CN114599664A - 糖苷化合物、酰胺化合物及使用这些化合物的多核苷酸制造方法 - Google Patents

糖苷化合物、酰胺化合物及使用这些化合物的多核苷酸制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供能够提高多寡核苷酸的收率及纯度的酰胺化合物、作为其中间体的糖苷化合物及使用该酰胺化合物的多核苷酸制造方法。本发明还提供能够提高多寡核苷酸的收率及纯度的式(1)的酰胺化合物及式(10)的糖苷化合物(式(10)及(1)中，Ba、Ra、Rb、Rc、G1、G2及G3与说明书中的定义相同，并且，R以下式表示)、以及使用该酰胺化合物的多核苷酸制造方法。

Description

糖苷化合物、酰胺化合物及使用这些化合物的多核苷酸制造 方法
技术领域
本专利申请基于日本国专利申请2019-192899号(于2019年10月8日提出申请)主张巴黎公约规定的专利优先权及利益，上述申请中记载的全部内容通过引用而被并入本说明书中。
本发明涉及糖苷化合物、其酰胺化合物及使用这些化合物的多核苷酸制造方法。此外，本发明还涉及上述糖苷化合物的中间体化合物及该中间体化合物的制造方法。
背景技术
RNA是可用作RNA探针、反义RNA、核酶、siRNA、适配体等的有用材料。
RNA可通过固相合成法等来合成，固相合成法中使用核苷的亚磷酰胺化物(以下称为“酰胺化物(amidite)”)作为原料。作为这样的酰胺化物的2’位的羟基的保护基，已知例如TBDMS(叔丁基二甲基硅烷基)、TOM(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)、ACE(双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基)等。此外，作为酰胺化物的2’位的羟基的保护基，报道了专利文献1～4所公开的保护基，但使用具有这些保护基的酰胺化物的RNA的合成方法在得到的RNA的收率、纯度方面不一定令人满意。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第5157168号公报
专利文献2：日本专利第5554881号公报
专利文献3：国际公开第2007-064291号公报
专利文献4：国际公开第2013-027843号公报
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的为提供能够提高多核苷酸的收率及纯度的酰胺化合物及使用该酰胺化合物的多核苷酸制造方法。此外，本发明的目的为提供作为上述酰胺化合物的中间体的糖苷化合物、以及上述糖苷化合物的中间体醚化合物的制造方法。
用于解决课题的手段
本申请的发明人为实现上述目的而反复进行了锐意研究，结果得到了以下见解：通过使用以下的基团作为酰胺化物的2’位的羟基的保护基，能够以高纯度合成RNA。
[化学式1]
Figure BDA0003607398310000021
(式中，
Ra及Rb相同或彼此不同，表示甲基、乙基或氢原子。其中，不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况。并且，
Rc表示可被卤素原子、甲基、硝基、甲氧基、或三氟甲基取代的苯基、C1～C10烷基或苄基。)
本发明是基于上述见解进一步反复研究而完成的，其提供以下的糖苷化合物、其酰胺化合物及使用该酰胺化合物的多核苷酸制造方法、以及作为该糖苷化合物的中间体的醚化合物及该醚化合物的制造方法。
本发明包括以下的项中记载的实施方式，但不限定于这些。
项1.式(1)表示的酰胺化合物(以下称为“本发明的酰胺化合物”)。
[化学式2]
Figure BDA0003607398310000031
式(1)中，R表示下式所示的基团：
[化学式3]
Figure BDA0003607398310000032
(式中，
Ra及Rb相同或彼此不同，表示甲基、乙基或氢原子。其中，不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况。
Rc表示可被卤素原子、甲基、硝基、甲氧基、或三氟甲基取代的苯基、C1～C10烷基或苄基。)，
