CN112020507A - 酰胺化合物及使用该化合物的多核苷酸的制造方法 - Google Patents
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Abstract
提供能以高纯度合成RNA的式(1)表示的酰胺化合物及使用该化合物的多核苷酸的制造方法。(式中,R表示(2)(式中,Ra及Rb相同或不同,表示甲基、乙基或氢原子。其中,不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况。n表示1~5的整数。),Ba表示具有可被保护的核酸碱基骨架的基团,G1及G2相同或不同,表示羟基的保护基,G3相同或不同,表示烷基。)
Description
技术领域
本专利申请基于日本专利申请2018-083148号(申请日为2018年4月24日)及日本专利申请2018-141559号(申请日为2018年7月27)主张巴黎公约所规定的专利优先权及利益,上述申请中记载的全部内容通过引用而被并入本说明书中。
本发明涉及酰胺(amidite)化合物及使用该化合物的多核苷酸的制造方法。此外,本发明还涉及上述酰胺化合物的中间体化合物及该中间体化合物的制造方法。
背景技术
RNA可以用作RNA探针、反义RNA、核酶、siRNA、适配体等,是有用的材料。
RNA可通过固相合成法等来合成,固相合成法中使用核苷的亚磷酰胺(以下称为“酰胺化物(amidite)”)作为原料。作为这样的酰胺化物的2’位的羟基的保护基,例如,TBDMS(叔丁基二甲基硅烷基)、TOM(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)、ACE(双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基)等是已知的。此外,作为酰胺化物的2’位的羟基的保护基,报道了专利文献1及2所公开的保护基,但使用具有这些保护基的酰胺化物的RNA的合成方法在得到的RNA的收率、纯度方面不一定令人满意。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利第5157168号公报
专利文献2:日本专利第5554881号公报
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的为提供能以高纯度合成RNA的酰胺化合物及使用该化合物的多核苷酸的制造方法。此外,本发明的目的为提供上述酰胺化合物的中间体化合物及该中间体化合物的制造方法。
用于解决课题的手段
本申请的发明人为实现上述目的而反复进了锐意研究,结果得到了下述见解:通过使用以下的基团作为酰胺化物的2’位的羟基的保护基,能够以高纯度合成RNA。
[化学式1]
(式中,Ra及Rb相同或不同,表示甲基、乙基或氢原子。其中,不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况。
n表示1~5的整数。)
本发明是基于上述见解进一步反复研究而完成的,其提供以下的酰胺化合物、使用了该化合物的多核苷酸的制造方法、醚化合物、及该醚化合物的制造方法。
本发明包括以下的项中记载的实施方式,但不限于这些。
项1.式(1)表示的酰胺化合物。
[化学式2]
(式中,R表示下式:
[化学式3]
(式中,Ra及Rb相同或不同,表示甲基、乙基或氢原子。其中,不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况。
n表示1~5的整数。),
Ba表示具有可被保护的核酸碱基骨架的基团,
G1及G2相同或不同,表示羟基的保护基,
G3相同或不同,表示烷基。)
项2.如项1所述的酰胺化合物,其中,Ra为甲基或乙基,Rb为氢原子。
项3.如项1或2所述的酰胺化合物,其中,G1为以下的基团。
[化学式4]
(式中,R1、R2及R3相同或不同,表示氢或烷氧基。)
项4.如项1~3中任一项所述的酰胺化合物,其中,G2为以下的基团。
[化学式5]
项5.如项1~4中任一项所述的酰胺化合物,其中,G3为异丙基。
项6.含有式(2)表示的多核苷酸骨架的化合物的制造方法,其包括将项1~5中任一项所述的酰胺化合物供于固相合成反应的工序,
[化学式6]
(式中,Ba相同或不同,表示具有可被保护的核酸碱基骨架的基团,
X表示氧原子或硫原子,
m表示正整数。)。
项7.如项6所述的制造方法,其中,含有式(2)的多核苷酸骨架的化合物是在下述工序中生成的化合物,所述工序使四烷基氟化铵与通过使用所述酰胺化合物的固相合成反应生成的具有式(3)表示的寡核苷酸骨架的化合物进行反应,
[化学式7]
(式中,Ba相同或不同,表示具有可被保护的核酸碱基骨架的基团,
X表示氧原子或硫原子,
R相同或不同,表示下式:
[化学式8]
(式中,Ra及Rb相同或不同,表示甲基、乙基或氢原子。其中,不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况。
n表示1~5的整数。),
m表示正整数。)。
项8.如项7所述的制造方法,其中,Ra为甲基或乙基,Rb为氢原子。
项9.如项6~8中任一项所述的制造方法,其中,n=1。
项10.式(4)表示的醚化合物。
[化学式9]
(式中,Ra、Rb及n与项1中定义的相同,Rc表示C1~C6烷基、或苯基。)
项11.如项10所述的醚化合物,其中,Ra为甲基或乙基,Rb为氢原子,Rc为甲基。
项12.如项10或11所述的醚化合物,其中,n=1。
项13.式(7)表示的醚化合物的制造方法,所述制造方法包括下述工序:
工序a:使式(5)表示的化合物与氰化物离子反应的工序,
[化学式10]
(式中,Ra及Rb相同或不同,表示甲基、乙基或氢原子。其中,不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况。);及
工序b:在氧化剂及酸的存在下、在溶剂中使工序a中得到的式(6)表示的3-羟基烷基腈与双(甲硫基甲基)醚反应的工序,
[化学式11]
(式中,Ra及Rb与前述定义相同)
[化学式12]
(式中,Ra及Rb与前述定义相同)。
项14.如项13所述的制造方法,其中,Ra为甲基或乙基,Rb为氢原子。
项15.如项13所述的制造方法,其中,Ra为甲基,Rb为氢原子。
项16.如项15所述的制造方法,其为式(8)表示的化合物的制造方法,
[化学式13]
所述制造方法包括下述工序:
工序A:将3-氨基丁烯腈水解的工序;
工序B:将工序A中得到的氰基丙酮还原而得到3-羟基丁腈的工序;及
工序C:在氧化剂及酸的存在下、在溶剂中使工序B中得到的3-羟基丁腈与双(甲硫基甲基)醚反应的工序。
