板上，30℃倒置培养2-4天直至菌落出现。挑取菌落，进行菌落PCR鉴定阳性转化子。
三、外切葡聚糖酶粗酶液的制备
挑取含有SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示的外切葡聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌株于含有终浓度为100μg/ml Zeocin的BMGY培养基中培养至OD600为2.0-6.0，离心收集菌体，加入等体积BMMY培养基后于30℃，250rpm/min条件下继续培养，每24h补加占培养液体积1％的甲醇。72h-120h后，5000rpm离心，取发酵液上清，即为粗酶液。或者将上清超滤脱盐浓缩后，经离子交换层析，再进行浓缩和冷冻干燥，可得外切葡聚糖酶。
四、淫羊藿次苷Ⅱ的生物转化
在总体积20mL反应体系中加入5ml粗酶液，加入1mg淫羊藿苷，DMSO至终浓度为3％，缓冲液为0.2M磷酸钠或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，40℃、500rpm搅拌条件下进行反应。在反应的不同时间点取样，用乙酸乙酯萃取并在60℃蒸干，甲醇溶解后经液相和液质联用检测，确认两种粗酶液都可以将淫羊藿苷转化为淫羊藿次苷Ⅱ，且SEQ ID No.2所示外切葡聚糖酶粗酶液较SEQ ID No.4的粗酶液具有更高的催化活性。因此，本研究采用SEQ IDNo.2编码的外切葡聚糖酶用于后续的实施例。SEQ ID No.2所示外切葡聚糖酶粗酶液催化合成淫羊藿次苷Ⅱ的代表性液相检测图谱如图1所示，催化产物的液质鉴定如图2所示。
实施例3
催化反应温度、pH和诱导温度、时间对发酵上清液催化效果的影响
将反应体系在pH＝6、不同的温度下进行催化反应，其他条件同实施例2。在50℃时，酶具有更好的催化活性，但40℃时酶的稳定性更好。在不同的温度条件下，淫羊藿苷的转化率有显著的不同，在温度为30℃、40℃、50℃、60℃时，转化率分别为89.3％、98.4％、86.7％、8.2％。
将反应体系分别在40℃、不同的pH条件下进行催化反应，淫羊藿苷的转化率有显著的不同，在pH为5、6、7时，pH＝6时转化效果最佳，转化率分别为78.5％、98.2％、91.6％。
温度显著影响酵母的代谢及蛋白酶活性。本实施例将含有SEQ ID No.2基因序列的毕赤酵母X33菌株分别在22℃和25℃进行诱导，制备粗酶液进行催化反应，前者的催化活性较后者提高了37.9％。诱导时长也会显著影响粗酶液的催化活性，诱导5天的粗酶液活性较诱导3天的粗酶液提高了40.3％。
实施例4
淫羊藿次苷Ⅱ的制备和分离纯化
在总体积200mL反应体系中加入10mg淫羊藿苷，DMSO浓度至3％，加入缓冲液为pH＝6的0.2M磷酸钠缓冲液，加入SEQ ID No.2粗酶液50ml，40℃，500rpm搅拌条件下进行反应，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸去除乙酸乙酯后得淫羊藿次苷Ⅱ，经液相检测，转化率达98.1％。
以上就本发明较佳的实施例作了说明，但不能理解为是对权利要求的限制。本发明不仅局限于以上实施例，其具体结构允许有变化，凡在本发明独立要求的保护范围内所作的各种变化均在本发明的保护范围内。
以上就本发明较佳的实施例作了说明，但不能理解为是对权利要求的限制。本发明不仅局限于以上实施例，其具体结构允许有变化，凡在本发明独立要求的保护范围内所作的各种变化均在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 浙大宁波理工学院
<120> 一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的工艺
<130> 2020/09/22
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1566
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgctcgcca agttcgctgc ccttgcggcc cttgtggcct ctgccaacgc ccaggctgtt 60
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atggtcctcg tcatgtccat ctgggacgac catgccgcca acatgctctg gctcgactcc 1200
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<211> 521
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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Thr Asp Cys Ala Thr Lys Cys Cys Val Asp Gly Ala Glu Tyr Ser Ser
85 90 95
Thr Tyr Gly Ile Gln Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Leu Gln Phe Val
100 105 110
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115 120 125
Asn Gly Ala Asp Ala Tyr Gln Gly Phe Glu Leu Leu Gly Asn Glu Phe
130 135 140
Thr Phe Asp Val Asp Val Ser Gly Thr Gly Cys Gly Leu Asn Gly Ala
145 150 155 160
Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Leu Asp Gly Gly Lys Ala Lys Tyr Thr
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Asn Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala Gln
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Cys Pro Arg Asp Leu Lys Tyr Ile Asn Gly Ile Ala Asn Val Glu Gly
195 200 205
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210 215 220
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355 360 365
Gly Leu Lys Gln Met Gly Lys Ala Leu Ala Lys Pro Met Val Leu Val
370 375 380
Met Ser Ile Trp Asp Asp His Ala Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser
385 390 395 400
Thr Tyr Pro Val Glu Gly Gly Pro Gly Ala Tyr Arg Gly Glu Cys Pro
405 410 415
Thr Thr Ser Gly Val Pro Ala Glu Val Glu Ala Asn Ala Pro Asn Ser
420 425 430