Ba表示具有可被保护的核酸碱基骨架的基团，
G1及G2相同或彼此不同，表示羟基的保护基，并且，
G3相同或彼此不同，表示烷基。
项2.如项1所述的酰胺化合物，其中，Ra为甲基，并且，Rb为氢原子。
项3.如项1所述的酰胺化合物，其中，Ra、Rb同为甲基。
项4.如项1～3中任一项所述的酰胺化合物，其中，G1为以下的基团。
[化学式4]
Figure BDA0003607398310000041
(式中，R1、R2及R3相同或彼此不同，表示氢或烷氧基。)
项5.如项1～4中任一项所述的酰胺化合物，其中，G2为以下的基团。
[化学式5]
Figure BDA0003607398310000042
项6.如项1～5中任一项所述的酰胺化合物，其中，G3为异丙基。
项7.如项1～6中任一项所述的酰胺化合物，其中，Rc为苯基或甲苯基。
项8.含有式(2)表示的多核苷酸骨架的化合物的制造方法，其包括将项1～7中任一项所述的酰胺化合物供于固相合成反应的工序，
[化学式6]
Figure BDA0003607398310000043
(式(2)中，Ba相同或彼此不同，表示具有可被保护的核酸碱基骨架的基团，
X表示氧原子或硫原子，并且，
m表示正整数。)。
项9.如项8所述的制造方法，其中，含有式(2)的多核苷酸骨架的化合物是使四烷基氟化铵与通过使用所述酰胺化合物的固相合成反应生成的具有式(3)表示的寡核苷酸骨架的化合物进行反应而得的，
[化学式7]
Figure BDA0003607398310000051
(式(3)中，Ba相同或彼此不同，表示具有可被保护的核酸碱基骨架的基团，
X表示氧原子或硫原子，并且，
R相同或彼此不同，表示下式所示的基团：
[化学式8]
Figure BDA0003607398310000052
(式中，
Ra及Rb相同或彼此不同，表示甲基、乙基或氢原子。其中，不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况。并且，
Rc表示可被卤素原子、甲基、硝基、甲氧基、或三氟甲基取代的苯基、C1～C10烷基或者苄基。))。
项10.如项9所述的制造方法，其中，Ra为甲基，并且Rb为氢原子。
项11.式(4)表示的醚化合物。
[化学式9]
Figure BDA0003607398310000061
(式(4)中，
Ra及Rb相同或彼此不同，表示甲基、乙基或氢原子。其中，不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况。
Rc表示可被卤素原子、甲基、硝基、甲氧基、或三氟甲基取代的苯基、C1～C10烷基或苄基，Rd表示C1～C10烷基或者苯基。)
项12.如项11所述的醚化合物，其中，Ra为甲基，Rb为氢原子，并且Rc为苯基或甲苯基。
项13.式(4)表示的醚化合物的制造方法，其包括工序a：在卤化剂及酸的存在下，在溶剂中使式(5)表示的2-羟基烷基砜(2-hydroxyalkyl sulfone)与式(12)表示的双硫醚化合物进行反应的工序，
[化学式10]
Figure BDA0003607398310000062
(式(5)中，
Ra及Rb相同或彼此不同，表示甲基、乙基或氢原子。其中，不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况。并且，
Rc表示可被卤素原子、甲基、硝基、甲氧基、或三氟甲基取代的苯基、C1～C10烷基或者苄基。)
[化学式11]
(RdSCH2)2O (12)
(式(12)中，Rd与前述项11中定义相同。)
[化学式12]
Figure BDA0003607398310000063
(式(4)中，Ra、Rb、Rc及Rd与前述定义相同。)。
项14.如项13所述的制造方法，其中，Ra为甲基或乙基，Rb为氢原子，并且Rc为苯基或甲苯基。
项15.如项13所述的制造方法，其中，Ra为甲基，Rb为氢原子，并且Rc为苯基或甲苯基。
项16.式(8)表示的化合物的制造方法，其特征在于，使式(7)表示的化合物在卤化剂的存在下与式(4)表示的化合物进行反应，
[化学式13]
Figure BDA0003607398310000071