项17.式(10)表示的化合物的制造方法,所述制造方法的特征在于,使式(9)表示的化合物在氧化剂的存在下与式(4)表示的化合物反应,
[化学式14]
(式中,Ba表示具有可被保护的核酸碱基骨架的化合物,G4表示羟基的保护基。)
[化学式15]
(式中,Ra及Rb相同或不同,表示甲基、乙基或氢原子。其中,不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况。
Rc为C1~C6烷基、或苯基。
n表示1~4的整数。)
[化学式16]
(式中,Ba、Ra、Rb、n及G4与前述定义相同。)。
项18.如项17所述的制造方法,其中,使用四氢吡喃或4-甲基四氢吡喃作为反应溶剂。
项19.项1所述的式(1)的化合物的制造方法,其包括下述工序:
将式(10)的化合物进一步去保护而得到式(11)表示的化合物的工序,
[化学式17]
(式中,Ba、Ra、Rb及n与前述定义相同。);
选择性地保护式(11)的化合物的5’的羟基而得到式(12)表示的化合物的工序,
[化学式18]
(式中,Ba、Ra、Rb及n与前述定义相同,G1表示羟基的保护基。);及
使式(12)的化合物与式(13)表示的亚磷酰二胺(phosphorodiamidite)反应的工序,
[化学式19]
(式中,G2表示羟基的保护基,G3相同或不同,表示烷基。)。
项20.如项19所述的制造方法,其中,G4具有G4-1或G4-2的结构。
[化学式20]
项21.式(10)表示的化合物,
[化学式21]
(式中,Ra及Rb相同或不同,表示甲基、乙基或氢原子。其中,不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况。
n表示1~5的整数,
Ba表示具有可被保护的核酸碱基骨架的基团,
G4表示保护基。)。
项22.式(11)表示的化合物,
[化学式22]
(式中,Ba、Ra、Rb及n与项21中定义的相同。)。
项23.式(12)表示的化合物,
[化学式23]
(式中,Ba、Ra、Rb及n与项21中定义的相同,G1表示羟基的保护基。)。
项24.前述式(1)的酰胺化合物在RNA的制造中的用途。
发明效果
利用本发明的酰胺化合物,能够在固相合成法中以高纯度简便地制造RNA。
具体实施方式
以下,对本发明进行详细说明。
需要说明的是,本说明书中,“含有(comprise)”包括“实质上由……构成(essentially consist of)”的含义、和“仅由……构成(consist of)”的含义。
本发明的酰胺化合物的特征在于由式(1)表示。
[化学式24]
(式中,R表示下式,
[化学式25]
(式中,Ra及Rb相同或不同,表示甲基、乙基或氢原子。其中,不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况。
n表示1~5的整数。)
Ba表示具有可被保护的核酸碱基骨架的基团,
G1及G2相同或不同,表示羟基的保护基,
G3相同或不同,表示烷基。)
Ba中的核酸碱基没有特别限定。作为该核酸碱基,可举出腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶等。另外,核酸碱基可以被取代基取代。作为这样的取代基,例如,可举出卤素原子、酰基、烷基、芳基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、氰基烷基、羟基、羟基甲基、酰基氧基甲基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、及硝基等、以及上述中的2种以上的取代基的组合。
核酸碱基在环外具有氨基的情况下,作为该氨基的保护基,没有特别限定,可使用已知的核酸化学中使用的保护基,作为这样的保护基,例如,可举出甲基、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、及(二甲基氨基)亚甲基等、以及上述中的2种以上的保护基的组合。
Ba更具体而言表示下式中的任一者所示的基团,
[化学式26]
(式中,R4表示氢原子、甲基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、苯基乙酰基、乙酰基或苯甲酰基,
R5表示氢原子、乙酰基、异丁酰基或苯甲酰基,
R6表示氢原子、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、苯基乙酰基、乙酰基或异丁酰基,
R7表示2-氰基乙基,
R8表示氢原子、甲基、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基或4-甲基苯甲酰基,
R9表示二甲基氨基亚甲基。)。
作为G1,只要是能作为保护基发挥功能的基团即可不受限制地使用,可广泛使用酰胺化合物中使用的已知的保护基。
作为G1,优选为以下的基团。
[化学式27]
(式中,R1、R2及R3相同或不同,表示氢或烷氧基。)
R1、R2及R3优选一者为氢、其余两者为烷氧基,作为烷氧基,特别优选甲氧基。
作为G2,只要是能作为保护基发挥功能的基团即可不受限制地使用,可广泛使用酰胺化合物中使用的已知的保护基。作为G2,例如,可举出氢原子、烷基、链烯基、炔基、环烷基、卤代烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基(cyclylalkyl)、羟基烷基、氨基烷基、烷氧基烷基、杂环基链烯基(heterocyclylalkenyl)、杂环基烷基(heterocyclylalkyl)、杂芳基烷基、甲硅烷基、甲硅烷基氧基烷基、单、二或三烷基甲硅烷基、单、二或三烷基甲硅烷基氧基烷基等,它们也可被1个以上吸电子基团取代。
作为G2,优选为被吸电子基团取代的烷基。作为该吸电子基团,例如,可举出氰基、硝基、烷基磺酰基、卤素、芳基磺酰基、三卤代甲基、三烷基氨基等,优选为氰基。
作为G2,特别优选为以下的基团。
[化学式28]
对于G3而言,可以2个G3彼此键合而形成环状结构。作为G3,优选双方为异丙基。
烷基可以是直链状或支链状中的任何,优选为碳原子数1~12的烷基,更优选为碳原子数1~6的烷基。作为烷基,例如,可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、及己基。此处的烷基也包括烷氧基等的烷基部分。
Ra优选为甲基。n优选为1~4的整数,更优选为1~3的整数,进一步优选为1或2,特别优选为1。
