KR20210004986A - 아미다이트 화합물 및 그 화합물을 사용한 폴리뉴클레오티드의 제조 방법 - Google Patents

아미다이트 화합물 및 그 화합물을 사용한 폴리뉴클레오티드의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

고순도로의 RNA 의 합성이 가능해지는 식 (1) 로 나타내는 아미다이트 화합물 및 그 화합물을 사용한 폴리뉴클레오티드의 제조 방법을 제공한다.
Figure pct00103

(식 중, R 은 (2)
Figure pct00104

(식 중, Ra 및 Rb 는 동일 또는 상이하고 메틸기, 에틸기 또는 수소 원자를 나타낸다. 단 Ra 및 Rb 가 동시에 수소 원자를 나타내는 경우는 없다. n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타낸다.) 를 나타내고, Ba 는 보호되어 있어도 되는 핵산 염기 골격을 갖는 기를 나타내고, G1 및 G2 는 동일 또는 상이하고 수산기의 보호기를 나타내고, G3 은 동일 또는 상이하고 알킬기를 나타낸다.)

Description

아미다이트 화합물 및 그 화합물을 사용한 폴리뉴클레오티드의 제조 방법
본 특허출원은, 일본 특허출원 2018-083148호 (2018년 4월 24일 출원) 및 일본 특허출원 2018-141559호 (2018년 7월 27일 출원) 에 기초하는 파리 조약 상의 우선권 및 이익을 주장하는 것으로, 여기에 인용함으로써, 상기 출원에 기재된 내용의 전체가 본 명세서 중에 받아들여지는 것으로 한다.
본 발명은, 아미다이트 화합물 및 그 화합물을 사용한 폴리뉴클레오티드의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 상기 아미다이트 화합물의 중간체 화합물 및 그 중간체 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
RNA 는, RNA 프로브, 안티센스 RNA, 리보자임, siRNA, 앱타머 등으로서 이용 가능하여, 유용한 소재이다.
RNA 는 고상 합성법 등에 의해 합성 가능하고, 고상 합성법에서는 뉴클레오티드의 포스포로아미다이트 (이하, 「아미다이트」 라고 칭한다) 가 원료로서 사용된다. 이와 같은 아미다이트의 2' 위치의 수산기의 보호기로는, 예를 들어, TBDMS (t-부틸디메틸실릴), TOM (트리이소프로필실릴옥시메틸), ACE (비스(2-아세톡시에톡시)메틸) 등이 알려져 있다. 또한 아미다이트의 2' 위치의 수산기의 보호기로서, 특허문헌 1 및 2 가 개시하는 보호기가 보고되어 있지만, 이들 보호기를 갖는 아미다이트를 사용하는 RNA 의 합성 방법은, 얻어지는 RNA 의 수율이나 순도의 점에서 반드시 만족할 만한 것은 아니다.
일본 특허 제5157168호 일본 특허 제5554881호
본 발명은, 고순도로의 RNA 의 합성이 가능해지는 아미다이트 화합물 및 그 화합물을 사용한 폴리뉴클레오티드의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은, 상기 아미다이트 화합물의 중간체 화합물 및 그 중간체 화합물의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 목적을 달성하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 아미다이트의 2' 위치의 수산기의 보호기로서, 이하의 기를 사용함으로써 고순도로의 RNA 의 합성이 가능해진다는 지견을 얻었다.
[화학식 1]
Figure pct00001
(식 중, Ra 및 Rb 는 동일 또는 상이하고 메틸기, 에틸기 또는 수소 원자를 나타낸다. 단 Ra 및 Rb 가 동시에 수소 원자를 나타내는 경우는 없다.
n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타낸다.)
본 발명은, 이들 지견에 기초하여, 더욱 검토를 거듭하여 완성된 것으로, 이하의 아미다이트 화합물, 그 화합물을 사용한 폴리뉴클레오티드의 제조 방법, 에테르 화합물, 및 그 에테르 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 이하의 항에 기재하는 실시양태를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
항 1. 식 (1) 로 나타내는 아미다이트 화합물.
[화학식 2]
Figure pct00002
(식 중, R 은, 식 :
[화학식 3]
Figure pct00003
(식 중, Ra 및 Rb 는 동일 또는 상이하고 메틸기, 에틸기 또는 수소 원자를 나타낸다. 단 Ra 및 Rb 가 동시에 수소 원자를 나타내는 경우는 없다.
n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타낸다.) 을 나타내고,
Ba 는 보호되어 있어도 되는 핵산 염기 골격을 갖는 기를 나타내고,
G1 및 G2 는 동일 또는 상이하고 수산기의 보호기를 나타내고,
G3 은 동일 또는 상이하고 알킬기를 나타낸다.)
항 2. Ra 가 메틸기 또는 에틸기이고, Rb 가 수소 원자인, 항 1 에 기재된 아미다이트 화합물.
항 3. G1 이 이하의 기인, 항 1 또는 2 에 기재된 아미다이트 화합물.
[화학식 4]
Figure pct00004
(식 중, R1, R2 및 R3 은 동일 또는 상이하고 수소 또는 알콕시기를 나타낸다.)
항 4. G2 가 이하의 기인, 항 1 ∼ 3 중 어느 한 항에 기재된 아미다이트 화합물.
[화학식 5]
Figure pct00005
항 5. G3 이 이소프로필기인, 항 1 ∼ 4 중 어느 한 항에 기재된 아미다이트 화합물.
항 6. 항 1 ∼ 5 중 어느 한 항에 기재된 아미다이트 화합물을 고상 합성 반응에 제공하는 공정을 포함하는, 식 (2) :
[화학식 6]
Figure pct00006
(식 중, Ba 는 동일 또는 상이하고 보호되어 있어도 되는 핵산 염기 골격을 갖는 기를 나타내고,
X 는 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고,
m 은 양의 정수를 나타낸다.)
로 나타내는 폴리뉴클레오티드 골격을 함유하는 화합물의 제조 방법.
항 7. 식 (2) 의 폴리뉴클레오티드 골격을 함유하는 화합물이, 상기 아미다이트 화합물을 사용하는 고상 합성 반응으로 생성하는 식 (3) :
[화학식 7]
Figure pct00007
(식 중, Ba 는 동일 또는 상이하고 보호되어 있어도 되는 핵산 염기 골격을 갖는 기를 나타내고,
X 는 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고,
R 은 동일 또는 상이하고, 식 :
[화학식 8]
Figure pct00008
(식 중, Ra 및 Rb 는 동일 또는 상이하고 메틸기, 에틸기 또는 수소 원자를 나타낸다. 단 Ra 및 Rb 가 동시에 수소 원자를 나타내는 경우는 없다.
n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타낸다.) 을 나타내고,
m 은 양의 정수를 나타낸다.)
로 나타내는 올리고 뉴클레오티드 골격을 갖는 화합물에 테트라알킬암모늄플루오라이드를 반응시키는 공정으로 생성한 화합물인, 항 6 에 기재된 제조 방법.
항 8. Ra 가 메틸기 또는 에틸기이고, Rb 가 수소 원자인, 항 7 에 기재된 제조 방법.
항 9. n = 1 인, 항 6 ∼ 8 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
항 10. 식 (4) 로 나타내는 에테르 화합물.
[화학식 9]
Figure pct00009
(식 중, Ra, Rb 및 n 은, 항 1 에 정의한 바와 같고, Rc 는 C1 ∼ C6 알킬기, 또는 페닐기를 나타낸다.)
항 11. Ra 가 메틸기 또는 에틸기이고, Rb 가 수소 원자이고, Rc 가 메틸인, 항 10 에 기재된 에테르 화합물.
항 12. n = 1 인, 항 10 또는 11 에 기재된 화합물.
항 13. 공정 a : 식 (5) :
[화학식 10]
Figure pct00010
(식 중, Ra 및 Rb 는 동일 또는 상이하고 메틸기, 에틸기 또는 수소 원자를 나타낸다. 단 Ra 및 Rb 가 동시에 수소 원자를 나타내는 경우는 없다.)
로 나타내는 화합물과 시안화물 이온을 반응시키는 공정, 및
공정 b : 산화제 및 산 존재하, 용매 중에서, 공정 a 로 얻어진 식 (6) :
[화학식 11]
Figure pct00011
(식 중, Ra 및 Rb 는 상기 정의한 바와 같다.)
으로 나타내는 3-하이드록시알킬니트릴과 비스(메틸티오메틸)에테르를 반응시키는 공정,
을 포함하는, 식 (7) :
[화학식 12]
Figure pct00012
(식 중, Ra 및 Rb 는 상기 정의한 바와 같다.)
로 나타내는 에테르 화합물의 제조 방법.
항 14. Ra 가 메틸기 또는 에틸기이고, Rb 가 수소 원자인, 항 13 에 기재된 제조 방법.
항 15. Ra 가 메틸기이고, Rb 가 수소 원자인, 항 13 에 기재된 제조 방법.
항 16. 공정 A : 3-아미노크로토노니트릴을 가수 분해하는 공정,
공정 B : 공정 A 로 얻어진 시아노아세톤을 환원하여, 3-하이드록시부탄니트릴을 얻는 공정, 및
공정 C : 산화제 및 산 존재하, 용매 중에서, 공정 B 로 얻어진 3-하이드록시부탄니트릴과 비스(메틸티오메틸)에테르를 반응시키는 공정,
을 포함하는, 식 (8) :
[화학식 13]
Figure pct00013
로 나타내는 항 15 에 기재된 제조 방법.
항 17. 식 (9) :
[화학식 14]
Figure pct00014
(식 중, Ba 는, 보호되어 있어도 되는 핵산 염기 골격을 갖는 화합물을 나타내고, G4 는, 수산기의 보호기를 나타낸다.)
로 나타내는 화합물을, 산화제의 존재하, 식 (4) :
[화학식 15]
Figure pct00015
(식 중, Ra 및 Rb 는 동일 또는 상이하고 메틸기, 에틸기 또는 수소 원자를 나타낸다. 단 Ra 및 Rb 가 동시에 수소 원자를 나타내는 경우는 없다.
Rc 는 C1 ∼ C6 알킬기, 또는 페닐기이다.
n 은, 1 ∼ 4 의 정수를 나타낸다.)
로 나타내는 화합물과, 반응시키는 것을 특징으로 하는, 식 (10) :
[화학식 16]
Figure pct00016
(식 중, Ba, Ra, Rb, n 및 G4 는, 상기의 정의한 바와 같다.)
으로 나타내는 화합물의 제조 방법.
항 18. 반응 용매로서, 테트라하이드로피란 또는 4-메틸테트라하이드로피란을 사용하는, 항 17 에 기재된 제조 방법.
항 19. 식 (10) 의 화합물을 추가로 탈보호하여, 식 (11) :
[화학식 17]
Figure pct00017