Lys Val Ile Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Phe
435 440 445
Ser Gly Gly Ser Ser Gly Thr Pro Pro Ser Asn Pro Ser Ser Ser Val
450 455 460
Lys Pro Val Thr Ser Thr Ala Lys Pro Ser Ser Thr Ser Thr Ala Ser
465 470 475 480
Asn Pro Ser Gly Thr Gly Ala Ala His Trp Ala Gln Cys Gly Gly Ile
485 490 495
Gly Phe Ser Gly Pro Thr Thr Cys Gln Ser Pro Tyr Thr Cys Gln Lys
500 505 510
Ile Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Val
515 520
<210> 3
<211> 1545
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtatcgga agttggccgt catctcggcc ttcttggcca cagctcgtgc tcagtcggcc 60
tgcactctcc aatcggagac tcacccgcct ctgacatggc agaaatgctc gtctggtggc 120
acgtgcactc aacagacagg ctccgtggtc atcgacgcca actggcgctg gactcacgct 180
acgaacagca gcacgaactg ctacgatggc aacacttgga gctcgaccct atgtcctgac 240
aacgagacct gcgcgaagaa ctgctgtctg gacggtgccg cctacgcgtc cacgtacgga 300
gttaccacga gcggtaacag cctctccatt ggctttgtca cccagtctgc gcagaagaac 360
gttggcgctc gcctttacct tatggcgagc gacacgacct accaggaatt caccctgctt 420
ggcaacgagt tctctttcga tgttgatgtt tcgcagctgc cgtgcggctt gaacggagct 480
ctctacttcg tgtccatgga cgcggatggt ggcgtgagca agtatcccac caacaccgct 540
ggcgccaagt acggcacggg gtactgtgac agccagtgtc cccgcgatct gaagttcatc 600
aatggccagg ccaacgttga gggctgggag ccgtcatcca acaacgcgaa cacgggcatt 660
ggaggacacg gaagctgctg ctctgagatg gatatctggg aggccaactc catctccgag 720
gctcttaccc cccacccttg cacgactgtc ggccaggaga tctgcgaggg tgatgggtgc 780
ggcggaactt actccgataa cagatatggc ggcacttgcg atcccgatgg ctgcgactgg 840
gacccatacc gcctgggcaa caccagcttc tacggccctg gctcaagctt taccctcgat 900
accaccaaga aattgaccgt tgtcacccag ttcgagacgt cgggtgccat caaccgatac 960
tatgtccaga atggcgtcac tttccagcag cccaacgccg agcttggtag ttactctggc 1020
aacgggctca acgatgatta ctgcacagct gaggaggcag aattcggcgg atcctctttc 1080
tcagacaagg gcggcctgac tcagttcaag aaggctacct ctggcggcat ggttctggtc 1140
atgagtctgt gggatgatta ctacgccaac atgctgtggc tggactccac ctacccgaca 1200
aacgagacct cctccacacc cggtgccgtg cgcggaagct gctccaccag ctccggtgtc 1260
cctgctcagg tcgaatctca gtctcccaac gccaaggtca ccttctccaa catcaagttc 1320
ggacccattg gcagcaccgg cgaccctagc ggcggcaacc ctcccggcgg aaacccgcct 1380
ggcaccacca ccacccgccg cccagccact accactggaa gctctcccgg acctacccag 1440
tctcactacg gccagtgcgg cggtattggc tacagcggcc ccacggtctg cgccagcggc 1500
acaacttgcc aggtcctgaa cccttactac tctcagtgcc tgtaa 1545
<210> 4
<211> 514
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg
1 5 10 15
Ala Gln Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr
20 25 30
Trp Gln Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser
35 40 45
Val Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser
50 55 60
Thr Asn Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys Pro Asp
65 70 75 80
Asn Glu Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Ala
85 90 95
Ser Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser Ile Gly Phe
100 105 110
Val Thr Gln Ser Ala Gln Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met
115 120 125
Ala Ser Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe
130 135 140
Ser Phe Asp Val Asp Val Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala
145 150 155 160
Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro
165 170 175
Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln
180 185 190
Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly
195 200 205