另外,本发明的酰胺化合物可以在游离的状态或盐的状态下使用。作为本发明的酰胺化合物的盐,没有特别限定,例如,可举出钠盐、镁盐、钾盐、钙盐、铝盐等与无机碱形成的盐;与甲胺、乙胺、乙醇胺等有机碱形成的盐;与赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸等碱性氨基酸形成的盐及铵盐。该盐可以是酸加成盐,作为这样的盐,具体而言,可举出与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸;甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、苹果酸、酒石酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、乙磺酸等有机酸;及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成的酸加成盐。本发明的酰胺化合物也包括盐、水合物、溶剂合物、多晶型等。
本发明的酰胺化合物可基于日本专利第5157168号公报、日本专利第5554881号公报等中记载的已知的方法、后述的实施例中记载的方法或根据需要而对这些方法加以适当变更的方法来制造。
另外,作为本发明的酰胺化合物的具体例,可举出实施例的表1所示的化合物。
本发明中,也包括式(1)表示的酰胺化合物的制造中间体化合物。作为这样的中间体化合物,可举出式(4)表示的醚化合物。
[化学式29]
(式中,Ra及Rb相同或不同,表示甲基、乙基或氢原子。其中,不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况。
n表示1~5的整数。
Rc为C1~C6烷基、或苯基。)
式(4)表示的醚化合物可通过例如在氧化剂及酸的存在下、在溶剂中使双(烷基硫基甲基)醚或双(苯基硫基甲基)醚与3-羟基-3-烷基丙腈反应来制造。
[化学式30]
双(烷基硫基甲基)醚或双(苯基硫基甲基)醚可通过例如如下式所示的那样使双(氯甲基)醚或双(芳基氧基甲基)醚与对应的烷基硫醇或苯基硫醇反应来得到。作为双(芳基氧基甲基)醚,例如,可举出双(2,4,6-三氯苯基氧基甲基)醚。
[化学式31]
另外,也可基于后述的实施例中记载的方法或根据需要而对这些方法加以适当变更的方法来制造。
对制造作为式(4)的醚化合物的一例的式(7)的化合物的工序a及工序b进行说明。
以下,对工序a进行说明。
作为氰化物离子,例如,可使用来源于氰化钠、氰化钾、氰化铜、三甲基氰硅烷等的氰化物离子。
使用三甲基氰硅烷的情况下,优选添加碱。
作为本反应中的碱,例如,可举出碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物、及氢氧化铵等、以及上述中的2种以上的组合。本发明中,可优选使用氢氧化锂及氢氧化锂一水合物。相对于式(5)表示的环氧化合物而言,碱的量通常为0.01~1当量,优选为0.1~0.3当量。
相对于式(5)表示的化合物而言,氰化物离子的量通常为0.3~2当量,优选为0.6~0.8当量。
本反应的反应温度通常为-20~40℃,优选为0~35℃。本反应的反应时间通常为0.5~24小时,通常优选为1~5小时。
以下,对工序b进行说明。
作为氧化剂,例如,可举出N-氯代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺、N-碘代琥珀酰亚胺等N-卤代琥珀酰亚胺、1,3-二碘-5,5-二甲基乙内酰脲等N-卤代乙内酰脲、及氯、溴、碘等卤素等、以及上述中的2种以上的组合。本发明中,可优选使用N-卤代琥珀酰亚胺,可进一步优选使用N-碘代琥珀酰亚胺。
酸没有特别限定,例如,可举出全氟烷基羧酸及其盐、全氟烷基磺酸及其盐、以及烷基磺酸及其盐、以及上述中的2种以上的组合。作为盐,例如,可举出铜盐及银盐。作为酸,具体而言,可举出甲磺酸、对甲苯磺酸、樟脑磺酸、三氟甲磺酸、及三氟甲磺酸银等、以及上述中的2种以上的组合。本发明中,可优选使用三氟甲磺酸。
作为溶剂,例如,可举出四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、环戊基甲醚、二氧杂环己烷、二氯甲烷、及甲苯等、以及上述中的2种以上的组合。本发明中,可优选使用四氢呋喃。
相对于双(烷基硫基甲基)醚或双(苯基硫基甲基)醚而言,3-羟基烷基腈的量通常为0.5~2.0当量,优选为0.8~1.5当量。相对于双(烷基硫基甲基)醚或双(苯基硫基甲基)醚而言,氧化剂的量通常为0.5~2当量,优选为0.7~1.2当量。相对于双(烷基硫基甲基)醚或双(苯基硫基甲基)醚而言,酸的量通常为0.001~2.0当量,优选为0.01~0.1当量。
本反应的反应温度通常为-80℃~0℃,优选为-50℃~-30℃。本反应的反应时间通常为1~24小时,优选为2~6小时。
对于反应的结束而言,例如,可取样一部分的反应物料,通过GC、TLC、LC等分析方法来确认。反应结束后可向反应物料中添加三乙胺等碱来使反应停止。将反应物料加注至水中,供于有机溶剂萃取、洗涤、浓缩等通常的后处理操作,从而可得到含有式(7)表示的醚化合物的残余物。将该残余物供于蒸馏、柱色谱法等纯化操作,从而可得到高纯度的式(7)表示的醚化合物。
前述方案中,优选Ra为甲基或乙基,Rb为氢原子,Rc为甲基。更优选Ra为甲基,Rb为氢原子,Rc为甲基。
也可通过以下这样的方法来制造。
上述化合物之中,式(8)的化合物可通过包括以下的工序A~C的制造方法来制造。
[化学式32]
工序A:将3-氨基丁烯腈水解的工序;
工序B:将工序A中得到的氰基丙酮还原的工序;及
工序C:在氧化剂及酸的存在下、在溶剂中使工序B中得到的3-羟基丁腈与双(甲硫基甲基)醚反应的工序。
工序A:
[化学式33]
本反应中,通过将3-氨基丁烯腈水解可得到氰基丙酮。
水解可通过例如将3-氨基丁烯腈和酸在水的存在下进行混合来实施。作为酸,可以是含水酸,或者也可以是无水酸,例如,可举出盐酸、硫酸、甲磺酸等。本发明中,可优选使用盐酸。就本反应而言,使用无水酸作为酸时,可通过添加水而在水的存在下实施,另一方面,使用含水酸作为酸时,可不添加水。
相对于3-氨基丁烯腈而言,酸的量通常为1~10当量,优选为1~1.5当量。
本反应的反应温度通常为-20~100℃,优选为0~85℃。本反应的反应时间通常为1~24小时,优选为1~4小时。
工序B:
[化学式34]
作为工序B的还原工序中使用的还原剂,例如,可举出硼氢化钠等金属还原剂。
相对于氰基丙酮而言,还原剂的量通常为0.25~2当量,优选为0.5~1当量。
本反应可在溶剂中进行,作为溶剂,例如,可举出四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、四氢吡喃、4-甲基四氢吡喃、环戊基甲醚、二氧杂环己烷等醚系溶剂、及甲醇、乙醇等醇系溶剂、以及上述溶剂中的2种以上的组合。本发明中,可优选使用四氢呋喃。
另外,本还原工序也可通过使用酵母等的生物学方法来实施。