(式(7)中，Ba表示具有可被保护的核酸碱基骨架的化合物，并且，G4表示羟基的保护基。)
[化学式14]
Figure BDA0003607398310000072
(式(4)中，Ra、Rb、Rc及Rd与前述项11中定义相同。)
[化学式15]
Figure BDA0003607398310000073
(式(8)中，Ba、Ra、Rb及Rc与前述定义相同，并且，G4表示羟基的保护基。)。
项17.项1所述的式(1)的化合物的制造方法，其包括以下工序：
将式(8)的化合物进一步去保护而得到式(9)表示的化合物的工序；
选择性地保护式(9)的化合物的5’的羟基而得到式(10)表示的化合物的工序；和
使式(10)的化合物与式(11)表示的亚磷酰二胺(phosphordiamidite)进行反应的工序，
[化学式16]
Figure BDA0003607398310000081
(式(9)中，Ba、Ra、Rb及Rc与前述项16中定义相同。)
[化学式17]
Figure BDA0003607398310000082
(式(10)中，Ba、Ra、Rb、Rc及G1与前述项17中定义相同。)
[化学式18]
Figure BDA0003607398310000083
(式(11)中，G2表示羟基的保护基，G3相同或彼此不同，表示烷基。)。
项18.如项17所述的制造方法，其中，G4具有G4-1或G4-2结构。
[化学式19]
Figure BDA0003607398310000084
项19.式(8)表示的化合物。
[化学式20]
Figure BDA0003607398310000091
(式(8)中，Ba、Ra、Rb、Rc、G4与前述项16中定义相同。)
项20.式(9)表示的化合物。
[化学式21]
Figure BDA0003607398310000092
(式(9)中，Ba、Ra、Rb及Rc与前述项16中定义相同。)
项21.式(10)表示的化合物(以下称为“本发明的糖苷化合物”)。
[化学式22]
Figure BDA0003607398310000093
(式(10)中，Ba、Ra、Rb、Rc及G1与前述项17中定义相同。)
项22.前述式(1)的酰胺化合物在RNA的制造中的用途。
发明效果
通过使用本发明的糖苷化合物，能够获得酰胺化合物，其结果是可以提高固相合成法中RNA的收率及纯度。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
需要说明的是，本说明书中，“含有(comprise)”包括“实质上由……组成(essentially consist of)”的含义和“仅由……组成(consist of)”的含义。
本发明的酰胺化合物的特征在于，其由式(1)表示。
[化学式23]
Figure BDA0003607398310000101
(式(1)中，R表示下式：
[化学式24]
Figure BDA0003607398310000102
(式中，
Ra及Rb相同或彼此不同，表示甲基、乙基或氢原子。其中，不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况。
Rc表示可被卤素原子、甲基、硝基、甲氧基、或三氟甲基取代的苯基、C1～C10烷基或者苄基。)，
Ba表示具有可被保护的核酸碱基骨架的基团，
G1及G2相同或彼此不同，表示羟基的保护基，并且，
G3相同或彼此不同，表示烷基。)
Ba中的核酸碱基没有特别限定。作为该核酸碱基，可举出腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶等。另外，核酸碱基可以被取代基取代。作为这样的取代基，可举出例如卤素原子、酰基、烷基、芳基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、氰基烷基、羟基、羟基甲基、酰基氧基甲基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、及硝基等，以及上述中的2种以上的取代基的组合。