Trp Glu Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly Ile Gly Gly His Gly
210 215 220
Ser Cys Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Glu
225 230 235 240
Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Thr Thr Val Gly Gln Glu Ile Cys Glu
245 250 255
Gly Asp Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr
260 265 270
Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asp Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr
275 280 285
Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu Asp Thr Thr Lys Lys
290 295 300
Leu Thr Val Val Thr Gln Phe Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr
305 310 315 320
Tyr Val Gln Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu Gly
325 330 335
Ser Tyr Ser Gly Asn Gly Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu
340 345 350
Ala Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln
355 360 365
Phe Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp
370 375 380
Asp Asp Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr
385 390 395 400
Asn Glu Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala Val Arg Gly Ser Cys Ser Thr
405 410 415
Ser Ser Gly Val Pro Ala Gln Val Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys
420 425 430
Val Thr Phe Ser Asn Ile Lys Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Gly Asp
435 440 445
Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly Thr Thr Thr
450 455 460
Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln
465 470 475 480
Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val
485 490 495
Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln
500 505 510
Cys Leu

Claims (10)

1.一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的制备工艺，其特征在于，该制备工艺包括：
从淫羊藿中提取淫羊藿苷的方法；
制备用于淫羊藿次苷Ⅱ酶解反应的外切葡聚糖酶；
以及通过酶解制备获得淫羊藿次苷Ⅱ。
2.根据权利要求1所述的一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的制备工艺，其特征在于：所述制备工艺具体包括以下步骤：
(1)淫羊藿苷的提取：选取淫羊藿植物并粉碎至40-60目，并将粉碎物加入至浓度为45-85％的乙醇中进行加热回流1-4小时后得到淫羊藿粗浸膏；将淫羊藿粗浸膏加入至水和乙酸乙酯中溶解并等待其分层，将水相用乙酸乙酯萃取3-5次后合并乙酸乙酯相，并用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干，得干燥物；将干燥物加入至混合溶剂中进行加热回流1-4小时，过滤取滤液干燥后即得淫羊藿苷；
(2)外切葡聚糖酶的制备：将含外切葡聚糖酶基因的毕赤酵母进行发酵，甲醇诱导3～7天，离心，取发酵液上清，即获得外切葡聚糖酶粗酶液；
(3)酶解制备淫羊藿次苷Ⅱ：将5-15mg淫羊藿苷加入到pH＝6-7的磷酸钠缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，向反应体系中加入约1-10％的助溶剂二甲基亚砜和50ml外切葡聚糖酶粗酶液，得总体积200mL反应体系，500rpm条件下反应至结束，乙酸乙酯萃取3-5次，合并有机相，水洗，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸去除乙酸乙酯后得产品。
3.根据权利要求1所述的一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的制备工艺，其特征在于：所述外切葡聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求3所述的氨基酸序列，其特征在于：编码所述SEQ ID NO.2氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述SEQ ID NO.4氨基酸序列的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
5.一种包含权利要求4所述核苷酸序列的表达盒，其特征在于，所述表达盒的启动子为AOX1启动子或GAP启动子。
6.一种包含权利要求4所述核苷酸序列的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的原始载体为质粒pPICZα、pPIC9K、pGAPZα。
7.一种包含权利要求4所述核苷酸序列的转化子，其特征在于，所述转化子的宿主细胞为毕赤酵母。
8.根据权利要求2所述的一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的制备工艺，其特征在于，所述步骤(1)中，将干燥物加入至混合溶剂中进行加热回流1-4小时过滤取滤渣的操作为两次，将两次滤液合并后干燥即得淫羊藿苷；所述混合溶剂为水与甲醇按照1:2-3的体积比混合后的混合溶剂。
9.根据权利要求2所述的一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的制备工艺，其特征在于：所述步骤(2)中，酵母发酵后的上清液可直接用于淫羊藿次苷Ⅱ的制备。
10.根据权利要求2所述的一种利用外切葡聚糖酶制备淫羊藿次苷Ⅱ的制备工艺，其特征在于：所述步骤(2)与(3)中，底物质量与发酵液上清体积用量比为1:5。
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