本反应的反应温度通常为-20~60℃,优选为0~35℃。本反应的反应时间通常为0.5~24小时,通常优选为1~4小时。
工序C:
[化学式35]
工序C的反应可在氧化剂(例如,卤化剂)存在下使双(甲硫基甲基)醚与醇反应而实施。作为该卤化剂,例如,可举出N-氯代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺、N-碘代琥珀酰亚胺等N-卤代琥珀酰亚胺、1,3-二碘-5,5-二甲基乙内酰脲等N-卤代乙内酰脲、氯、溴、碘等卤素等。本发明中,可优选使用N-卤代琥珀酰亚胺,可进一步优选使用N-碘代琥珀酰亚胺。
该反应中使用的酸的种类没有特别限定,例如,可举出全氟烷基羧酸及其盐、全氟烷基磺酸及其盐、以及烷基磺酸及其盐。作为盐,例如,可举出铜盐及银盐。作为酸,具体而言,可举出甲磺酸、对甲苯磺酸、三氟甲磺酸、三氟甲磺酸银等。本发明中,可优选使用三氟甲磺酸。
作为溶剂,例如,可举出四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、四氢吡喃、4-甲基四氢吡喃、环戊基甲醚、二氧杂环己烷、二氯甲烷、甲苯等。本发明中,可优选使用四氢呋喃。
相对于双(甲硫基甲基)醚而言,3-羟基丁腈的量通常为0.5~2.0当量,优选为0.8~1.5当量。相对于双(甲硫基甲基)醚而言,氧化剂的量通常为0.5~2当量,优选为0.7~1.2当量。相对于双(甲硫基甲基)醚而言,酸的量通常为0.001~2.0当量,优选为0.01~0.1当量。
本反应的反应温度通常为-80℃~0℃,优选为-50℃~-30℃。本反应的反应时间通常为1~24小时,优选为2~6小时。
对于反应的结束而言,例如,可取样一部分的反应物料,通过GC、TLC、LC等分析方法来确认。反应结束后可向反应物料中添加三乙胺等碱来使反应停止。将反应物料加注至水中,供于有机溶剂萃取、洗涤、浓缩等通常的后处理操作,由此可得到含有式(8)表示的醚化合物的残余物。将该残余物供于蒸馏、柱色谱法等纯化操作,从而可得到高纯度的式(8)表示的醚化合物。
本发明的酰胺化合物可在固相合成法中作为用于制造RNA的材料使用。通过在固相合成法中使用本发明的酰胺化合物,从而能够以高纯度制造RNA。
本发明的含有下式(2)表示的多核苷酸骨架的化合物的制造方法的特征在于,包括使用上述的酰胺化合物进行固相合成反应的工序。
[化学式36]
(式中,Ba相同或不同,表示具有可被保护的核酸碱基骨架的基团,
X表示氧原子或硫原子,
m表示正整数。)
另外,本发明的制造方法也可包括利用四烷基氟化铵对具有式(3)表示的寡核苷酸骨架的化合物进行处理而得到具有式(2)表示的寡核苷酸骨架的化合物的工序。
[化学式37]
(式中,Ba相同或不同,表示具有可被保护的核酸碱基骨架的基团,
X表示氧原子或硫原子,
R相同或不同,表示下式:
[化学式38]
(式中,Ra及Rb相同或不同,表示甲基、乙基或氢原子。其中,不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况。
n表示1~5的整数。),
m表示正整数。)
式(2)及(3)的Ba及m与式(1)中的Ba及m同样。
m没有特别限定,优选为2~300的整数。
本发明中所谓“含有多核苷酸骨架的化合物”,表示至少包含1个RNA的化合物,优选为仅由RNA构成的化合物。
固相合成反应可按照亚磷酰胺法等已知的方法(例如,日本专利第5157168号公报及日本专利第5554881号公报中记载的方法)来实施。另外,也可使用市售的核酸的自动合成装置等实施。
含有式(2)表示的多核苷酸骨架的化合物的制造方法具体包括下述工序:(A)对担载于固相担载体的第一酰胺化合物的5’位的羟基(例如,式(1)的G1)进行去保护的工序;(B)使工序(A)中生成的去保护后的酰胺化合物与第二酰胺化合物缩合的工序;(C)将工序(B)中的未反应的化合物的5’位的羟基封端(capping)的可选工序;(D)将(B)或者(C)中生成的缩合物的亚磷酸基转化为磷酸基或硫代磷酸基的工序;(E)将工序(D)中得到的化合物从固相担载体切出,对2’位及核酸碱基的羟基进行去保护的工序;(F)对5’位的羟基进行去保护的工序,等等。通过重复(A)~(D)的工序,能够制造含有所希望的链长的多核苷酸骨架的化合物(例如,式(3)的化合物)。
对具有式(3)表示的寡核苷酸骨架的化合物优选利用四烷基氟化铵进行处理,从而能够脱去2’位的保护基,制造具有式(2)表示的寡核苷酸骨架的化合物。该反应的反应条件(反应温度、反应时间、试剂的量等)可采用基于已知方法的条件。
本发明的制造方法中得到的具有式(2)表示的寡核苷酸骨架的化合物可根据需要而进行分离及纯化。通常,可通过使用沉淀、提取及纯化RNA的方法来进行分离。具体而言,可采用通过向反应后的溶液中加入乙醇、异丙基醇等对于RNA而言溶解性低的溶剂来使RNA沉淀的方法、将苯酚/氯仿/异戊醇(例如,苯酚/氯仿/异戊醇=25/24/1)的溶液添加至反应溶液、将RNA提取至水层中的方法。然后,可通过反相柱色谱法、阴离子交换柱色谱法、亲和柱色谱法等已知的高效液相色谱(HPLC)方法等来进行分离、纯化。
通过本发明的制造方法,能够以比以往更高的纯度制造RNA。
本发明酰胺化合物及式(4)表示的醚化合物的制造中的反应条件没有特别限定。式(4)表示的醚化合物也可使用流式反应器合成。
为了减少本发明酰胺化合物中所含的杂质,也可增加在钯等过渡金属催化剂存在下利用氢进行还原的工序、或者利用镁等进行还原的工序。
3-羟基丁腈也可参考文献1)Chemical Communications,2011,47,(12),3613、文献2)Applied Microbiology and Biotechnology,2016,100,(3),1241、文献3)Journal ofOrganic Chemistry,2010,75(21),7092、及文献4)中国专利CN 107602497,通过以乳酸或者乙醛作为原料的下述制造路径来合成。
[化学式39]
式(1)的化合物可通过下述路线1的工序1、2、3及4而从式(9)的化合物制造。
式(9)的化合物中,Ba表示与前述相同的含义,G4典型而言具有下述的G4-1或G4-2的结构。
[化学式40]
上述的化合物可购买市售品,也可通过例如Tetrahedron Letters,2005,46,2961中记载的方法来制造。
工序1(醚化工序)
醚化工序可使式(9)的化合物与式(4)的化合物反应而实施。该反应通常添加氧化剂实施。该工序中使用的氧化剂没有特别限定,优选为选自由N-氯代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺、N-碘代琥珀酰亚胺、碘、1,3-二碘-5,5’-二甲基乙内酰脲、溴及氯组成的组中的至少一种。