(식 중, Ba, Ra, Rb 및 n 은, 상기의 정의한 바와 같다.)
로 나타내는 화합물을 얻는 공정,
식 (11) 의 화합물의 5' 의 수산기를 선택적으로 보호하여, 식 (12) :
[화학식 18]
Figure pct00018
(식 중, Ba, Ra, Rb 및 n 은, 상기의 정의한 바와 같고, G1 은, 수산기의 보호기를 나타낸다.)
로 나타내는 화합물을 얻는 공정,
식 (12) 의 화합물을 식 (13) :
[화학식 19]
Figure pct00019
(식 중, G2 는 수산기의 보호기를 나타내고, G3 은 동일 또는 상이하고 알킬기를 나타낸다.)
으로 나타내는 포스포로디아미다이트와 반응시키는 공정,
을 포함하는, 항 1 에 기재된 식 (1) 의 화합물의 제조 방법.
항 20. G4 는, G4-1 또는 G4-2 구조를 갖는 항 19 에 기재된 제조 방법.
[화학식 20]
Figure pct00020
항 21. 식 (10) :
[화학식 21]
Figure pct00021
(식 중, Ra 및 Rb 는 동일 또는 상이하고 메틸기, 에틸기 또는 수소 원자를 나타낸다. 단 Ra 및 Rb 가 동시에 수소 원자를 나타내는 경우는 없다.
n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타내고,
Ba 는 보호되어 있어도 되는 핵산 염기 골격을 갖는 기를 나타내고,
G4 는, 보호기를 나타낸다.)
으로 나타내는 화합물.
항 22. 식 (11) :
[화학식 22]
Figure pct00022
(식 중, Ba, Ra, Rb 및 n 은, 항 21 에 정의한 바와 같다.)
로 나타내는 화합물.
항 23. 식 (12) :
[화학식 23]
Figure pct00023
(식 중, Ba, Ra, Rb 및 n 은, 항 21 에 정의한 바와 같고, G1 은, 수산기의 보호기를 나타낸다.)
로 나타내는 화합물.
항 24. 상기 식 (1) 의 아미다이트 화합물의 RNA 의 제조에 있어서의 사용.
본 발명의 아미다이트 화합물에 의하면, 고상 합성법에 있어서 RNA 를 높은 순도로 간편하게 제조하는 것이 가능해진다.
이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.
또한, 본 명세서에 있어서 「포함한다 (comprise)」 란, 「본질적으로 이루어진다 (essentially consist of)」 라는 의미와, 「만으로 이루어진다 (consist of)」 라는 의미도 포함한다.
본 발명의 아미다이트 화합물은, 식 (1) 로 나타내는 것을 특징으로 한다.
[화학식 24]
Figure pct00024
(식 중, R 은,
[화학식 25]
Figure pct00025
(식 중, Ra 및 Rb 는 동일 또는 상이하고 메틸기, 에틸기 또는 수소 원자를 나타낸다. 단 Ra 및 Rb 가 동시에 수소 원자를 나타내는 경우는 없다.
n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타낸다.) 를 나타내고,
Ba 는 보호되어 있어도 되는 핵산 염기 골격을 갖는 기를 나타내고,
G1 및 G2 는 동일 또는 상이하고 수산기의 보호기를 나타내고,
G3 은 동일 또는 상이하고 알킬기를 나타낸다.)
Ba 에 있어서의 핵산 염기는, 특별히 한정되지 않는다. 당해 핵산 염기로는, 아데닌, 사이토신, 구아닌, 우라실, 티민, 5-메틸사이토신, 슈도우라실, 1-메틸슈도우라실 등을 들 수 있다. 또한, 핵산 염기는, 치환기에 의해 치환되어 있어도 된다. 그러한 치환기로는, 예를 들어, 할로겐 원자, 아실기, 알킬기, 아릴알킬기, 알콕시기, 알콕시알킬기, 시아노알킬기, 하이드록시기, 하이드록시메틸기, 아실옥시메틸기, 아미노기, 모노알킬아미노기, 디알킬아미노기, 카르복시기, 시아노기, 및 니트로기 등, 그리고 그들의 2 종류 이상의 치환기의 조합을 들 수 있다.
핵산 염기가 고리 외에 아미노기를 갖는 경우, 당해 아미노기의 보호기로는, 특별히 한정되지 않고, 공지된 핵산 화학에서 사용되는 보호기를 사용할 수 있고, 그러한 보호기로는, 예를 들어, 메틸기, 벤조일기, 4-메톡시벤조일기, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기, 이소부티릴기, 페닐아세틸기, 페녹시아세틸기, 4-tert-부틸페녹시아세틸기, 4-이소프로필페녹시아세틸기, 및 (디메틸아미노)메틸렌기 등, 그리고 그들의 2 종류 이상의 보호기의 조합을 들 수 있다.
Ba 는, 보다 구체적으로는 하기 식
[화학식 26]
Figure pct00026
(식 중, R4 는 수소 원자, 메틸기, 페녹시아세틸기, 4-tert-부틸페녹시아세틸기, 4-이소프로필페녹시아세틸기, 페닐아세틸기, 아세틸기 또는 벤조일기를 나타내고,
R5 는 수소 원자, 아세틸기, 이소부티릴기 또는 벤조일기를 나타내고,
R6 은 수소 원자, 페녹시아세틸기, 4-tert-부틸페녹시아세틸기, 4-이소프로필페녹시아세틸기, 페닐아세틸기, 아세틸기 또는 이소부티릴기를 나타내고,
R7 은 2-시아노에틸기를 나타내고,
R8 은 수소 원자, 메틸기, 벤조일기, 4-메톡시벤조일기 또는 4-메틸벤조일기를 나타내고,
R9 는 디메틸아미노메틸렌기를 나타낸다.)
의 어느 것으로 나타내는 기를 나타낸다.
G1 로는, 보호기로서 기능할 수 있는 것이면 특별히 제한 없이 사용할 수 있고, 아미다이트 화합물에서 사용되는 공지된 보호기를 널리 사용할 수 있다.
G1 로는, 바람직하게는, 이하의 기이다.
[화학식 27]
Figure pct00027
(식 중, R1, R2 및 R3 은 동일 또는 상이하고 수소 또는 알콕시기를 나타낸다.)
R1, R2 및 R3 은, 1 개가 수소이고, 나머지 2 개가 알콕시기인 것이 바람직하고, 알콕시기로는 메톡시기가 특히 바람직하다.
G2 로는, 보호기로서 기능할 수 있는 것이면 특별히 제한 없이 사용할 수 있고, 아미다이트 화합물에서 사용되는 공지된 보호기를 널리 사용할 수 있다. G2 로는, 예를 들어, 수소 원자, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 할로알킬기, 아릴기, 헤테로아릴기, 아릴알킬기, 시클로알케닐기, 시클로알킬알킬기, 시클릴알킬기, 하이드록시알킬기, 아미노알킬기, 알콕시알킬기, 헤테로시클릴알케닐기, 헤테로시클릴알킬기, 헤테로아릴알킬기, 실릴기, 실릴옥시알킬기, 모노, 디 또는 트리알킬실릴기, 모노, 디 또는 트리알킬실릴옥시알킬기 등을 들 수 있고, 이들은 1 개 이상의 전자 구인기로 치환되어 있어도 된다.
G2 로는, 바람직하게는, 전자 구인기로 치환된 알킬기이다. 당해 전자 구인기로는, 예를 들어, 시아노기, 니트로기, 알킬술포닐기, 할로겐, 아릴술포닐기, 트리할로메틸기, 트리알킬아미노기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 시아노기이다.
G2 로는, 특히 바람직하게는, 이하의 기이다.
[화학식 28]
Figure pct00028
G3 은, 2 개의 G3 이 서로 결합하여 고리형 구조를 형성하고 있어도 된다. G3 으로는, 양방이 이소프로필기인 것이 바람직하다.
알킬기는, 직사슬형 또는 분기 사슬형 중 어느 것이어도 되고, 바람직하게는 탄소수 1 ∼ 12 의 알킬기, 보다 바람직하게는 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬기이다. 알킬기로는, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 및 헥실을 들 수 있다. 여기서의 알킬기에는, 알콕시기 등의 알킬 부분도 포함된다.
Ra 는, 바람직하게는 메틸이다. n 은, 바람직하게는 1 ∼ 4 의 정수, 보다 바람직하게는 1 ∼ 3 의 정수, 더욱 바람직하게는 1 또는 2, 특히 바람직하게는 1 이다.
또한, 본 발명의 아미다이트 화합물은, 프리한 상태 또는 염 상태로 사용할 수 있다. 본 발명의 아미다이트 화합물의 염으로는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 나트륨염, 마그네슘염, 칼륨염, 칼슘염, 알루미늄염 등의 무기 염기와의 염 ; 메틸아민, 에틸아민, 에탄올아민 등의 유기 염기와의 염 ; 리신, 오르니틴, 아르기닌 등의 염기성 아미노산과의 염 및 암모늄염을 들 수 있다. 당해 염은, 산 부가 염이어도 되고, 이러한 염으로는, 구체적으로는, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 질산, 인산 등의 광산 ; 포름산, 아세트산, 프로피온산, 옥살산, 말론산, 말산, 타르타르산, 푸마르산, 숙신산, 락트산, 말레산, 시트르산, 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산, 에탄술폰산 등의 유기산 ; 및, 아스파르트산, 글루타민산 등의 산성 아미노산과의 산 부가 염을 들 수 있다. 본 발명의 아미다이트 화합물에는, 염, 수화물, 용매화물, 결정 다형 등도 포함된다.
본 발명의 아미다이트 화합물은, 일본 특허 제5157168호, 일본 특허 제5554881호 등에 기재된 공지된 방법이나, 후술하는 실시예에 기재된 방법에 준거하여 또는 필요에 따라 이들 방법에 적절히 변경을 가한 방법에 의해 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 아미다이트 화합물의 구체예로는, 실시예의 표 1 에 나타내는 화합물을 들 수 있다.
본 발명에는, 식 (1) 로 나타내는 아미다이트 화합물의 제조 중간체 화합물도 포함된다. 그러한 중간체 화합물로는, 식 (4) 로 나타내는 에테르 화합물을 들 수 있다.
[화학식 29]
Figure pct00029
(식 중, Ra 및 Rb 는 동일 또는 상이하고 메틸기, 에틸기 또는 수소 원자를 나타낸다. 단 Ra 및 Rb 가 동시에 수소 원자를 나타내는 경우는 없다.
n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타낸다.
Rc 는 C1 ∼ C6 알킬기, 또는 페닐기이다.)
식 (4) 로 나타내는 에테르 화합물은, 예를 들어 비스(알킬티오메틸)에테르 또는 비스(페닐티오메틸)에테르와 3-하이드록시-3-알킬프로판니트릴을, 산화제 및 산 존재하, 용매 중에서 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
[화학식 30]
Figure pct00030
비스(알킬티오메틸)에테르 또는 비스(페닐티오메틸)에테르는, 예를 들어 하기 식에 나타내는 바와 같이, 비스클로로메틸에테르 또는 비스(아릴옥시메틸)에테르와 대응하는 알킬메르캅탄 또는 페닐메르캅탄을 반응시키는 것에 의해 얻을 수 있다. 비스(아릴옥시메틸)에테르로는 예를 들어, 비스(2,4,6-트리클로로페닐옥시메틸)에테르를 들 수 있다.