核酸碱基在环外具有氨基的情况下，作为该氨基的保护基，没有特别限定，可使用已知的核酸化学中使用的保护基，作为这样的保护基，可举出例如甲基、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、及(二甲基氨基)亚甲基等，以及上述中的2种以上的保护基的组合。
Ba更具体而言表示下式中的任一者所示的基团。
[化学式25]
Figure BDA0003607398310000111
(式中，
R4表示氢原子、甲基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、苯基乙酰基、乙酰基或苯甲酰基，
R5表示氢原子、乙酰基、异丁酰基或苯甲酰基，
R6表示氢原子、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、苯基乙酰基、乙酰基或异丁酰基，
R7表示2-氰基乙基，
R8表示氢原子、甲基、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基或4-甲基苯甲酰基，
R9表示二甲基氨基亚甲基。)
作为G1，只要是能作为保护基发挥功能的基团就可以不受限制地使用，可以广泛使用酰胺化合物中使用的已知的保护基。
作为G1，优选为以下的基团。
[化学式26]
Figure BDA0003607398310000121
(式中，R1、R2及R3相同或彼此不同，表示氢或烷氧基。)
R1、R2及R3优选一者为氢、其余两者为烷氧基，作为烷氧基，特别优选甲氧基。
作为G2，只要是能作为保护基发挥功能的基团就可以不受限制地使用，可以广泛使用酰胺化合物中使用的已知的保护基。作为G2，可举出例如氢原子、烷基、链烯基、炔基、环烷基、卤代烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基(cyclylalkyl)、羟基烷基、氨基烷基、烷氧基烷基、杂环基链烯基(heterocyclylalkenyl)、杂环基烷基(heterocyclylalkyl)、杂芳基烷基、甲硅烷基、甲硅烷基氧基烷基、单、二或三烷基甲硅烷基、单、二或三烷基甲硅烷基氧基烷基等，它们也可被1个以上吸电子基团取代。
作为G2，优选为被吸电子基团取代的烷基。作为该吸电子基团，可举出例如氰基、硝基、烷基磺酰基、卤素、芳基磺酰基、三卤代甲基、三烷基氨基等，优选为氰基。
作为G2，特别优选为以下的基团。
[化学式27]
Figure BDA0003607398310000131
对于G3而言，可以2个G3彼此键合而形成环状结构。作为G3，优选双方为异丙基。
烷基可以是直链状或支链状中的任何，优选为碳原子数1～12的烷基，更优选为碳原子数1～6的烷基。作为烷基，可举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、及己基。此处的烷基也包括烷氧基等的烷基部分。
Ra优选为甲基。n优选为1～4的整数，更优选为1～3的整数，进一步优选为1或2，特别优选为1。
另外，本发明的酰胺化合物可以在游离的状态或盐的状态下使用。作为本发明的酰胺化合物的盐，没有特别限定，可举出例如钠盐、镁盐、钾盐、钙盐、铝盐等与无机碱形成的盐；与甲胺、乙胺、乙醇胺等有机碱形成的盐；与赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸等碱性氨基酸形成的盐及铵盐。该盐可以是酸加成盐，作为这样的盐，具体而言，可举出与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸；甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、苹果酸、酒石酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、乙磺酸等有机酸；及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成的酸加成盐。本发明的酰胺化合物也包括盐、水合物、溶剂合物、多晶型等。
本发明的酰胺化合物可基于日本专利第5157168号公报、日本专利第5554881号公报等中记载的已知的方法、后述的实施例中记载的方法或根据需要而对这些方法加以适当变更的方法来制造。