该工序中,也可添加酸,使用的酸没有特别限定,优选为选自由全氟烷基羧酸、全氟烷基磺酸、烷基磺酸及它们的盐组成的组中的至少一种。
该工序中使用的反应溶剂没有特别限定,例如,可举出乙醚、THF(四氢呋喃)、2-甲基四氢呋喃、四氢吡喃、4-甲基四氢吡喃、二甲氧基乙烷、二甘醇二甲醚、环戊基甲醚、二氧杂环己烷等醚、或乙腈等腈、甲苯、氯苯、二氯苯等的芳香族烃、二氯甲烷等、以及上述溶剂中的2种以上的组合。作为优选溶剂,可举出乙醚、THF(四氢呋喃)、2-甲基四氢呋喃、四氢吡喃、4-甲基四氢吡喃、二甲氧基乙烷、二甘醇二甲醚、环戊基甲醚、二氧杂环己烷等醚。更优选的溶剂为四氢吡喃、4-甲基四氢吡喃。
该工序中反应时间没有特别限定,例如,为10分钟~12小时,优选为10分钟~6小时。
该工序中反应温度没有特别限定,例如为-80~30℃,优选为-60~10℃。
该工序中前述式(4)表示的醚化合物的浓度也没有特别限定,可适当设定。
该工序中,相对于式(9)表示的化合物的摩尔数而言,前述式(4)表示的醚化合物的摩尔数为例如0.5~2倍,优选为0.8~1.5倍。
该工序中,相对于式(9)表示的化合物的摩尔数而言,前述氧化剂的摩尔数为例如0.5~10倍,优选为0.8~6倍。
工序2(去保护工序)
前述工序1中得到的式(10)的化合物可供于去保护反应而转化为式(11)的化合物。去保护工序可通过已知的方法来实施,典型而言,可在溶剂中使氢氟酸/三乙胺或者氢氟酸/吡啶发挥作用而进行去保护。
工序3(5’羟基的保护工序)
前述工序中得到的式(11)的化合物被供于保护工序,保护基的引入可通过已知的方法来实施,典型而言,可在吡啶中使4,4’-二甲氧基三苯甲基氯与化合物(11)反应来引入保护基,制造化合物(12)。
工序4(酰胺化工序)
该工序可通过使式(13)的化合物与前述工序中得到的式(12)的化合物反应来实施。典型而言,在二异丙基铵盐四氮唑(diisopropyl ammonium tetrazolide)的存在下,使作为式(13)的化合物的2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺进行反应来实施。酰胺化也可基于日本专利第5554881号公报的实施例2~5中记载的方法来进行。
[化学式41]
如以上所说明的,式(9)、(10)、(11)及(12)的化合物可用于制造式(1)的酰胺化合物。这些化合物的优选方案中,n=1。
实施例
以下,为了更详细地说明本发明而举出实施例。但是,本发明不受这些实施例等的任何限定。
本说明书中,使用以下的缩写。
PMM=(((1-氰基丙烷-2-基)氧基)甲氧基)甲基、BMM=(((1-氰基丁烷-2-基)氧基)甲氧基)甲基、TBM=(((1-氰基-2-甲基丙烷-2-基)氧基)甲氧基)甲基、PMM2=((2-氰基丙氧基)甲氧基)甲基、CPM=((1-氰基丙烷-2-基)氧基)甲基;A=腺嘌呤、G=鸟嘌呤、C=胞嘧啶、U=尿嘧啶。
PMM酰胺化物的制造
制造例1
1)3-羟基丁腈的制造
[化学式42]
向氧化丙烯(12.4g,0.21mol)中加入氢氧化锂一水合物(1.8g,42.8mmol),冷却至4℃,缓缓滴入三甲基氰硅烷(15.5g,0.15mol)。滴入结束并经过数十分钟后,内温上升至35℃。直接于冰浴(内温为5℃)中搅拌30分钟,于10~15℃搅拌1小时,然后于室温(25℃)搅拌30分钟。向反应液中加入水(15mL)并于室温搅拌30分钟。然后,实施乙醚(50mL×3次)萃取、饱和盐水洗涤、无水硫酸钠干燥,蒸馏除去溶剂,结果,得到无色透明液状的粗3-羟基丁腈10.6g(收率为84%)。
2)PMM化剂的制造
[化学式43]
将双(甲硫基甲基)醚(32.41g,0.234mol,2.0eq.)溶解于无水THF(300mL)中,加入分子筛4A(32g)搅拌10分钟。将混合物冷却至-50℃,添加三氟甲磺酸(TfOH)(0.88mL,5.85mmol,0.05eq.)和N-碘代琥珀酰亚胺(NIS)(31.5g,0.140mol,1.2eq.),向其中滴入粗3-羟基丁腈(10g,0.117mol),于-50~-45℃左右搅拌2小时。向反应液中加入饱和亚硫酸钠水溶液(150mL)、饱和碳酸氢钠(150mL)及乙酸乙酯(300mL),于0~10℃搅拌10分钟。分液后,用饱和盐水(150mL)洗涤有机层,用无水硫酸镁干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物用硅胶色谱法纯化(己烷/AcOEt=10/1~5/1,二氧化硅800mL),得到为黄色液状物的PMM化剂5.9g(收率为28%)。通过GC/FID分析纯度,结果,纯度为97.2%。
PMM化剂
[化学式44]
淡黄色透明液体
1H-NMR(CDCl3):δ4.93-4.84(m,2H)4.75(s,2H)4.06-4.00(m,1H)2.57(t,2H),2.17(s,3H)1.35(d,3H)
需要说明的是,双(甲硫基甲基)醚的制造方法参见日本特开2016-50203号公报。
制造例2
1)氰基丙酮的制造
[化学式45]
将3-氨基丁烯腈(50g,0.609mol)与6N盐酸(143mL)混合,于浴温60℃搅拌1小时后,放置冷却至室温,通过过滤除去析出物。将反应溶液用二氯甲烷(250mL)萃取后,利用硫酸镁将有机层干燥。用旋转式蒸发器蒸馏除去溶剂后,通过过滤除去析出物,在真空泵中干燥而得到氰基丙酮(41.4g,收率为81%,GC纯度为99.4%)。
2)3-羟基丁腈
[化学式46]
向THF(207mL)中添加硼氢化钠(11.35g,0.30mol),于冰浴中冷却后,滴入氰基丙酮(41.4g,0.50mol)的THF(41mL)溶液(内温为0~8℃,滴入时间为35分钟)。在冰浴下继续搅拌30分钟后,添加水(100mL),用乙酸乙酯(200mL)萃取。对有机层进行饱和盐水处理及用硫酸镁进行干燥后,通过过滤除去析出的固体。利用旋转式蒸发器及真空泵蒸馏除去溶剂而得到黄色液体(38g)。将得到的液体通过减压蒸馏进行纯化(70~80Pa,浴温为70℃),得到3-羟基丁腈(29.5g,收率为69.5%,GC纯度为99.1%)。
3)PMM化剂的制造
[化学式47]