[화학식 31]
Figure pct00031
또한 후술하는 실시예에 기재된 방법에 준거하여 또는 필요에 따라 이들 방법에 적절히 변경을 가한 방법에 의해서도 제조할 수 있다.
식 (4) 의 에테르 화합물의 일례인 식 (7) 의 화합물을 제조하는 공정 a 및 공정 b 에 대하여, 설명한다.
공정 a 에 대하여 이하 설명한다.
시안화물 이온으로는, 예를 들어, 시안화나트륨, 시안화칼륨, 시안화동, 트리메틸실릴시아니드 등에서 유래하는 시안화물 이온을 사용할 수 있다.
트리메틸실릴시아니드를 사용하는 경우, 염기를 첨가하는 것이 바람직하다.
본 반응에 있어서의 염기로는, 예를 들어, 알칼리 금속 수산화물, 알칼리 토금속 수산화물, 및 수산화암모늄 등, 그리고 이들의 2 종류 이상의 조합을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 수산화리튬 및 수산화리튬 1 수화물이 바람직하게 사용된다. 염기의 양은, 식 (5) 로 나타내는 에폭시 화합물에 대하여, 통상적으로 0.01 ∼ 1 당량이고, 바람직하게는 0.1 ∼ 0.3 당량이다.
시안화물 이온의 양은, 식 (5) 로 나타내는 화합물에 대하여, 통상적으로 0.3 ∼ 2 당량이고, 바람직하게는 0.6 ∼ 0.8 당량이다.
본 반응의 반응 온도는, 통상적으로 -20 ∼ 40 ℃ 이고, 바람직하게는 0 ∼ 35 ℃ 이다. 본 반응의 반응 시간은, 통상적으로 0.5 ∼ 24 시간이고, 바람직하게는 통상적으로 1 ∼ 5 시간이다.
공정 b 에 대하여, 이하 설명한다.
산화제로는, 예를 들어, N-클로로숙신이미드, N-브로모숙신이미드, N-요오드숙신이미드 등의 N-할로겐화숙신이미드, 1,3-디요오드-5,5-디메틸히단토인 등의 N-할로겐화히단토인, 및 염소, 브롬, 요오드 등의 할로겐 등, 그리고 이들의 2 종류 이상의 조합을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, N-할로겐화숙신이미드가 바람직하게 이용되고, N-요오드숙신이미드가 더욱 바람직하게 사용된다.
산은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 퍼플루오로알킬카르복실산 및 그 염, 퍼플루오로알킬술폰산 및 그 염, 그리고 알킬술폰산 및 그 염, 그리고 이들의 2 종류 이상의 조합을 들 수 있다. 염으로는, 예를 들어, 구리염 및 은염을 들 수 있다. 산으로는, 구체적으로는, 메탄술폰산, 파라톨루엔술폰산, 캠퍼 술폰산, 트리플루오로메탄술폰산, 및 트리플루오로메탄술폰산은 등, 그리고 이들의 2 종류 이상의 조합을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 트리플루오로메탄술폰산이 바람직하게 사용된다.
용매로는, 예를 들어, 테트라하이드로푸란, 2-메틸테트라하이드로푸란, 시클로펜틸메틸에테르, 디옥산, 디클로로메탄, 및 톨루엔 등, 그리고 이들의 2 종류 이상의 조합을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 테트라하이드로푸란이 바람직하게 사용된다.
3-하이드록시알킬니트릴의 양은, 비스(알킬티오메틸)에테르 혹은 비스(페닐티오메틸)에테르에 대하여, 통상적으로 0.5 ∼ 2.0 당량이고, 바람직하게는 0.8 ∼ 1.5 당량이다. 산화제의 양은, 비스(알킬티오메틸)에테르 혹은 비스(페닐티오메틸)에테르에 대하여, 통상적으로 0.5 ∼ 2 당량이고, 바람직하게는 0.7 ∼ 1.2 당량이다. 산의 양은, 비스(알킬티오메틸)에테르 혹은 비스(페닐티오메틸)에테르에 대하여, 통상적으로 0.001 ∼ 2.0 당량이고, 바람직하게는 0.01 ∼ 0.1 당량이다.
본 반응의 반응 온도는, 통상적으로 -80 ℃ ∼ 0 ℃ 이고, 바람직하게는 -50 ℃ ∼ -30 ℃ 이다. 본 반응의 반응 시간은, 통상적으로 1 ∼ 24 시간이고, 바람직하게는 2 ∼ 6 시간이다.
반응의 종료는 예를 들어, 반응 매스의 일부를 샘플링하여, GC, TLC, LC 등의 분석법에 의해 확인할 수 있다. 반응 종료 후에는, 반응 매스에 트리에틸아민 등의 염기를 첨가하여 반응을 정지시켜도 된다. 반응 매스를 물에 주가 (注加) 하고, 유기 용매 추출, 세정, 농축 등의 통상적인 후처리 조작에 부여함으로써, 식 (7) 로 나타내는 에테르 화합물을 포함하는 잔류물을 얻을 수 있다. 당해 잔류물을, 증류나 칼럼 크로마토그래피 등의 정제 조작에 부여함으로써, 고순도의 식 (7) 로 나타내는 에테르 화합물을 얻을 수 있다.
상기 양태에 있어서, 바람직하게는, Ra 는, 메틸기 또는 에틸기이고, Rb 는, 수소 원자이고, Rc 는 메틸기이다. 보다 바람직하게는, Ra 는, 메틸기이고, Rb 는, 수소 원자이고, Rc 는 메틸기이다.
이하와 같은 방법으로 제조할 수도 있다.
이들 화합물 중, 식 (8) 의 화합물은, 이하의 공정 A ∼ C 를 포함하는 제조 방법에 의해 제조할 수 있다.
[화학식 32]
Figure pct00032
공정 A : 3-아미노크로토노니트릴을 가수 분해하는 공정,
공정 B : 공정 A 로 얻어진 시아노아세톤을 환원하는 공정, 및
공정 C : 산화제 및 산 존재하, 용매 중에서, 공정 B 로 얻어진 3-하이드록시부탄니트릴과 비스(메틸티오메틸)에테르를 반응시키는 공정.
공정 A :
[화학식 33]
Figure pct00033
본 반응에서는, 3-아미노크로토노니트릴을 가수 분해함으로써 시아노아세톤을 얻을 수 있다.
가수 분해는, 예를 들어, 3-아미노크로토노니트릴과 산을 물의 존재하, 혼합함으로써 실시할 수 있다. 산으로는, 함수산이어도 되고, 또는 무수산이어도 되고, 예를 들어, 염산, 황산, 메탄술폰산 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 염산이 바람직하게 사용된다. 본 반응은, 산으로서 무수산을 사용하는 경우에는, 물을 첨가하는 것에 의한 물의 존재하에서 실시하고, 한편으로, 산으로서 함수산을 사용하는 경우에는, 물을 첨가해도 되고 첨가하지 않아도 된다.
산의 양은, 3-아미노크로토노니트릴에 대하여, 통상적으로 1 ∼ 10 당량이고, 바람직하게는 1 ∼ 1.5 당량이다.
본 반응의 반응 온도는, 통상적으로 -20 ∼ 100 ℃ 이고, 바람직하게는 0 ∼ 85 ℃ 이다. 본 반응의 반응 시간은, 통상적으로 1 ∼ 24 시간이고, 바람직하게는 1 ∼ 4 시간이다.
공정 B :
[화학식 34]
Figure pct00034
공정 B 의 환원 공정에서 사용하는 환원제로는, 예를 들어, 수소화붕소나트륨 등의 금속 환원제를 들 수 있다.
환원제의 양은, 시아노아세톤에 대하여, 통상적으로 0.25 ∼ 2 당량이고, 바람직하게는 0.5 ∼ 1 당량이다.
본 반응은 용매 중에서 실시할 수 있고, 용매로는, 예를 들어, 테트라하이드로푸란, 2-메틸테트라하이드로푸란, 테트라하이드로피란, 4-메틸테트라하이드로피란, 시클로펜틸메틸에테르, 디옥산 등의 에테르계 용매, 및 메탄올, 에탄올 등의 알코올계 용매, 그리고 이들 용매의 2 종류 이상의 조합을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 테트라하이드로푸란이 바람직하게 사용된다.
또한, 본 환원 공정은, 효모를 사용하는 등의 생물학적인 방법에 의해서도 실시할 수 있다.
본 반응의 반응 온도는, 통상적으로 -20 ∼ 60 ℃ 이고, 바람직하게는 0 ∼ 35 ℃ 이다. 본 반응의 반응 시간은, 통상적으로 0.5 ∼ 24 시간이고, 바람직하게는 통상적으로 1 ∼ 4 시간이다.
공정 C :
[화학식 35]
Figure pct00035
공정 C 의 반응은, 산화제 (예를 들어, 할로겐화제) 존재하에 알코올에 비스(메틸티오메틸)에테르를 반응시켜 실시된다. 이러한 할로겐화제로는, 예를 들어, N-클로로숙신이미드, N-브로모숙신이미드, N-요오드숙신이미드 등의 N-할로겐화숙신이미드, 1,3-디요오드-5,5-디메틸히단토인 등의 N-할로겐화히단토인, 염소, 브롬, 요오드 등의 할로겐 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, N-할로겐화숙신이미드가 바람직하게 이용되고, N-요오드숙신이미드가 더욱 바람직하게 사용된다.
이 반응에 있어서 사용하는 산의 종류는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 퍼플루오로알킬카르복실산 및 그 염, 퍼플루오로알킬술폰산 및 그 염, 그리고 알킬술폰산 및 그 염을 들 수 있다. 염으로는, 예를 들어, 구리염 및 은염을 들 수 있다. 산으로는, 구체적으로는, 메탄술폰산, 파라톨루엔술폰산, 트리플루오로메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산은 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 트리플루오로메탄술폰산이 바람직하게 사용된다.
용매로는, 예를 들어, 테트라하이드로푸란, 2-메틸테트라하이드로푸란, 테트라하이드로피란, 4-메틸테트라하이드로피란, 시클로펜틸메틸에테르, 디옥산, 디클로로메탄, 톨루엔 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 테트라하이드로푸란이 바람직하게 사용된다.
3-하이드록시부탄니트릴의 양은, 비스(메틸티오메틸)에테르에 대하여, 통상적으로 0.5 ∼ 2.0 당량이고, 바람직하게는 0.8 ∼ 1.5 당량이다. 산화제의 양은, 비스(메틸티오메틸)에테르에 대하여, 통상적으로 0.5 ∼ 2 당량이고, 바람직하게는 0.7 ∼ 1.2 당량이다. 산의 양은, 비스(메틸티오메틸)에테르에 대하여, 통상적으로 0.001 ∼ 2.0 당량이고, 바람직하게는 0.01 ∼ 0.1 당량이다.
본 반응의 반응 온도는, 통상적으로 -80 ℃ ∼ 0 ℃ 이고, 바람직하게는 -50 ℃ ∼ -30 ℃ 이다. 본 반응의 반응 시간은, 통상적으로 1 ∼ 24 시간이고, 바람직하게는 2 ∼ 6 시간이다.
반응의 종료는 예를 들어, 반응 매스의 일부를 샘플링하여, GC, TLC, LC 등의 분석법에 의해 확인할 수 있다. 반응 종료 후에는, 반응 매스에 트리에틸아민 등의 염기를 첨가하여 반응을 정지시켜도 된다. 반응 매스를 물에 주가하고, 유기 용매 추출, 세정, 농축 등의 통상적인 후처리 조작에 부여함으로써, 식 (8) 로 나타내는 에테르 화합물을 포함하는 잔류물을 얻을 수 있다. 당해 잔류물을, 증류나 칼럼 크로마토그래피 등의 정제 조작에 부여함으로써, 고순도의 식 (8) 로 나타내는 에테르 화합물을 얻을 수 있다.
본 발명의 아미다이트 화합물은, 고상 합성법에 있어서 RNA 를 제조하기 위한 재료로서 사용할 수 있다. 본 발명의 아미다이트 화합물을 고상 합성법에 있어서 사용함으로써, 높은 순도로 RNA 를 제조하는 것이 가능해진다.