另外，作为本发明的酰胺化合物的具体例，可举出实施例中记载的以下所示的化合物。
[化学式28]
Figure BDA0003607398310000141
本发明包含以下式(10)表示的糖苷化合物。
[化学式29]
Figure BDA0003607398310000142
(式(10)中，各基团的定义与前述相同。)
另外，作为本发明的糖苷化合物的具体示例，可举出实施例中记载的以下所示的化合物。
[化学式30]
Figure BDA0003607398310000143
本发明还包含式(10)表示的糖苷化合物的制造中间体化合物。作为这样的中间体化合物，可举出式(4)表示的醚化合物。
[化学式31]
Figure BDA0003607398310000144
(式(4)中，
Ra及Rb相同或彼此不同，表示甲基、乙基或氢原子。其中，不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况。
Rc表示可被氢原子、卤素原子、甲基、硝基、甲氧基、或三氟甲基取代的苯基、C1～C10烷基或苄基，Rd表示C1～C10烷基或者苯基。)
对于式(4)表示的醚化合物而言，可以如以下反应式所示，通过使式(12)表示的双硫醚化合物(例如，双(烷基硫基甲基)醚(bis(alkylthiomethyl)ether)或双(苯基硫基甲基)醚(bis(phenylthiomethyl)ether))与3-羟基-3-烷基丙烷砜(3-hydroxy-3-alkylpropanesulfone)在卤化剂及酸存在下、在溶剂中进行反应来制造。
[化学式32]
Figure BDA0003607398310000151
式(12)的双硫醚化合物可以通过例如如下式所示的那样使双(氯甲基)醚或双(芳基氧基甲基)醚与对应的烷基硫醇或苯基硫醇反应来得到。作为双(芳基氧基甲基)醚，可举出例如双(2,4,6-三氯苯基氧基甲基)醚。
[化学式33]
Figure BDA0003607398310000152
另外，式(12)的双硫醚化合物也可以根据已知的制造方法(例如，日本专利6459852号公报中记载的方法)来制造。
针对制造式(4)的醚化合物的一个示例、即式(6)的化合物的工序a进行说明。
以下，对工序a进行说明。
作为卤化剂，可举出例如N-氯代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺、N-碘代琥珀酰亚胺等N-卤代琥珀酰亚胺，1,3-二碘-5,5-二甲基乙内酰脲等N-卤代乙内酰脲，及氯、溴、碘等卤素等，以及上述中的2种以上的组合。本发明中，优选使用N-卤代琥珀酰亚胺，进一步优选使用N-碘代琥珀酰亚胺。
酸没有特别限定，可举出例如全氟烷基羧酸及其盐、全氟烷基磺酸及其盐、以及烷基磺酸及其盐，以及上述中的2种以上的组合。作为盐，可举出例如铜盐及银盐。作为酸，具体而言，可举出甲磺酸、对甲苯磺酸、樟脑磺酸、三氟甲磺酸及三氟甲磺酸银等，以及上述中的2种以上的组合。本发明中，优选使用三氟甲磺酸。
作为溶剂，可举出例如四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、环戊基甲醚、二氧杂环己烷、二氯甲烷、及甲苯等，以及上述中的2种以上的组合。本发明中，优选使用四氢呋喃。
相对于式(12)的双硫醚化合物，式(5)的2-羟基烷基砜的量通常为0.5～2.0当量，优选为0.8～1.5当量。相对于式(12)的化合物，卤化剂的量通常为0.5～2当量，优选为0.7～1.2当量。相对于式(12)的化合物，酸的量通常为0.001～2.0当量，优选为0.01～0.1当量。
本反应的反应温度通常为-80℃～0℃，优选为-50℃～-30℃。本反应的反应时间通常为1～24小时，优选为2～6小时。
对于反应的结束而言，例如，可取样一部分的反应物料，通过GC、TLC、LC等分析方法来确认。反应结束后，可向反应物料中添加三乙胺等碱来使反应停止。将反应物料加注至水中，供于有机溶剂提取、洗涤、浓缩等通常的后处理操作，从而可以得到含有式(4)表示的醚化合物的残余物。将该残余物供于蒸馏、柱色谱法等纯化操作，从而可以得到高纯度的式(4)表示的醚化合物。