将双甲硫基甲基醚(7.45g,53.9mmol)、分子筛4A(7.5g)及THF(111mL)混合,冷却后(-60~-55℃),添加N-碘代琥珀酰亚胺(NIS)(14.4g,1.19equiv.)、三氟甲磺酸(TfOH)(143μL,0.030equiv.)及3-羟基丁腈(5.0g,1.09equiv.)。于-50~-45℃搅拌4小时后,滴入三乙胺(5.1mL)。将反应容器浸在水浴中而使反应液升温至10℃左右后,向事先制备的10℃的水溶液(硫代硫酸钠五水合物21.8g、碳酸氢钠7.7g和水165mL)中注入反应液。添加乙酸乙酯(50mL),于10~15℃搅拌30分钟,使用硅藻土(7.5g)过滤后分液,用饱和盐水(30mL)洗涤有机层,使用硫酸镁(3.8g)干燥,用旋转式蒸发器浓缩,得到11.5g的粗产物(11.5g,GC纯度为49.8%)。使用硅胶色谱柱(硅胶300mL,己烷/乙酸乙酯=10/1)纯化,得到3-((甲硫基甲氧基)甲氧基)丁腈(淡黄色透明液体,5.32g,收率为56%,纯度为99.5%)。
制造例3~8(2’位保护剂的制造)
与上述的实施例同样地操作制造(R)-PMM化剂、(S)-PMM化剂、BMM化剂、TBM化剂、PMM2化剂。另外,通过下述中记载的方法制造CPM化剂。
制造例3
(R)-PMM化剂(利用Sigma-Aldrich公司(R)-(+)-环氧丙烷合成)
[化学式48]
淡黄色透明液体
1H-NMR(CDCl3):δ4.92(d,1H)4.85(d,1H)4.75(s,2H)4.03(m,1H)2.57(m,2H)2.17(s,3H)1.35(d,3H)
制造例4
(S)-PMM化剂(利用Sigma-Aldrich公司(S)-(-)-环氧丙烷合成)
[化学式49]
淡黄色透明液体
1H-NMR(CDCl3):δ4.92(d,1H)4.85(d,1H)4.75(s,2H)4.03(m,1H)2.57(m,2H)2.17(s,3H)1.34(d,3H)
制造例5
BMM化剂
[化学式50]
淡黄色透明液体
1H-NMR(CDCl3):δ4.95(d,1H)4.84(d,1H)4.76(s,2H)3.79(m,1H)2.60(m,2H)2.17(s,3H)1.70(m,2H)0.97(t,3H)
制造例6
TBM化剂
[化学式51]
淡黄色透明液体
1H-NMR(CDCl3):δ4.94(s,2H)4.77(s,2H)2.58(s,2H)2.16(s,3H)1.42(s,3H)
制造例7
PMM2化剂
[化学式52]
淡黄色透明液体
1H-NMR(CDCl3):δ4.86(s,2H)4.73(s,2H)3.71-3.61(m,2H)2.94-2.87(m,1H)2.18(s,3H)1.35(d,3H)
制造例8
CPM化剂的制造
向2000ml的茄型烧瓶中加入3-羟基丁腈(3-HBN)51.0g(600mmol)、二甲基亚砜640ml(9mol)、乙酸350ml(6.1mol)、乙酸酐600ml(6.3mol)。在氮气中于室温搅拌15分钟后,于油浴(50℃)中加热搅拌12小时。通过GC确认原料3-HBN的消失,放置冷却至室温。将碳酸氢钠1600g(19.5mol)悬浮于离子交换水8L中,缓缓添加上述的反应液。起泡停止后,移至分液漏斗并用乙酸乙酯500ml萃取。用离子交换水1L洗涤有机层,用硫酸镁干燥,减压浓缩,得到91.0g的淡黄褐色油状物。
将该油状物使用硅胶色谱柱进行纯化(使用SiO2 1000ml、正己烷:AcOEt=20:1制作浆料,填充。)。将试样装入色谱柱中,用正己烷:AcOEt=20:1进行洗脱。经1000ml洗脱后,分取200ml(15根)。用正己烷:AcOEt=3:1进行洗脱后,分取200ml(15根)。将目标物质的级分合并而进行减压浓缩,在真空管中进行减压干燥。得到53.28g的无色油状物。
CPM化剂
[化学式53]
淡黄色透明液体
1H-NMR(CDCl3):δ4.72(d,1H)4.64(d,1H)4.15(m,1H)2.56(m,2H)2.20(s,3H)1.31(d,3H)
酰胺化物的制造
制造例9
核酸碱基部分为尿嘧啶的PMM酰胺化物U的制造例如下所示。
[化学式54]
向容器中投入TIPS-U(20.0g)、THF(40ml)及甲苯(60ml),浓缩至74ml进行脱水。将反应液冷却至-50℃,滴入PMM化剂(10.80g)、TfOH(12.48g)、及NIS(12.4g)/THF(26ml)溶液。于-50℃搅拌2小时后,将反应液加注至经冰冷却的碳酸氢钠(7.0g)·硫代硫酸钠(20.0g)/水(130ml)溶液,于室温分液。然后,使用碳酸氢钠(3.5g)·硫代硫酸钠(10.0g)/水(65ml)溶液洗涤。浓缩有机层,得到含有目标化合物的粗产物。精确质量(Exact Mass):613.3,实际质量(Actual Mass):612.3(ESI(-))
[化学式55]
使前述的粗PMM-U-1溶解于丙酮(40mL)中,加入三氟化氢/三乙胺(7.28g)于20℃搅拌18小时。将反应液加注至叔丁基甲醚(200ml)中,搅拌30分钟。过滤反应液,使用叔丁基甲醚(40ml)洗涤滤纸上残留的固体,滤取得到的沉淀物,减压干燥,得到含有目标化合物的粗产物(14.56g)。精确质量:371.1,实际质量:370.2(ESI(-))
[化学式56]
投入前述的粗PMM-U-2(14.5g)、吡啶(72.5ml)、乙腈(29ml)及甲苯(72.5ml),进行冰冷却。向该混合物中加入4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(15.86g),于室温搅拌4小时。然后,加入甲醇(7.2ml)及甲苯(29ml),用5%碳酸氢钠水溶液(43.5ml)洗涤2次,用10%氯化钠水溶液(43.5ml)洗涤1次。然后,浓缩有机层。将浓缩物用硅胶柱色谱法纯化,得到目标物质(21.12g)。精确质量:673.3,实际质量:672.3(ESI(-))
[化学式57]
投入PMM-U-3(20.0g)、乙腈(60ml)、二异丙基铵盐四氮唑(5.88g)、及2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(10.75g),于35℃搅拌4小时。向反应液中加入甲苯(200ml),使用5%碳酸氢钠水溶液(100ml)洗涤1次,使用50%DMF水溶液(200ml)洗涤5次,使用水(100ml)洗涤2次,使用10%氯化钠水溶液(100ml)洗涤1次。然后,浓缩有机层,使用硅胶柱色谱法纯化,得到目标物质(22.72g)。
制造例10
核酸碱基部分为胞嘧啶的PMM酰胺化物C的制造例如下所示。
[化学式58]
向烧瓶中加入TIPS-C(50.0g)、甲苯(250ml),将溶液浓缩至150ml。加入THF(110ml)后,将反应液冷却至-50℃,依次滴入PMM化剂(24.9g)、N-碘代琥珀酰亚胺(28.8g)的THF(65ml)溶液、三氟甲磺酸(21.3g)。于-50℃搅拌30分钟后,将反应液加注至由碳酸氢钠(15.0g)、硫代硫酸钠(42.5g)、水(275ml)、甲苯(170ml)组成的经冰冷却的溶液,于室温分液。然后用碳酸氢钠(9.0g)、硫代硫酸钠(25.0g)及水(165ml)溶液洗涤有机层。进而用氯化钠(25.0g)及水(250ml)溶液洗涤有机层,将有机层浓缩至150ml。实施2次添加THF(200ml)并浓缩至150ml的操作,得到含有目标化合物PMM C-1的粗产物。精确质量:654.3,实际质量:653.4(ESI(-))