본 발명의 하기 식 (2) 로 나타내는 폴리뉴클레오티드 골격을 함유하는 화합물의 제조 방법은, 상기의 아미다이트 화합물을 사용하여 고상 합성 반응을 실시하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
[화학식 36]
Figure pct00036
(식 중, Ba 는 동일 또는 상이하고 보호되어 있어도 되는 핵산 염기 골격을 갖는 기를 나타내고,
X 는 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고,
m 은 양의 정수를 나타낸다.)
또한, 본 발명의 제조 방법은, 식 (3) 으로 나타내는 올리고 뉴클레오티드 골격을 갖는 화합물을 테트라알킬암모늄플루오라이드에 의해 처리하여 식 (2) 로 나타내는 올리고 뉴클레오티드 골격을 갖는 화합물을 얻는 공정을 포함할 수도 있다.
[화학식 37]
Figure pct00037
(식 중, Ba 는 동일 또는 상이하고 보호되어 있어도 되는 핵산 염기 골격을 갖는 기를 나타내고,
X 는 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고,
R 은 동일 또는 상이하고, 식 :
[화학식 38]
Figure pct00038
(식 중, Ra 및 Rb 는, 동일 또는 상이하고, 메틸기, 에틸기 또는 수소 원자를 나타낸다. 단, Ra 및 Rb 가, 동시에 수소 원자를 나타내는 경우는 없다.
n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타낸다.)
을 나타내고,
m 은 양의 정수를 나타낸다.)
식 (2) 및 (3) 의 Ba 및 m 은, 식 (1) 의 것과 동일하다.
m 은, 특별히 제한되지 않고, 바람직하게는 2 ∼ 300 의 정수이다.
본 발명에 있어서 「폴리뉴클레오티드 골격을 함유하는 화합물」 이란, 적어도 1 개의 RNA 를 포함하는 화합물로서, 바람직하게는 RNA 만으로 이루어지는 화합물을 의미한다.
고상 합성 반응은, 포스포로아미다이트법 등의 공지된 방법 (예를 들어, 일본 특허 제5157168호 및 일본 특허 제5554881호에 기재된 방법) 에 따라 실시할 수 있다. 또한, 시판되고 있는 핵산의 자동 합성 장치 등을 사용하여 실시할 수 있다.
식 (2) 로 나타내는 폴리뉴클레오티드 골격을 함유하는 화합물의 제조 방법은, 구체적으로는, (A) 고상 담체에 담지한 제 1 아미다이트 화합물의 5' 위치의 수산기 (예를 들어, 식 (1) 의 G1) 를 탈보호하는 공정, (B) 공정 (A) 에서 생성한 탈보호한 아미다이트 화합물을 제 2 아미다이트 화합물과 축합시키는 공정, (C) 공정 (B) 에 있어서의 미반응의 화합물의 5' 위치의 수산기를 캡핑하는 임의의 공정, (D) (B) 혹은 (C) 에서 생성한 축합물의 아인산기를 인산기 또는 티오인산기로 변환하는 공정, (E) 공정 (D) 에서 얻어진 화합물을 고상 담체로부터 잘라내, 2' 위치 및 핵산 염기의 수산기를 탈보호하는 공정, (F) 5' 위치의 수산기를 탈보호하는 공정 등의 공정을 포함한다. (A) ∼ (D) 의 공정을 반복함으로써, 원하는 사슬 길이의 폴리뉴클레오티드 골격을 함유하는 화합물 (예를 들어, 식 (3) 의 화합물) 을 제조할 수 있다.
식 (3) 으로 나타내는 올리고 뉴클레오티드 골격을 갖는 화합물을, 바람직하게는 테트라알킬암모늄플루오라이드에 의해 처리함으로써, 2' 위치의 보호기가 탈리되어, 식 (2) 로 나타내는 올리고 뉴클레오티드 골격을 갖는 화합물을 제조할 수 있다. 당해 반응의 반응 조건 (반응 온도, 반응 시간, 시약의 양 등) 은 공지된 방법에 따른 조건을 채용할 수 있다.
본 발명의 제조 방법으로 얻어진 식 (2) 로 나타내는 올리고 뉴클레오티드 골격을 갖는 화합물은, 필요에 따라 단리 및 정제를 실시할 수 있다. 통상적으로, RNA 를 침전, 추출 및 정제하는 방법을 사용함으로써, 단리할 수 있다. 구체적으로는, 반응 후의 용액에 에탄올, 이소프로필알코올 등의 RNA 에 대하여 용해성이 낮은 용매를 첨가함으로써 RNA 를 침전시키는 방법이나, 페놀/클로로포름/이소아밀알코올 (예를 들어, 페놀/클로로포름/이소아밀알코올 = 25/24/1) 의 용액을 반응 용액에 첨가하고, RNA 를 수층에 추출시키는 방법이 채용된다. 그 후, 역상 칼럼 크로마토그래피, 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 어피니티 칼럼 크로마토그래피 등의 공지된 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 의 수법 등에 의해 단리, 정제할 수 있다.
본 발명의 제조 방법에 의해, 종래보다 고순도로 RNA 를 제조하는 것이 가능해진다.
본 발명 아미다이트 화합물 및 식 (4) 로 나타내는 에테르 화합물의 제조에 있어서의 반응 조건은 특별히 한정되지 않는다. 식 (4) 로 나타내는 에테르 화합물은 플로우 리액터를 사용하여 합성할 수도 있다.
본 발명 아미다이트 화합물에 포함되는 불순물을 삭감할 목적으로, 팔라듐 등의 천이 금속 촉매 존재하, 수소에 의한 환원 공정 혹은 마그네슘 등에 의한 환원 공정을 추가할 수도 있다.
3-하이드록시부탄니트릴은, 문헌 1) Chemical Communications, 2011, 47, (12), 3613, 문헌 2) Applied Microbiology and Biotechnology, 2016, 100, (3), 1241, 문헌 3) Journal of Organic Chemistry, 2010, 75(21), 7092, 및 문헌 4) 중국 특허 CN 107602497 을 참고로, 락트산 혹은 아세트알데히드를 원료로 하는 하기의 제조 루트에 의해서도 합성할 수 있다.
[화학식 39]
Figure pct00039
식 (1) 의 화합물은, 하기 스킴 1 의 공정 1, 2, 3 및 4 에 의해, 식 (9) 의 화합물로부터 제조할 수 있다.
식 (9) 의 화합물에 있어서, Ba 는, 상기와 동일한 의미를 나타내고, G4 는, 전형적으로는, 하기의 G4-1 또는 G4-2 구조를 갖는다.
[화학식 40]
Figure pct00040
이들 화합물은, 시판품을 구입할 수도 있고, 예를 들어, Tetrahedron Letters, 2005, 46, 2961 에 기재된 방법에 의해 제조할 수도 있다.
공정 1 (에테르화 공정)
에테르화 공정은, 식 (9) 의 화합물을 식 (4) 의 화합물과 반응시켜 실시된다. 이 반응은, 통상적으로, 산화제를 첨가하여 실시된다. 이 공정에 있어서 사용하는 산화제는, 특별히 한정되지 않지만, N-클로로숙신이미드, N-브로모숙신이미드, N-요오드숙신이미드, 요오드, 1,3-디요오드-5,5'-디메틸히단토인, 브롬 및 염소로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개인 것이 바람직하다.
이 공정에 있어서는, 산을 첨가하는 것도 가능하고, 사용하는 산은 특별히 한정되지 않지만, 퍼플루오로알킬카르복실산, 퍼플루오로알킬술폰산, 알킬술폰산 및 그들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개인 것이 바람직하다.
이 공정에 있어서 사용하는 반응 용매는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 디에틸에테르, THF (테트라하이드로푸란), 2-메틸테트라하이드로푸란, 테트라하이드로피란, 4-메틸테트라하이드로피란, 디메톡시에탄, 디글라임, 시클로펜틸메틸에테르, 디옥산 등의 에테르, 또는 아세토니트릴 등의 니트릴, 톨루엔, 클로로벤젠, 디클로로벤젠 등의 방향족 탄화수소, 디클로로메탄 등, 그리고 이들 용매의 2 종류 이상의 조합을 들 수 있다. 바람직한 용매로는, 디에틸에테르, THF (테트라하이드로푸란), 2-메틸테트라하이드로푸란, 테트라하이드로피란, 4-메틸테트라하이드로피란, 디메톡시에탄, 디글라임, 시클로펜틸메틸에테르, 디옥산 등의 에테르를 들 수 있다. 보다 바람직한 용매는, 테트라하이드로피란, 4-메틸테트라하이드로피란을 들 수 있다.
이 공정에 있어서 반응 시간은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 10 분 ∼ 12 시간, 바람직하게는 10 분 ∼ 6 시간이다.
이 공정에 있어서 반응 온도는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 -80 ∼ 30 ℃, 바람직하게는, -60 ∼ 10 ℃ 이다.
이 공정에 있어서 상기 식 (4) 로 나타내는 에테르 화합물의 농도도, 특별히 한정되지 않고, 적절히 설정 가능하다.
이 공정에 있어서 상기 식 (4) 로 나타내는 에테르 화합물의 몰수는, 식 (9) 로 나타내는 화합물의 몰수에 대하여, 예를 들어 0.5 ∼ 2 배, 바람직하게는 0.8 ∼ 1.5 배이다.
이 공정에 있어서 상기 산화제의 몰수는, 식 (9) 로 나타내는 화합물의 몰수에 대하여, 예를 들어 0.5 ∼ 10 배, 바람직하게는 0.8 ∼ 6 배이다.
공정 2 (탈보호 공정)
상기 공정 1 에서 얻어진 식 (10) 의 화합물은, 탈보호 반응에 제공하여 식 (11) 의 화합물로 변환된다. 탈보호 공정은, 공지된 방법으로 실시할 수 있지만, 전형적으로는, 용매 중, 불화수소/트리에틸아민 혹은 불화수소/피리딘을 작용시켜, 탈보호할 수 있다.
공정 3 (5' 수산기의 보호 공정)
상기 공정으로 얻어진 식 (11) 의 화합물은, 보호 공정에 제공되고, 보호기의 도입은, 공지된 방법으로 실시할 수 있지만, 전형적으로는, 피리딘 중, 화합물 (11) 에 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드를 반응시켜 보호기가 도입되고, 화합물 (12) 가 제조된다.
공정 4 (아미다이트화 공정)
이 공정은 상기 공정으로 얻어진 식 (12) 의 화합물에, 식 (13) 의 화합물을 반응시키는 것에 의해 실시된다. 전형적으로는, 디이소프로필암모늄테트라졸리드의 존재하, 식 (13) 의 화합물로서 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트를 반응시켜 실시된다. 아미다이트화는, 일본 특허 제5554881호의 실시예 2 ∼ 5 에 기재된 방법에 준하여 실시할 수 있다.
[화학식 41]
Figure pct00041
이상 설명한 바와 같이, 식 (9), (10), (11) 및 (12) 의 화합물은, 식 (1) 의 아미다이트 화합물의 제조에 사용할 수 있다. 이들 화합물의 바람직한 양태에 있어서는, n = 1 이다.
실시예