前述方法中，优选化合物为式(6)：
[化学式34]
Figure BDA0003607398310000161
(式(6)中，Ra为甲基或乙基，Rb为氢原子，Rc为苯基或甲苯基。更优选Ra为甲基、Rb为氢原子、Rc为甲苯基。)。
本发明的酰胺化合物可以在固相合成法中作为用于制造RNA的材料使用。通过在固相合成法中使用本发明的酰胺化合物，能够以高纯度制造RNA。
本发明的含有下式(2)表示的多核苷酸骨架的化合物的制造方法的特征在于，包括使用上述的酰胺化合物进行固相合成反应的工序。
[化学式35]
Figure BDA0003607398310000171
(式(2)中，Ba相同或彼此不同，表示具有可被保护的核酸碱基骨架的基团，
X表示氧原子或硫原子，并且，
m表示正整数。)
另外，本发明的制造方法也可以包括利用四烷基氟化铵对具有式(3)表示的寡核苷酸骨架的化合物进行处理而得到具有式(2)表示的寡核苷酸骨架的化合物的工序。
[化学式36]
Figure BDA0003607398310000172
(式(3)中，Ba相同或彼此不同，表示具有可被保护的核酸碱基骨架的基团，
X表示氧原子或硫原子，并且，
R相同或彼此不同，表示下式：
[化学式37]
Figure BDA0003607398310000181
(式中，
Ra及Rb相同或彼此不同，表示甲基、乙基或氢原子。其中，不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况。
Rc表示可被卤素原子、甲基、硝基、甲氧基、或三氟甲基取代的苯基、C1～C10烷基或者苄基。)
式(2)及(3)的Ba及m与式(1)中的同样。
m没有特别限定，优选为2～300的整数。)
本发明中所谓“含有多核苷酸骨架的化合物”，表示至少包含1个RNA的化合物，优选为仅由RNA组成的化合物。
固相合成反应可以按照亚磷酰胺法等已知的方法(例如，日本专利第5157168号公报及日本专利第5554881号公报中记载的方法)来实施。另外，也可使用市售的核酸的自动合成装置等来实施。
含有式(2)表示的多核苷酸骨架的化合物的制造方法具体包括以下工序：(A)对担载于固相担载体的第一酰胺化合物的5’位的羟基(例如，式(1)的G1)进行去保护的工序；(B)使工序(A)中生成的去保护后的酰胺化合物与第二酰胺化合物缩合的工序；(C)将工序(B)中的未反应的化合物的5’位的羟基封端(capping)的可选工序；(D)将(B)或者(C)中生成的缩合物的亚磷酸基转化为磷酸基或硫代磷酸基的工序；(E)将工序(D)中得到的化合物从固相担载体切出，对2’位及核酸碱基的羟基进行去保护的工序；(F)对5’位的羟基进行去保护的工序等。通过重复(A)～(D)的工序，能够制造含有所希望的链长的多核苷酸骨架的化合物(例如，式(3)的化合物)。
对优选具有式(3)表示的寡核苷酸骨架的化合物利用四烷基氟化铵进行处理，从而能够脱去2’位的保护基，制造具有式(2)表示的寡核苷酸骨架的化合物。该反应的反应条件(反应温度、反应时间、试剂的量等)可以采用基于已知方法的条件。
本发明的制造方法中得到的具有式(2)表示的寡核苷酸骨架的化合物可以根据需要进行分离及纯化。通常，可以通过使用沉淀、提取及纯化RNA的方法来进行分离。具体而言，可采用通过向反应后的溶液中加入乙醇、异丙基醇等对于RNA而言溶解性低的溶剂来使RNA沉淀的方法，或者将苯酚/氯仿/异戊醇(例如，苯酚/氯仿/异戊醇＝25/24/1)的溶液添加至反应溶液、将RNA提取至水层中的方法。然后，可通过反相柱色谱法、阴离子交换柱色谱法、亲和柱色谱法等已知的高效液相色谱(HPLC)方法等进行分离、纯化。
通过本发明的制造方法，能够以比以往更高的纯度制造RNA。
对式(1)表示的本发明的酰胺化合物、式(10)的本发明的糖苷化合物及式(4)表示的本发明的中间体的醚化合物的制造中的反应条件没有特别限定。式(4)表示的中间体的醚化合物也可使用流式反应器合成。
为了减少本发明酰胺化合物中所含的杂质，也可增加在钯等过渡金属催化剂存在下利用氢进行的还原工序、或利用镁等进行的还原工序。
式(5)表示的2-羟基烷基砜可以参考以下的文献1～文献6，并通过以下的制造路径来合成。