[化学式59]
于25℃向前述的粗PMM C-1的THF溶液(150ml)中加入THF(50ml)、三氟化氢/三乙胺(16.8g),搅拌15小时。将反应液冷却至0℃,滴入叔丁基甲醚(200ml)并搅拌1小时。过滤反应液,用叔丁基甲醚(100ml)洗涤过滤物,将得到的固体减压干燥,得到含有目标化合物的粗产物(41.8g)。精确质量:412.2,实际质量:411.2(ESI(-))
[化学式60]
向前述的粗PMM C-2(41.8g)中加入吡啶(200ml),浓缩至120ml。进一步加入吡啶(80ml),浓缩至120ml。添加吡啶(80ml)、甲苯(200ml)、乙腈(80ml),将反应液冷却至0℃。加入4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(38.5g),于20℃搅拌2.5小时。添加甲醇(20ml)搅拌5分钟后,用甲苯(40ml)冲洗进碳酸氢钠(6.0g)、水(120ml)溶液中,于室温分液。然后用碳酸氢钠(6.0g)、水(120ml)溶液洗涤有机层。进而用氯化钠(6.0g)、水(120ml)溶液洗涤有机层,将有机层浓缩至120ml。实施3次添加甲苯(160ml)并浓缩至120ml的操作,得到含有目标化合物的粗产物。实施利用硅胶柱色谱法的纯化(硅胶1kg,庚烷/乙酸乙酯-丙酮的1:1溶液=50/50~20/80),得到目标化合物(44.4g,从TIPS-C的收率为65%)。精确质量:714.3,实际质量:713.3(ESI(-))
[化学式61]
向前述的PMM C-3(44.0g)中加入乙腈(264ml),浓缩至132ml。于25℃加入二异丙基胺四氮唑(12.1g)、2-氰基乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(22.3g),于35℃搅拌2小时。将反应液注入至由甲苯(440ml)、水(220ml)、碳酸氢钠(22g)组成的溶液,于室温分液。将有机层分别用DMF(220ml)及水(220ml)溶液洗涤4次,用水(220ml)洗涤2次,用氯化钠(22g)及水(220ml)溶液洗涤1次。向有机层中添加硫酸钠(22g)并过滤,浓缩至132ml,得到含有目标化合物的粗产物。实施利用硅胶柱色谱法的纯化(硅胶440g,庚烷/丙酮=70/30~40/60),得到目标化合物(44.2g,从PMM C-3的收率为79%)。
制造例11
核酸碱基部分为腺嘌呤的PMM酰胺化物A的制造例如下所示。
[化学式62]
向烧瓶中加入TIPS-A(60.0g)、甲苯(350ml),将溶液浓缩至180ml。加入THF(120ml)后,将反应液冷却至-10℃,添加碘(165.54g)、PMM化剂(28.6g)。于0℃搅拌2小时后,将反应液加注至由碳酸氢钠(33.6g)、硫代硫酸钠(336g)、水(480ml)、甲苯(180ml)组成的经冰冷却的溶液,于室温分液。然后用碳酸氢钠(16.8g)、硫代硫酸钠(168g)及水(240ml)溶液洗涤有机层。进一步用氯化钠(30.0g)及水(300ml)溶液洗涤有机层,将有机层浓缩至180ml,得到含有目标化合物的粗产物。使用硅胶柱色谱法进行纯化,得到目标物质PMM A-1(51.62g)。精确质量:678.3,实际质量:677.4(ESI(-))
[化学式63]
于20℃向前述的PMM A-1(50.0g)的THF溶液(200ml)中加入三氟化氢/三乙胺(13.06g),于20℃~24℃搅拌4小时。将反应液冷却至0℃,添加庚烷(500ml)并搅拌20分钟后,除去上清液330ml。添加庚烷(300ml)搅拌20分钟后,除去上清液300ml。添加庚烷(300ml)搅拌20分钟后,除去上清液300ml。添加叔丁基甲醚(200ml)搅拌20分钟后,除去上清液200ml。升温至室温后,添加乙腈(300ml),使沉淀溶解后,浓缩至150ml。添加乙腈(150ml),浓缩至150ml。添加乙腈(150ml),浓缩至150ml,得到含有目标化合物PMM A-2的粗产物。精确质量:436.2,实际质量:435.2(ESI(-))
[化学式64]
向前述的粗PMM A-2总量中添加吡啶(100ml)、甲苯(350ml),将反应液冷却至0℃。加入4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(29.95g),于20℃~23℃搅拌5小时。添加甲醇(16ml)搅拌5分钟后,用甲苯(64ml)冲洗进5%碳酸氢钠水溶液(100ml)中,于室温分液。然后用5%碳酸氢钠水溶液(100ml)洗涤有机层。进一步用10%氯化钠水溶液(100ml)溶液洗涤有机层,将有机层浓缩至96ml。实施3次添加甲苯(128ml)并浓缩至96ml的操作,得到含有目标化合物的粗产物。实施利用硅胶柱色谱法的纯化,得到目标化合物PMM A-3(40.56g)。精确质量:738.3,实际质量:737.4(ESI(-))
[化学式65]
向前述的PMM A-3(40.0g)中加入乙腈(120ml),于25℃加入二异丙基胺四氮唑(10.8g)、2-氰基乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(19.6g),于36℃~38℃搅拌3小时。将反应液注入至由甲苯(400ml)、5%碳酸氢钠水溶液(200ml)组成的溶液中,于室温分液。将有机层分别用50%DMF水溶液(400ml)洗涤4次,用水(220ml)洗涤2次,用氯化钠水溶液(200ml)洗涤1次。向有机层中添加硫酸钠(20g)进行过滤,浓缩至120ml,得到含有目标化合物的粗产物。实施利用硅胶柱色谱法的纯化,得到目标化合物PMM A酰胺化物(46.35g)。
制造例
制造例9~11的酰胺化物的图谱数据如下所示。
[表1]
制造例12~16
与上述的实施例同样地操作,制造PMM酰胺化物G、BMM酰胺化物U、TBM酰胺化物U、及参考化合物PMM2酰胺化物U、CPM酰胺化物C。
制造的酰胺化物的图谱数据如下所示。
[表2]
[表3]
核酸的制造例1
使用上述制造例中制作的PMM酰胺化物U、BMM酰胺化物U及TBM酰胺化物U,合成下述序列号1的序列表示的尿苷50聚体。
5’-UUUUUUUUUU UUUUUUUUUU UUUUUUUUUU UUUUU UUUUU UUUUUUUUUU-3’(序列号1)
(式中,U表示尿苷单磷酸钠盐)