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위해서 실시예를 든다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예 등에 전혀 한정되는 것이 아니다.
본 명세서 중, 이하의 약호를 사용한다.
PMM = (((1-시아노프로판-2-일)옥시)메톡시)메틸기, BMM = (((1-시아노부탄-2-일)옥시)메톡시)메틸기, TBM = (((1-시아노-2-메틸프로판-2-일)옥시)메톡시)메틸기, PMM2 = ((2-시아노프로폭시)메톡시)메틸기, CPM = ((1-시아노프로판-2-일)옥시)메틸기 ; A = 아데닌, G = 구아닌, C = 사이토신, U = 우라실.
PMM 아미다이트의 제조
제조예 1
1) 3-하이드록시부탄니트릴의 제조
[화학식 42]
Figure pct00042
산화프로필렌 (12.4 g, 0.21 ㏖) 에 수산화리튬 1 수화물 (1.8 g, 42.8 m㏖) 을 첨가하고, 4 ℃ 로 냉각시키고, 트리메틸실릴시아니드 (15.5 g, 0.15 ㏖) 를 천천히 적하하였다. 적하 완료하고 수십 분 경과 후, 내온이 35 ℃ 까지 상승하였다. 그대로 빙욕 (내온 5 ℃) 으로 30 분간, 10 ∼ 15 ℃ 에서 1 시간, 추가로 실온 (25 ℃) 에서 30 분간 교반하였다. 반응액에 물 (15 ㎖) 을 첨가하고 실온에서 30 분간 교반하였다. 그 후, 디에틸에테르 (50 ㎖ × 3 회) 추출, 포화 식염수 세정, 무수 황산나트륨 건조를 실시하여, 용매를 증류 제거한 결과, 무색 투명 액상의 미정제 3-하이드록시부탄니트릴 10.6 g (수율 84 ％) 을 얻었다.
2) PMM 화제의 제조
[화학식 43]
Figure pct00043
비스(메틸티오메틸)에테르 (32.41 g, 0.234 ㏖, 2.0 eq.) 를 Dry THF (300 ㎖) 에 용해, 몰레큘러 시브스 4A (32 g) 를 첨가하고 10 분간 교반하였다. 혼합물을 -50 ℃ 까지 냉각시키고, 트리플루오로메탄술폰산 (TfOH) (0.88 ㎖, 5.85 m㏖, 0.05 eq.) 과 N-요오드숙신이미드 (NIS) (31.5 g, 0.140 ㏖, 1.2 eq.) 를 첨가, 거기에 미정제 3-하이드록시부탄니트릴 (10 g, 0.117 ㏖) 을 적하하고, -50 ∼ -45 ℃ 부근에서 2 시간 교반하였다. 반응액에 포화 아황산나트륨 수용액 (150 ㎖), 포화 탄산수소나트륨 (150 ㎖) 및 아세트산에틸 (300 ㎖) 을 첨가하고, 0 ∼ 10 ℃ 에서 10 분간 교반하였다. 분액 후, 유기층을 포화 식염수 (150 ㎖) 로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 감압하 용매를 증류 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 정제 (Hexane/AcOEt = 10/1 ∼ 5/1, 실리카 800 ㎖) 하여, 황색 액상물의 PMM 화제를 5.9 g (수율 28 ％) 얻었다. GC/FID 로 순도 분석한 결과, 순도 97.2 ％ 였다.
PMM 화제
[화학식 44]
Figure pct00044
담황색 투명 액체
Figure pct00045
또한, 비스(메틸티오메틸)에테르의 제조 방법은, 일본 공개특허공보 2016-50203호를 참조.
제조예 2
1) 시아노아세톤의 제조
[화학식 45]
Figure pct00046
3-아미노크로토노니트릴 (50 g, 0.609 ㏖) 과 6 N 염산 (143 ㎖) 을 혼합하고, 배스 온도 60 ℃ 에서 1 시간 교반 후, 실온까지 방랭, 석출물을 여과에 의해 제거하였다. 반응 용액을 디클로로메탄 (250 ㎖) 으로 추출 후, 유기층을 황산마그네슘에 의해 건조시켰다. 로터리 이배퍼레이터로 용매를 증류 제거 후, 석출물을 여과에 의해 제외하고, 진공 펌프로 건조시켜 시아노아세톤 (41.4 g, 수율 81 ％, GC 순도 99.4 ％) 을 얻었다.
2) 3-하이드록시부탄니트릴
[화학식 46]
Figure pct00047
THF (207 ㎖) 에 수소화붕소나트륨 (11.35 g, 0.30 ㏖) 을 첨가하고, 빙욕으로 냉각 후, 시아노아세톤 (41.4 g, 0.50 ㏖) 의 THF (41 ㎖) 용액을 적하하였다 (내온 0 ∼ 8 ℃, 적하 시간 35 분). 빙욕하에서 추가로 30 분간 교반 후, 물 (100 ㎖) 을 첨가하고, 아세트산에틸 (200 ㎖) 로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수 처리 및 황산마그네슘으로 건조 후, 석출된 고체를 여과에 의해 제외하였다. 로터리 이배퍼레이터 및 진공 펌프에 의해 용매를 증류 제거하여 황색 액체 (38 g) 를 얻었다. 얻어진 액체를 감압 증류에 의해 정제하여 (70 ∼ 80 ㎩, 배스 온도 70 ℃), 3-하이드록시부탄니트릴 (29.5 g, 수율 69.5 ％, GC 순도 99.1 ％) 을 얻었다.
3) PMM 화제의 제조
[화학식 47]
Figure pct00048
비스메틸티오메틸에테르 (7.45 g, 53.9 m㏖), 몰레큘러 시브스 4A (7.5 g) 및 THF (111 ㎖) 를 혼합하고, 냉각 후 (-60 ∼ -55 ℃), N-요오드숙신이미드 (NIS) (14.4 g, 1.19 equiv.), 트리플루오로메탄술폰산 (TfOH) (143 ㎕, 0.030 equiv.) 및 3-하이드록시부탄니트릴 (5.0 g, 1.09 equiv.) 을 첨가하였다. -50 ∼ -45 ℃ 에서 4 시간 교반 후, 트리에틸아민 (5.1 ㎖) 을 적하하였다. 반응 용기를 수욕에 담그어 반응액을 10 ℃ 부근까지 승온한 후, 사전에 조정해 둔 10 ℃ 의 수용액 (티오황산나트륨 5 수화물 21.8 g 과 중조 7.7 g 과 물 165 ㎖) 에 반응액을 부었다. 아세트산에틸 (50 ㎖) 을 첨가하여, 10 ∼ 15 ℃ 에서 30 분간 교반하고, 셀라이트 (7.5 g) 로 여과 후 분액하여, 유기층을 포화 식염수 (30 ㎖) 로 세정, 황산마그네슘 (3.8 g) 으로 건조, 로터리 이배퍼레이터로 농축하여, 11.5 g 의 미정제 생성물 (11.5 g, GC 순도 49.8 ％) 을 얻었다. 실리카 겔 칼럼 (실리카 겔 300 ㎖, 헥산/아세트산에틸 = 10/1) 을 사용하여 정제하여, 3-((메틸티오메톡시)메톡시)부탄니트릴 (담황색 투명 액체, 5.32 g, 수율 56 ％, 순도 99.5 ％) 을 얻었다.
제조예 3 ∼ 8 (2' 위치 보호화제의 제조)
상기의 실시예와 동일하게 하여 (R)-PMM 화제, (S)-PMM 화제, BMM 화제, TBM 화제, PMM2 화제를 제조하였다. 또한 하기에 기재된 방법에 의해 CPM 화제를 제조하였다.
제조예 3
(R)-PMM 화제 (시그마 알드리치사 (R)-(+)-프로필렌옥사이드로부터 합성)
[화학식 48]
Figure pct00049
담황색 투명 액체
Figure pct00050
제조예 4
(S)-PMM 화제 (시그마 알드리치사 (S)-(-)-프로필렌옥사이드로부터 합성)
[화학식 49]
Figure pct00051
담황색 투명 액체
Figure pct00052
제조예 5
BMM 화제
[화학식 50]
Figure pct00053
담황색 투명 액체
Figure pct00054
제조예 6
TBM 화제
[화학식 51]
Figure pct00055
담황색 투명 액체
Figure pct00056
제조예 7
PMM2 화제
[화학식 52]
Figure pct00057
담황색 투명 액체
Figure pct00058
제조예 8
CPM 화제의 제조
2000 ㎖ 의 가지형 플라스크에 3-하이드록시부탄니트릴 (3-HBN) 51.0 g (600 m㏖), 디메틸술폭시드 640 ㎖ (9 ㏖) 를 넣고, 아세트산 350 ㎖ (6.1 ㏖), 무수 아세트산 600 ㎖ (6.3 ㏖) 를 첨가하였다. 질소 가스 중 실온에서 15 분간 교반한 후, 유욕 (50 ℃) 으로 12 시간 가열 교반하였다. GC 로 원료 3-HBN 의 소실을 확인하고, 실온까지 방랭하였다. 중조 1600 g (19.5 ㏖) 을 이온 교환수 8 ℓ 에 현탁하여, 상기의 반응액을 서서히 첨가하였다. 발포가 가라앉고 나서, 분액 깔때기로 옮겨 아세트산에틸 500 ㎖ 로 추출하였다. 유기층을 이온 교환수 1 ℓ 로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조, 감압 농축하여 91.0 g 의 담황갈색 유상물을 얻었다.
당해 유상물을 실리카 겔 칼럼으로 정제하였다 (SiO2 1000 ㎖, n-Hexane : AcOEt = 20 : 1 로 슬러리를 만들어, 충전하였다). 샘플을 칼럼에 차지하여, n-Hexane : AcOEt = 20 : 1 로 용출하였다. 1000 ㎖ 용출 후, 200 ㎖ 분취 (15 개) 하였다. n-Hexane : AcOEt = 3 : 1 로 용출 후, 200 ㎖ 분취 (15 개) 하였다. 목적물의 프랙션을 맞추어 감압 농축하여, 진공 라인으로 감압 건조시켰다. 53.28 g 의 무색 유상물을 얻었다.
CPM 화제
[화학식 53]
Figure pct00059
담황색 투명 액체
Figure pct00060
아미다이트의 제조
제조예 9
핵산 염기 부분이 우라실인 PMM 아미다이트 U 의 제조예를 이하에 나타낸다.
[화학식 54]
Figure pct00061
TIPS-U (20.0 g), THF (40 ㎖) 및 톨루엔 (60 ㎖) 을 용기에 주입하고, 74 ㎖ 까지 농축하여 탈수하였다. 반응액을 -50 ℃ 까지 냉각시키고, PMM 화제 (10.80 g), TfOH (12.48 g), 및 NIS (12.4 g)/THF (26 ㎖) 용액을 적하하였다. -50 ℃ 에서 2 시간 교반 후, 반응액을 빙냉한 탄산수소나트륨 (7.0 g)·티오황산나트륨 (20.0 g)/물 (130 ㎖) 용액에 주가하고, 실온에서 분액하였다. 그 후, 탄산수소나트륨 (3.5 g)·티오황산나트륨 (10.0 g)/물 (65 ㎖) 용액으로 세정하였다. 유기층을 농축하여, 목적 화합물을 포함하는 미정제 생성물을 얻었다. Exact Mass : 613.3, Actual Mass : 612.3 (ESI(-))
[화학식 55]
Figure pct00062
상기의 미정제 PMM-U-1 을 아세톤 (40 ㎖) 에 용해시키고, 삼불화수소/트리에틸아민 (7.28 g) 을 첨가하여 20 ℃ 에서 18 시간 교반하였다. 반응액을 tert-부틸메틸에테르 (200 ㎖) 에 주가하고, 30 분 교반하였다. 반응액을 여과하고, 여과지 상에 남은 고체를 tert-부틸메틸에테르 (40 ㎖) 로 씻어, 얻어진 침전물을 여과 채취하고, 감압 건조시켜, 목적 화합물을 포함하는 미정제 생성물 (14.56 g) 을 얻었다. Exact Mass : 371.1, Actual Mass : 370.2 (ESI(-))