文献1 CHINESE JOURNAL OF CHEMISTRY 2003,21,917
文献2 SYNTHESIS 2012,44,3623
文献3 Chem.Commun.,2005,5904
文献4 New J.Chem.,2009,33,972(面包酵母)
文献4 Adv.Synth.Catal.2013,355,2860(NaBH4还原)
文献4 WO 2017/223414 Al(催化加氢)
文献5 Tetrahedron Asymmetry 2005,16,2157
文献6 日本专利6448867号公报(mCPBA)
文献6 Tetrahedron 2001,57,2469(过氧化氢、钨)
[化学式38]
Figure BDA0003607398310000201
式(1)的化合物可以根据以下路线1的工序1、2、3及4而从式(7)的化合物制造。
式(7)的化合物中，Ba表示与前述相同的含义，G4典型而言具有以下的G4-1或G4-2结构。
[化学式39]
Figure BDA0003607398310000202
上述的化合物可购买市售品，也可通过例如Tetrahedron Letters,2005,46,2961中记载的方法来制造。
工序1(醚化工序)
醚化工序可使式(7)的化合物与式(4)的化合物进行反应来实施。该反应通常添加卤化剂来实施。该工序中使用的卤化剂没有特别限定，优选为选自由N-氯代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺、N-碘代琥珀酰亚胺、碘、1,3-二碘-5,5’-二甲基乙内酰脲、溴及氯组成的组中的至少一种。
该工序中，也可添加酸，使用的酸没有特别限定，优选为选自由全氟烷基羧酸、全氟烷基磺酸、烷基磺酸及它们的盐组成的组中的至少一种。
该工序中使用的反应溶剂没有特别限定，可举出例如乙醚、THF(四氢呋喃)、2-甲基四氢呋喃、四氢吡喃、4-甲基四氢吡喃、二甲氧基乙烷、二甘醇二甲醚、环戊基甲醚、二氧杂环己烷等醚，或乙腈等腈，甲苯、氯苯、二氯苯等芳香族烃，二氯甲烷等，以及上述溶剂中的2种以上的组合。作为优选的溶剂，可举出乙醚、THF(四氢呋喃)、2-甲基四氢呋喃、四氢吡喃、4-甲基四氢吡喃、二甲氧基乙烷、二甘醇二甲醚、环戊基甲醚、二氧杂环己烷等醚。
该工序中的反应时间没有特别限定，例如为10分钟～12小时，优选为10分钟～6小时。
该工序中的反应温度没有特别限定，例如为-80～30℃，优选为-60～10℃。
该工序中的前述式(4)表示的醚化合物的浓度也没有特别限定，可适当设定。
该工序中，相对于式(7)表示的化合物的摩尔数，前述式(4)表示的醚化合物的摩尔数为例如0.5～2倍，优选为0.8～1.5倍。
该工序中，相对于式(7)表示的化合物的摩尔数，前述卤化剂的摩尔数为例如0.5～10倍，优选为0.8～6倍。
工序2(去保护工序)
前述工序1中得到的式(8)的化合物可供于去保护反应而转化为式(9)的化合物。去保护工序可以通过已知的方法来实施，典型而言，可以在溶剂中使氟化氢/三乙胺、氟化氢/吡啶、或三乙胺三氢氟酸盐发挥作用而进行去保护。
工序3(5’羟基的保护工序)
前述工序中得到的式(9)的化合物被供于保护工序，保护基的引入可通过已知的方法来实施，典型而言，可在吡啶中使4,4’-二甲氧基三苯甲基氯与化合物(9)反应来引入保护基，制造化合物(10)。
工序4(酰胺化工序)
该工序可通过使式(11)的化合物与前述工序中得到的式(10)的糖苷化合物进行反应来实施。典型而言，在二异丙基铵盐四氮唑(diisopropylammonium tetrazolide)的存在下，使作为式(11)的化合物的2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺进行反应来实施。酰胺化也可基于日本专利第5554881号公报的实施例2～5中记载的方法来进行。
[化学式40]
Figure BDA0003607398310000221
如以上所说明，式(7)、(8)、(9)及(10)的化合物可以用于制造式(1)的酰胺化合物。
实施例
以下，为了更详细地说明本发明而举出实施例。但是，本发明不受这些实施例等的任何限定。
本说明书中，使用以下的缩写。