使用NTS M-4MX-E(NIHON TECHNO SERVICE CO.,LTD.制)作为核酸合成仪,从3’侧朝向5’侧合成。合成中,使用多孔质玻璃作为固相担载体,使用高纯度三氯乙酸甲苯溶液作为解封闭溶液,使用5-苄基巯基-1H-四唑作为缩合剂,使用碘溶液作为氧化剂,使用苯氧基乙酸溶液和N-甲基咪唑溶液作为封端溶液来实施。
固相合成后的寡核苷酸粗产物的纯度的测定通过HPLC来实施将粗产物通过HPLC(波长260nm,色谱柱ACQUITY UPLC Oigonucleotide BHE C18,2.1mm×100mm)分离成各成分,由得到的色谱图的总面积值中的主要产物的面积值算出寡核苷酸的纯度。
实施例1
使用PMM酰胺化物U合成了尿苷50聚体(分子量15246.53),结果,每0.406μmol的OD260为97.48OD,纯度为84.3%。由OD260的值算出每1μmol的收量为9604μg/μmol。结果示于表4。
(OD260是指1mL溶液(pH=7.5)中的每10mm光程的UV260nm的吸光度。一般而言,RNA中1OD=40μg是已知的,由此可利用吸光度来算出RNA的生成量。)
实施例2
同样地使用BMM酰胺化物U合成了尿苷50聚体(分子量15246.53),结果,每0.200μmol的OD260为48.51OD,纯度为72.5%。由OD260的值算出每1μmol的收量为9702μg/μmol。结果示于表4。
实施例3
同样地使用TBM酰胺化物U合成了尿苷50聚体(分子量15246.53),结果,每1.074μmol的OD260为249.74OD,纯度为66.2%。由OD260的值算出每1μmol的收量为9301μg/μmol。结果示于表4。
比较例1
另一方面,使用参考制造例中得到的PMM2酰胺化物U,同样地实施固相合成,制造了尿苷50聚体,结果,每0.406μmol的OD260为100.81OD,纯度为50.4%。由OD260的值算出每1μmol的收量为9932μg/μmol。结果示于表4。
比较例2
使用日本专利第5554881号公报实施例2中记载的尿苷EMM酰胺化物合成了尿苷50聚体(分子量15246.53),结果,每1.028μmol的OD260为245.91OD,纯度为55.8%。由OD260的值算出每1μmol的收量为9568μg/μmol。结果示于表4。
[表4]
如以上的表4所示,可得到尿苷50聚体的纯度良好的结果。
实施例4
核酸碱基部分为腺嘌呤的PMM酰胺化物A的合成中间体PMM A-1的制造方法如下所示。
[化学式66]
向烧瓶中加入TIPS-A(5.00g)、甲苯(25ml),将溶液浓缩至15ml。向烧瓶中加入甲苯(10ml),将溶液浓缩至15ml。添加4-甲基四氢吡喃(10ml)作为溶剂后,将反应液冷却至-10℃,添加碘(13.8g)、PMM化剂(2.38g)。于0℃搅拌1小时后,将反应液加注至由碳酸氢钠(2.8g)、硫代硫酸钠(28g)、水(40ml)、甲苯(25ml)组成的经冰冷却的溶液,于室温分液。通过LC分析有机层,求出目标物质PMM A-1的面积百分率。精确质量:678.3,实际质量:677.4(ESI(-)),结果示于表5。
实施例5
在实施例4的方法中,作为溶剂,使用等量的四氢呋喃(THF)代替4-甲基四氢吡喃,除此以外,通过同样的方法使其反应,得到PMM A-1。结果示于表5。
实施例6
在实施例4的方法中,作为溶剂,使用等量的二氧杂环己烷代替4-甲基四氢吡喃,将搅拌时间设为3.5小时,除此以外,通过同样的方法使其反应,得到PMM A-1。结果示于表5。
[表5]
如以上的表5所示,可得到合成中间体的制造收量良好的结果。
核酸的制造例2
序列(A):5’-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3’(序列号2、3)53mer
前述序列(A)中,P由在以下化学式中被波浪线划分的局部结构表示。
AGCAGAGUAC ACACAGCAUA UACC(序列号2)
GGUAUAUGCU GUGUGUACUC UGCUUC(序列号3)
[化学式67]
使用AKTA Oligopilot100plus(GE Healthcare公司制)作为核酸合成仪,通过亚磷酰胺固相合成法,从3’侧朝向5’侧合成由上述序列(A)组成的寡核苷酸。合成中,使用多孔质玻璃作为固相担载体,使用高纯度三氯乙酸甲苯溶液作为解封闭溶液,使用5-苄基巯基-1H-四唑作为缩合剂,使用碘溶液作为氧化剂,使用苯氧基乙酸溶液和N-甲基咪唑溶液作为封端溶液。
[寡核苷酸收量的测定]
测定前述粗产物的OD260。OD260表示1mL溶液(pH=7.5)中的每10mm光程的UV260nm的吸光度。一般而言,RNA中1OD=40μg是已知的,因此,基于前述OD260的测定值算出了收量。针对实施例7及比较例3,求出相对于实施例7的收量而言的每1μmol的相对收量,其结果示于表6。
实施例7
使用上述PMM酰胺化物U、PMM酰胺化物C、PMM酰胺化物A、PMM酰胺化物G及WO2017/188042中记载的化合物(3),合成由上述序列(A)组成的寡核苷酸,结果,纯度为60.8%。纯度和每1μmol的相对收量的结果示于表6。
比较例3
使用US2012/0035246的实施例2中记载的EMM酰胺化物U、实施例3中记载的EMM酰胺化物C、实施例4中记载的EMM酰胺化物A、实施例5中记载的EMM酰胺化物G及WO2017/188042中记载的化合物(3),合成由上述序列(A)组成的寡核苷酸,结果,纯度为53.0%。纯度和每1μmol的相对收量的结果示于表6。
[表6]
如以上的表6所示,可得到序列(A)的寡核苷酸的纯度良好的结果。
序列表自由文本
序列表的序列号1表示尿苷50聚体的碱基序列。
序列表的序列号2、3表示构成核酸的制造例2中制造的序列的寡核苷酸的碱基序列。
Claims (24)
2.如权利要求1所述的酰胺化合物,其中,Ra为甲基或乙基,Rb为氢原子。
5.如权利要求1~4中任一项所述的酰胺化合物,其中,G3为异丙基。
8.如权利要求7所述的制造方法,其中,Ra为甲基或乙基,Rb为氢原子。
9.如权利要求6~8中任一项所述的制造方法,其中,n=1。
11.如权利要求10所述的醚化合物,其中,Ra为甲基或乙基,Rb为氢原子,Rc为甲基。
12.如权利要求10或11所述的化合物,其中,n=1。
14.如权利要求13所述的制造方法,其中,Ra为甲基或乙基,Rb为氢原子。
15.如权利要求13所述的制造方法,其中,Ra为甲基,Rb为氢原子。
18.如权利要求17所述的制造方法,其中,使用四氢吡喃或4-甲基四氢吡喃作为反应溶剂。
24.所述式(1)的酰胺化合物在RNA的制造中的用途。
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