[화학식 56]
Figure pct00063
상기의 미정제 PMM-U-2 (14.5 g), 피리딘 (72.5 ㎖), 아세토니트릴 (29 ㎖) 및 톨루엔 (72.5 ㎖) 을 주입하고, 빙냉하였다. 그 혼합물에, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (15.86 g) 를 첨가하고, 실온에서 4 시간 교반하였다. 그 후, 메탄올 (7.2 ㎖) 및 톨루엔 (29 ㎖) 을 첨가하고, 5 ％ 탄산수소나트륨 수용액 (43.5 ㎖) 으로 2 회, 10 ％ 염화나트륨 수용액 (43.5 ㎖) 으로 1 회 세정하였다. 그 후, 유기층을 농축하였다. 농축물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여, 목적물 (21.12 g) 을 얻었다. Exact Mass : 673.3, Actual Mass : 672.3 (ESI(-))
[화학식 57]
Figure pct00064
PMM-U-3 (20.0 g), 아세토니트릴 (60 ㎖), 디이소프로필암모늄테트라졸리드 (5.88 g), 및 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트 (10.75 g) 를 주입하고, 35 ℃ 에서 4 시간 교반하였다. 반응액에, 톨루엔 (200 ㎖) 을 첨가하고, 5 ％ 탄산수소나트륨 수용액 (100 ㎖) 으로 1 회, 50 ％ DMF 수용액 (200 ㎖) 으로 5 회, 물 (100 ㎖) 로 2 회, 10 ％ 염화나트륨 수용액 (100 ㎖) 으로 1 회 세정하였다. 그 후, 유기층을 농축하고, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여, 목적물 (22.72 g) 을 얻었다.
제조예 10
핵산 염기 부분이 사이토신인 PMM 아미다이트 C 의 제조예를 이하에 나타낸다.
[화학식 58]
Figure pct00065
TIPS-C (50.0 g), 톨루엔 (250 ㎖) 을 플라스크에 첨가하고, 용액을 150 ㎖ 까지 농축하였다. THF (110 ㎖) 를 첨가한 후, 반응액을 -50 ℃ 까지 냉각시키고, PMM 화제 (24.9 g), N-요오드숙신이미드 (28.8 g) 의 THF (65 ㎖) 용액, 트리플루오로메탄술폰산 (21.3 g) 의 순서로 적하하였다. -50 ℃ 에서 30 분간 교반 후, 반응액을 탄산수소나트륨 (15.0 g), 티오황산나트륨 (42.5 g), 물 (275 ㎖), 톨루엔 (170 ㎖) 으로 이루어지는 빙냉한 용액에 주가하고, 실온에서 분액하였다. 다음으로 유기층을 탄산수소나트륨 (9.0 g), 티오황산나트륨 (25.0 g) 및 물 (165 ㎖) 용액으로 세정하였다. 추가로 유기층을 염화나트륨 (25.0 g) 및 물 (250 ㎖) 용액으로 세정하고, 유기층을 150 ㎖ 까지 농축하였다. THF (200 ㎖) 를 첨가하여 150 ㎖ 까지 농축하는 조작을 2 회 실시하여, 목적 화합물 PMM C-1 을 포함하는 미정제 생성물을 얻었다. Exact Mass : 654.3, Actual Mass : 653.4 (ESI(-))
[화학식 59]
Figure pct00066
상기의 미정제 PMM C-1 의 THF 용액 (150 ㎖) 에 25 ℃ 에서 THF (50 ㎖), 삼불화수소/트리에틸아민 (16.8 g) 을 첨가하고, 15 시간 교반하였다. 반응액을 0 ℃ 로 냉각시키고, tert-부틸메틸에테르 (200 ㎖) 를 적하하여 1 시간 교반하였다. 반응액을 여과하고, 여과상물을 tert-부틸메틸에테르 (100 ㎖) 로 씻고, 얻어진 고체를 감압 건조시켜, 목적 화합물을 포함하는 미정제 생성물 (41.8 g) 을 얻었다. Exact Mass : 412.2, Actual Mass : 411.2 (ESI(-))
[화학식 60]
Figure pct00067
상기의 미정제 PMM C-2 (41.8 g) 에 피리딘 (200 ㎖) 을 첨가하고, 120 ㎖ 까지 농축하였다. 추가로 피리딘 (80 ㎖) 을 첨가하고, 120 ㎖ 까지 농축하였다. 피리딘 (80 ㎖), 톨루엔 (200 ㎖), 아세토니트릴 (80 ㎖) 을 첨가하고 반응액을 0 ℃ 까지 냉각시켰다. 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (38.5 g) 를 첨가하고, 20 ℃ 에서 2.5 시간 교반하였다. 메탄올 (20 ㎖) 을 첨가하여 5 분간 교반한 후, 탄산수소나트륨 (6.0 g), 물 (120 ㎖) 용액에 톨루엔 (40 ㎖) 으로 씻고, 실온에서 분액하였다. 다음으로 유기층을 탄산수소나트륨 (6.0 g), 물 (120 ㎖) 용액으로 세정하였다. 추가로 유기층을 염화나트륨 (6.0 g), 물 (120 ㎖) 용액으로 세정하고, 유기층을 120 ㎖ 까지 농축하였다. 톨루엔 (160 ㎖) 을 첨가하여 120 ㎖ 까지 농축하는 조작을 3 회 실시하여, 목적 화합물을 포함하는 미정제 생성물을 얻었다. 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제 (실리카 겔 1 ㎏, 헵탄/아세트산에틸-아세톤의 1 : 1 용액 = 50/50 ∼ 20/80) 를 실시하여, 목적 화합물 (44.4 g, TIPS-C 로부터의 수율 65 ％) 을 얻었다. Exact Mass : 714.3, Actual Mass : 713.3 (ESI(-))
[화학식 61]
Figure pct00068
상기의 PMM C-3 (44.0 g) 에 아세토니트릴 (264 ㎖) 을 첨가하고, 132 ㎖ 까지 농축하였다. 25 ℃ 에서 디이소프로필아민테트라졸리드 (12.1 g), 2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트 (22.3 g) 를 첨가하고, 35 ℃ 에서 2 시간 교반하였다. 반응액을 톨루엔 (440 ㎖), 물 (220 ㎖), 탄산수소나트륨 (22 g) 으로 이루어지는 용액에 붓고, 실온에서 분액하였다. 유기층을 DMF (220 ㎖) 및 물 (220 ㎖) 용액으로 4 회, 물 (220 ㎖) 로 2 회, 염화나트륨 (22 g) 및 물 (220 ㎖) 용액으로 1 회 각각 세정하였다. 유기층에 황산나트륨 (22 g) 을 첨가하여 여과하고, 132 ㎖ 까지 농축하여 목적 화합물을 포함하는 미정제 생성물을 얻었다. 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제 (실리카 겔 440 g, 헵탄/아세톤 = 70/30 ∼ 40/60) 를 실시하여, 목적 화합물 (44.2 g, PMM C-3 으로부터의 수율 79 ％) 을 얻었다.
제조예 11
핵산 염기 부분이 아데닌인 PMM 아미다이트 A 의 제조예를 이하에 나타낸다.
[화학식 62]
Figure pct00069
TIPS-A (60.0 g), 톨루엔 (350 ㎖) 을 플라스크에 첨가하고, 용액을 180 ㎖ 까지 농축하였다. THF (120 ㎖) 를 첨가한 후, 반응액을 -10 ℃ 까지 냉각시키고, 요오드 (165.54 g), PMM 화제 (28.6 g) 를 첨가하였다. 0 ℃ 에서 2 시간 교반 후, 반응액을 탄산수소나트륨 (33.6 g), 티오황산나트륨 (336 g), 물 (480 ㎖), 톨루엔 (180 ㎖) 으로 이루어지는 빙냉한 용액에 주가하고, 실온에서 분액하였다. 다음으로 유기층을 탄산수소나트륨 (16.8 g), 티오황산나트륨 (168 g) 및 물 (240 ㎖) 용액으로 세정하였다. 추가로 유기층을 염화나트륨 (30.0 g) 및 물 (300 ㎖) 용액으로 세정하고, 유기층을 180 ㎖ 까지 농축하여, 목적 화합물을 포함하는 미정제 생성물을 얻었다. 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여, 목적물 PMM A-1 (51.62 g) 을 얻었다. Exact Mass : 678.3, Actual Mass : 677.4 (ESI(-))
[화학식 63]
Figure pct00070
상기의 PMM A-1 (50.0 g) 의 THF 용액 (200 ㎖) 에 20 ℃ 에서, 삼불화수소/트리에틸아민 (13.06 g) 을 첨가하고, 20 ℃ ∼ 24 ℃ 에서 4 시간 교반하였다. 반응액을 0 ℃ 로 냉각시키고, 헵탄 (500 ㎖) 을 첨가하여 20 분간 교반 후, 상청을 330 ㎖ 제거하였다. 헵탄 (300 ㎖) 을 첨가하여 20 분간 교반 후, 상청을 300 ㎖ 제거하였다. 헵탄 (300 ㎖) 을 첨가하여 20 분간 교반 후, 상청을 300 ㎖ 제거하였다. tert-부틸메틸에테르 (200 ㎖) 를 첨가하여 20 분간 교반 후, 상청을 200 ㎖ 제거하였다. 실온까지 승온 후, 아세토니트릴 (300 ㎖) 을 첨가하고, 침전을 용해시킨 후, 150 ㎖ 까지 농축하였다. 아세토니트릴 (150 ㎖) 을 첨가하여, 150 ㎖ 까지 농축하였다. 아세토니트릴 (150 ㎖) 을 첨가하고, 150 ㎖ 까지 농축하여, 목적 화합물 PMM A-2 를 포함하는 미정제 생성물을 얻었다. Exact Mass : 436.2, Actual Mass : 435.2 (ESI(-))
[화학식 64]
Figure pct00071
상기의 미정제 PMM A-2 전체량에 피리딘 (100 ㎖), 톨루엔 (350 ㎖) 을 첨가하여 반응액을 0 ℃ 까지 냉각시켰다. 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (29.95 g) 를 첨가하고, 20 ℃ ∼ 23 ℃ 에서 5 시간 교반하였다. 메탄올 (16 ㎖) 을 첨가하여 5 분간 교반한 후, 톨루엔 (64 ㎖) 으로 씻고, 5 ％ 탄산수소나트륨 수용액 (100 ㎖) 과 실온에서 분액하였다. 다음으로 유기층을 5 ％ 탄산수소나트륨 수용액 (100 ㎖) 으로 세정하였다. 추가로 유기층을 10 ％ 염화나트륨 수용액 (100 ㎖) 용액으로 세정하고, 유기층을 96 ㎖ 까지 농축하였다. 톨루엔 (128 ㎖) 을 첨가하여 96 ㎖ 까지 농축하는 조작을 3 회 실시하여, 목적 화합물을 포함하는 미정제 생성물을 얻었다. 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제를 실시하여, 목적 화합물 PMM A-3 (40.56 g) 을 얻었다. Exact Mass : 738.3, Actual Mass : 737.4 (ESI(-))
[화학식 65]
Figure pct00072
상기의 PMM A-3 (40.0 g) 에 아세토니트릴 (120 ㎖), 25 ℃ 에서 디이소프로필아민테트라졸리드 (10.8 g), 2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트 (19.6 g) 를 첨가하고, 36 ℃ ∼ 38 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 반응액을 톨루엔 (400 ㎖), 5 ％ 탄산수소나트륨 수용액 (200 ㎖) 으로 이루어지는 용액에 붓고, 실온에서 분액하였다. 유기층을 50 ％ DMF 수용액 (400 ㎖) 용액으로 4 회, 물 (220 ㎖) 로 2 회, 염화나트륨 수용액 (200 ㎖) 으로 1 회 각각 세정하였다. 유기층에 황산나트륨 (20 g) 을 첨가하여 여과하고, 120 ㎖ 까지 농축하여 목적 화합물을 포함하는 미정제 생성물을 얻었다. 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제를 실시하여, 목적 화합물 PMM A 아미다이트 (46.35 g) 를 얻었다.
제조예
제조예 9 ∼ 11 의 아미다이트의 스펙트럼 데이터를 이하에 나타낸다.
Figure pct00073
제조예 12 ∼ 16
상기의 실시예와 동일하게 하여 PMM 아미다이트 G, BMM 아미다이트 U, TBM 아미다이트 U, 및 참고 화합물인 PMM2 아미다이트 U, CPM 아미다이트 C 를 제조하였다.
제조한 아미다이트의 스펙트럼 데이터를 이하에 나타낸다.
Figure pct00074
Figure pct00075
핵산의 제조예 1
상기 제조예에서 제작한 PMM 아미다이트 U, BMM 아미다이트 U 및 TBM 아미다이트 U 를 사용하여, 하기 서열 번호 1 의 서열로 나타나는 우리딘 50 량체를 합성하였다.
5'-UUUUUUUUUU UUUUUUUUUU UUUUUUUUUU UUUUUUUUUU UUUUUUUUUU-3' (서열 번호 1)
(식 중, U 는 우리딘모노인산나트륨염을 의미한다)
핵산 합성기로서 NTS M-4MX-E (니혼 테크노 서비스 주식회사 제조) 를 사용하여 3' 측으로부터 5' 측을 향하여 합성하였다. 합성에는 고상 담체로서 다공질 유리를 사용하고, 디블로킹 용액으로서 고순도 트리클로로아세트산톨루엔 용액을 사용하고, 축합제로서 5-벤질메르캅토-1H-테트라졸을 사용하고, 산화제로서 요오드 용액을 사용하고, 캡핑 용액으로서 페녹시아세트산 용액과 N-메틸이미다졸 용액을 사용하여 실시하였다.
고상 합성 후의 올리고 뉴클레오티드 미정제 생성물의 순도의 측정은, HPLC 에 의해 실시하였다. 미정제 생성물을 HPLC (파장 260 ㎚, 칼럼 ACQUITY UPLC Oligonucleotide BHE C18, 2.1 ㎜ × 100 ㎜) 에 의해 각 성분으로 분리하고, 얻어진 크로마토그램의 총면적치에 있어서의 주생성물의 면적치로부터 올리고 뉴클레오티드의 순도를 산출하였다.
실시예 1
PMM 아미다이트 U 를 사용하여 우리딘 50 량체 (분자량 15246.53) 를 합성한 결과, 0.406 μ㏖ 당의 OD260 은 97.48 OD 이고, 순도는 84.3 ％ 였다. OD260 의 값으로부터, 1 μ㏖ 당의 수량은 9604 ㎍/μ㏖ 로 산출되었다. 결과를 표 4 에 나타낸다.
(OD260 이란 1 ㎖ 용액 (pH = 7.5) 에 있어서의 10 ㎜ 광로 길이 당의 UV 260㎚ 의 흡광도이다. 일반적으로 RNA 에서는 1 OD = 40 ㎍ 인 것이 알려져 있기 때문에, 흡광도부터 RNA 의 생성량을 산출할 수 있다.)
실시예 2
동일하게 BMM 아미다이트 U 를 사용하여 우리딘 50 량체 (분자량 15246.53) 를 합성한 결과, 0.200 μ㏖ 당의 OD260 은 48.51 OD 이고, 순도는 72.5 ％ 였다. OD260 의 값으로부터, 1 μ㏖ 당의 수량은 9702 ㎍/μ㏖ 로 산출되었다. 결과를 표 4 에 나타낸다.
실시예 3
동일하게 TBM 아미다이트 U 를 사용하여 우리딘 50 량체 (분자량 15246.53) 를 합성한 결과, 1.074 μ㏖ 당의 OD260 은 249.74 OD 이고, 순도는 66.2 ％ 였다. OD260 의 값으로부터, 1 μ㏖ 당의 수량은 9301 ㎍/μ㏖ 로 산출되었다. 결과를 표 4 에 나타낸다.
비교예 1
한편, 참고 제조예에서 얻어진 PMM2 아미다이트 U 를 사용하여, 동일하게 고상 합성을 실시하여, 우리딘 50 량체를 제조한 결과, 0.406 μ㏖ 당의 OD260 은 100.81 OD 이고, 순도는 50.4 ％ 였다. OD260 의 값으로부터, 1 μ㏖ 당의 수량은 9932 ㎍/μ㏖ 로 산출되었다. 결과를 표 4 에 나타낸다.
비교예 2
일본 특허 제5554881호 실시예 2 에 기재되어 있는 우리딘 EMM 아미다이트를 사용하여 우리딘 50 량체 (분자량 15246.53) 를 합성한 결과, 1.028 μ㏖ 당의 OD260 은 245.91 OD 이고, 순도는 55.8 ％ 였다. OD260 의 값으로부터, 1 μ㏖ 당의 수량은 9568 ㎍/μ㏖ 로 산출되었다. 결과를 표 4 에 나타낸다.
Figure pct00076
이상의 표 4 에 나타내는 바와 같이, 우리딘 50 량체의 순도의 양호한 결과를 얻을 수 있다.
실시예 4
핵산 염기 부분이 아데닌인 PMM 아미다이트 A 의 합성 중간체 PMM A-1 의 제조 방법을 이하에 나타낸다.
[화학식 66]
Figure pct00077
TIPS-A (5.00 g), 톨루엔 (25 ㎖) 을 플라스크에 첨가하고, 용액을 15 ㎖ 까지 농축하였다. 톨루엔 (10 ㎖) 을 플라스크에 첨가하고, 용액을 15 ㎖ 까지 농축하였다. 4-메틸테트라하이드로피란 (10 ㎖) 을 용매로서 첨가한 후, 반응액을 -10 ℃ 까지 냉각시키고, 요오드 (13.8 g), PMM 화제 (2.38 g) 를 첨가하였다. 0 ℃ 에서 1 시간 교반 후, 반응액을, 탄산수소나트륨 (2.8 g), 티오황산나트륨 (28 g), 물 (40 ㎖), 톨루엔 (25 ㎖) 으로 이루어지는 빙냉한 용액에 주가하고, 실온에서 분액하였다. 유기층을 LC 로 분석하여, 목적물인 PMM A-1 의 면적 백분율을 구하였다. Exact Mass : 678.3, Actual Mass : 677.4 (ESI(-)) 결과를 표 5 에 나타낸다.
실시예 5
실시예 4 의 방법에 있어서, 용매로서, 4-메틸테트라하이드로피란 대신에 동량의 테트라하이드로푸란 (THF) 을 사용하는 것 이외에는, 동일한 방법으로 반응시켜, PMM A-1 을 얻었다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
실시예 6
실시예 4 의 방법에 있어서, 용매로서, 4-메틸테트라하이드로피란 대신에 동량의 디옥산을 이용하여, 교반 시간을 3.5 시간으로 하는 것 이외에는, 동일한 방법으로 반응시켜, PMM A-1 을 얻었다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
Figure pct00078
이상의 표 5 에 나타내는 바와 같이, 합성 중간체의 제조 수량의 양호한 결과를 얻을 수 있다.
핵산의 제조예 2
서열 (A) : 5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3' (서열 번호 2, 3) 53 mer
상기 서열 (A) 에 있어서, P 는, 이하의 화학식에 있어서 파선으로 단락 지어지는 부분 구조로 나타난다.
AGCAGAGUAC ACACAGCAUA UACC (서열 번호 2)
GGUAUAUGCU GUGUGUACUC UGCUUC (서열 번호 3)
[화학식 67]
Figure pct00079
핵산 합성기로서 AKTA Oligopilot100plus (GE 헬스케어사 제조) 를 사용하여, 포스포로아미다이트 고상 합성법에 의해, 상기 서열 (A) 로 이루어지는 올리고 뉴클레오티드를 3' 측으로부터 5' 측을 향하여 합성하였다. 합성에는 고상 담체로서 다공질 유리를 사용하고, 디블로킹 용액으로서 고순도 트리클로로아세트산 톨루엔 용액을 사용하고, 축합제로서 5-벤질메르캅토-1H-테트라졸을 사용하고, 산화제로서 요오드 용액을 사용하고, 캡핑 용액으로서 페녹시아세트산 용액과 N-메틸이미다졸 용액을 사용하였다.
[올리고 뉴클레오티드 수량의 측정]
상기 미정제 생성물의 OD260 을 측정하였다. OD260 이란 1 ㎖ 용액 (pH = 7.5) 에 있어서의 10 ㎜ 광로 길이 당의 UV 260 ㎚ 의 흡광도를 나타낸다. 일반적으로 RNA 에서는 1 OD = 40 ㎍ 인 것이 알려져 있는 것으로부터, 상기 OD260 의 측정치에 기초하여, 수량을 산출하였다. 실시예 7 및 비교예 3 에 대해서는 실시예 7 의 수량에 대한 1 μ㏖ 당의 상대 수량을 구하고, 그 결과를 표 6 에 나타냈다.
실시예 7
상기 PMM 아미다이트 U, PMM 아미다이트 C, PMM 아미다이트 A, PMM 아미다이트 G 및 WO2017/188042 에 기재된 화합물 (3) 을 사용하여, 상기 서열 (A) 로 이루어지는 올리고 뉴클레오티드를 합성한 결과, 순도는 60.8 ％ 였다. 순도와 1 μ㏖ 당의 상대 수량의 결과를 표 6 에 나타낸다.
비교예 3
US2012/0035246 의 실시예 2 에 기재된 EMM 아미다이트 U, 실시예 3 에 기재된 EMM 아미다이트 C, 실시예 4 에 기재된 EMM 아미다이트 A, 실시예 5 에 기재된 EMM 아미다이트 G 및 WO2017/188042 에 기재된 화합물 (3) 을 사용하여, 상기 서열 (A) 로 이루어지는 올리고 뉴클레오티드를 합성한 결과, 순도는 53.0 ％ 였다. 순도와 1 μ㏖ 당의 상대 수량의 결과를 표 6 에 나타낸다.
Figure pct00080
이상의 표 6 에 나타내는 바와 같이, 서열 (A) 의 올리고 뉴클레오티드의 순도의 양호한 결과를 얻을 수 있다.
서열표 프리 텍스트
서열표의 서열 번호 1 은, 우리딘 50 량체의 염기 서열을 나타낸다.
서열표의 서열 번호 2, 3 은, 핵산의 제조예 2 에서 제조한 서열을 구성하는 올리고 뉴클레오티드의 염기 서열을 나타낸다.
<110> SUMITOMO CHEMICAL CO., LTD. <120> AMIDITE COMPOUND AND METHOD FOR PRODUCING POLYNUCLEOTIDE USING COMPOUND THEREOF <130> S43022WO01 <150> JP 2018-083148 <151> 2018-04-24 <150> JP 2018-141559 <151> 2018-07-27 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> uridine 50-mer <400> 1 uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 50 <210> 2 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 agcagaguac acacagcaua uacc 24 <210> 3 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 gguauaugcu guguguacuc ugcuuc 26

Claims (24)

  1. 식 (1) 로 나타내는 아미다이트 화합물.
    Figure pct00081

    (식 중, R 은, 식 :
    Figure pct00082

    (식 중, Ra 및 Rb 는 동일 또는 상이하고 메틸기, 에틸기 또는 수소 원자를 나타낸다. 단 Ra 및 Rb 가 동시에 수소 원자를 나타내는 경우는 없다.
    n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타낸다.) 을 나타내고,
    Ba 는 보호되어 있어도 되는 핵산 염기 골격을 갖는 기를 나타내고,
    G1 및 G2 는 동일 또는 상이하고 수산기의 보호기를 나타내고,
    G3 은 동일 또는 상이하고 알킬기를 나타낸다.)
  2. 제 1 항에 있어서,
    Ra 가 메틸기 또는 에틸기이고, Rb 가 수소 원자인, 아미다이트 화합물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    G1 이 이하의 기인, 아미다이트 화합물.
    Figure pct00083

    (식 중, R1, R2 및 R3 은 동일 또는 상이하고 수소 또는 알콕시기를 나타낸다.)
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    G2 가 이하의 기인, 아미다이트 화합물.
    Figure pct00084
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    G3 이 이소프로필기인, 아미다이트 화합물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 아미다이트 화합물을 고상 합성 반응에 제공하는 공정을 포함하는, 식 (2) :
    Figure pct00085

    (식 중, Ba 는 동일 또는 상이하고 보호되어 있어도 되는 핵산 염기 골격을 갖는 기를 나타내고,
    X 는 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고,
    m 은 양의 정수를 나타낸다.)
    로 나타내는 폴리뉴클레오티드 골격을 함유하는 화합물의 제조 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    식 (2) 의 폴리뉴클레오티드 골격을 함유하는 화합물이, 상기 아미다이트 화합물을 사용하는 고상 합성 반응으로 생성하는 식 (3) :
    Figure pct00086

    (식 중, Ba 는 동일 또는 상이하고 보호되어 있어도 되는 핵산 염기 골격을 갖는 기를 나타내고,
    X 는 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고,
    R 은 동일 또는 상이하고, 식 :
    Figure pct00087

    (식 중, Ra 및 Rb 는 동일 또는 상이하고 메틸기, 에틸기 또는 수소 원자를 나타낸다. 단 Ra 및 Rb 가 동시에 수소 원자를 나타내는 경우는 없다.
    n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타낸다.) 을 나타내고,
    m 은 양의 정수를 나타낸다.)
    으로 나타내는 올리고 뉴클레오티드 골격을 갖는 화합물에 테트라알킬암모늄 플루오라이드를 반응시키는 공정으로 생성한 화합물인, 제조 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    Ra 가 메틸기 또는 에틸기이고, Rb 가 수소 원자인, 제조 방법.
  9. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    n = 1 인, 제조 방법.
  10. 식 (4) 로 나타내는 에테르 화합물.
    Figure pct00088

    (식 중, Ra, Rb 및 n 은, 제 1 항에 정의한 바와 같고, Rc 는 C1 ∼ C6 알킬기, 또는 페닐기를 나타낸다.)
  11. 제 10 항에 있어서,
    Ra 가 메틸기 또는 에틸기이고, Rb 가 수소 원자이고, Rc 가 메틸인, 에테르 화합물.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
    n = 1 인, 화합물.
  13. 공정 a : 식 (5) :
    Figure pct00089

    (식 중, Ra 및 Rb 는 동일 또는 상이하고 메틸기, 에틸기 또는 수소 원자를 나타낸다. 단 Ra 및 Rb 가 동시에 수소 원자를 나타내는 경우는 없다.)
    로 나타내는 화합물과 시안화물 이온을 반응시키는 공정, 및
    공정 b : 산화제 및 산 존재하, 용매 중에서, 공정 a 로 얻어진 식 (6) :
    Figure pct00090

    (식 중, Ra 및 Rb 는 상기 정의한 바와 같다.)
    으로 나타내는 3-하이드록시알킬니트릴과 비스(메틸티오메틸)에테르를 반응시키는 공정,
    을 포함하는, 식 (7) :
    Figure pct00091

    (식 중, Ra 및 Rb 는 상기 정의한 바와 같다.)
    로 나타내는 에테르 화합물의 제조 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    Ra 가 메틸기 또는 에틸기이고, Rb 가 수소 원자인, 제조 방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    Ra 가 메틸기이고, Rb 가 수소 원자인, 제조 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    공정 A : 3-아미노크로토노니트릴을 가수 분해하는 공정,
    공정 B : 공정 A 로 얻어진 시아노아세톤을 환원하여, 3-하이드록시부탄니트릴을 얻는 공정, 및
    공정 C : 산화제 및 산 존재하, 용매 중에서, 공정 B 로 얻어진 3-하이드록시부탄니트릴과 비스(메틸티오메틸)에테르를 반응시키는 공정,
    을 포함하는, 식 (8) :
    Figure pct00092

    로 나타내는 제조 방법.
  17. 식 (9) :
    Figure pct00093

    (식 중, Ba 는, 보호되어 있어도 되는 핵산 염기 골격을 갖는 화합물을 나타내고, G4 는, 수산기의 보호기를 나타낸다.)
    로 나타내는 화합물을, 산화제의 존재하, 식 (4) :
    Figure pct00094

    (식 중, Ra 및 Rb 는 동일 또는 상이하고 메틸기, 에틸기 또는 수소 원자를 나타낸다. 단 Ra 및 Rb 가 동시에 수소 원자를 나타내는 경우는 없다.
    Rc 는 C1 ∼ C6 알킬기, 또는 페닐기이다.
    n 은, 1 ∼ 4 의 정수를 나타낸다.)
    로 나타내는 화합물과, 반응시키는 것을 특징으로 하는, 식 (10) :
    Figure pct00095

    (식 중, Ba, Ra, Rb, n 및 G4 는, 상기의 정의한 바와 같다.)
    으로 나타내는 화합물의 제조 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    반응 용매로서, 테트라하이드로피란 또는 4-메틸테트라하이드로피란을 사용하는, 제조 방법.
  19. 식 (10) 의 화합물을 추가로 탈보호하여, 식 (11) :
    Figure pct00096

    (식 중, Ba, Ra, Rb 및 n 은, 상기의 정의한 바와 같다.)
    로 나타내는 화합물을 얻는 공정,
    식 (11) 의 화합물의 5' 의 수산기를 선택적으로 보호하여, 식 (12) :
    Figure pct00097

    (식 중, Ba, Ra, Rb 및 n 은, 상기의 정의한 바와 같고, G1 은, 수산기의 보호기를 나타낸다.)
    로 나타내는 화합물을 얻는 공정,
    식 (12) 의 화합물을 식 (13) :
    Figure pct00098

    (식 중, G2 는 수산기의 보호기를 나타내고, G3 은 동일 또는 상이하고 알킬기를 나타낸다.)
    으로 나타내는 포스포로디아미다이트와 반응시키는 공정,
    을 포함하는, 제 1 항에 기재된 식 (1) 의 화합물의 제조 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    G4 는, G4-1 또는 G4-2 구조를 갖는 제조 방법.
    Figure pct00099
  21. 식 (10) :
    Figure pct00100

    (식 중, Ra 및 Rb 는 동일 또는 상이하고 메틸기, 에틸기 또는 수소 원자를 나타낸다. 단 Ra 및 Rb 가 동시에 수소 원자를 나타내는 경우는 없다.
    n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타내고,
    Ba 는 보호되어 있어도 되는 핵산 염기 골격을 갖는 기를 나타내고,
    G4 는, 보호기를 나타낸다.)
    으로 나타내는 화합물.
  22. 식 (11) :
    Figure pct00101

    (식 중, Ba, Ra, Rb 및 n 은, 제 21 항에 정의한 바와 같다.)
    로 나타내는 화합물.
  23. 식 (12) :
    Figure pct00102

    (식 중, Ba, Ra, Rb 및 n 은, 제 21 항에 정의한 바와 같고, G1 은, 수산기의 보호기를 나타낸다.)
    로 나타내는 화합물.
  24. 상기 식 (1) 의 아미다이트 화합물의 RNA 의 제조에 있어서의 사용.
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