TPM＝(1-(4-甲基苯磺酰基)丙烷-2-基)氧基)甲氧基)甲基；A＝腺嘌呤、G＝鸟嘌呤、C＝胞嘧啶、U＝尿嘧啶。
TPM酰胺化物U的制造
制造例1
1)TPM化剂(TPMR)的制造
[化学式41]
Figure BDA0003607398310000231
将双(甲硫基甲基)醚(5.9g，0.043mol)溶解于无水四氢呋喃(THF)(60mL)，加入分子筛4A(5.9g)，将混合物搅拌10分钟。将混合物冷却至-50℃后，依次添加N-碘代琥珀酰亚胺(NIS)(11.5g，1.19eq.)和三氟甲磺酸(TfOH)(0.11mL，0.030eq.)。该向混合物中滴入1-(4-甲基苯磺酰基)丙烷-2-醇(10g，1.09eq.)(ENAMINE Ltd.公司制)的乙腈(20mL)溶液，并将混合物于-50～-45℃搅拌4小时。向反应液中滴入三乙胺(4.0mL)后，升温至-30～-20℃，随后向预先在冰水浴中冷却至5～10℃的由硫代硫酸钠五水合物(17.1g)、碳酸氢钠(6.0g)及水(130mL)组成的溶液中，加入上述反应液。向混合物中加入乙酸乙酯(42mL)，于10～15℃搅拌30分钟后，使用硅藻土(5.9g)过滤混合液。将滤液分液后，使用20％食盐水(24mL)洗涤有机层。使用无水硫酸镁(3g)干燥有机层后，在减压下蒸馏除去溶剂(浴温40℃)。通过硅胶色谱法纯化残余物(己烷/乙酸乙酯＝3/1，硅胶207mL)，得到3.1g黄色油状物。
通过GC/FID进行纯度分析，结果，纯度为91％。
通过硅胶色谱法再次进行纯化(己烷/乙酸乙酯＝8/1，硅胶150mL)，得到3.1g纯度98.2％的TPMR及1.5g纯度97.8％的TPMR。其后的反应中将二者混合后使用。
1H-NMR(CDCl3):δ7.79(d,2H)7.36(d,2H)4.76(s,2H)4.63(d,2H)4.27(m,1H)3.44(dd,1H)3.14(dd,1H)2.45(s,3H)2.13(s,3H)1.32(d,3H)
制造例2
2)TPM-U-2的制造
[化学式42]
Figure BDA0003607398310000241
向U-1(3.3g，6.78mmol)中加入无水甲苯(16.5mL，5vol/wt)，将混合物减压浓缩至3vol/wt后，进一步加入无水甲苯(6.6mL，2.0vol/wt)，将混合物减压浓缩至3vol/wt。加入无水四氢呋喃(6.6mL，2.0vol/wt)，将混合物冷却至-55℃左右后，向其中滴入PMMR(3.09g，10.17mmol，1.5eq.)，使用THF 2mL彻底洗涤。向混合物中添加NIS(2.06g，9.15mmol，1.35eq.)，于-55～-45℃滴入TfOH(0.72mL，8.14mmol，1.2eq.)。将混合物于-55～-45℃搅拌1小时后，向使用冰水浴冷却的由硫代硫酸钠五水合物(3.3g)、碳酸氢钠(1.12g)、水(22mL)及甲苯组成的混合液中加注该反应液。将混合物在冰水浴下搅拌30分钟后，进行分液。向有机层中加入由硫代硫酸钠五水合物(1.65g)、碳酸氢钠(0.6g)及水(11mL)组成的溶液，将混合物于室温搅拌15分钟后，完成分液。使用硫酸钠(1g)干燥有机层后，在减压下浓缩干燥。通过硅胶色谱法纯化残余物(己烷/乙酸乙酯＝3/1、硅胶250mL)，得到无色澄清玻璃状固体的TPM-U-2(5.3g)。
制造例3
3)TPM-U-3的制造
[化学式43]
Figure BDA0003607398310000251
将TPM-U-2(5.3g，7.13mmol)溶解于丙酮(10mL)后，添加三乙胺三氢氟酸盐(1.3mL，7.84mmol)，将混合物于室温搅拌2小时。向反应液中加入甲基叔丁基醚(MTBE)(53mL)，将混合物搅拌30分钟后，使用倾析除去MTBE层。反复进行3次该操作后，减压干燥残余物，得到白色无定形状(amorphous)的TPM-U-3(3.5g)。
制造例4
4)TPM-U-4的制造
[化学式44]
Figure BDA0003607398310000252
向TPM-U-3(3.5g，7.00mmol)中加入吡啶(10.5mL，3vol/wt)，进行2次共沸脱水后，加入吡啶(7.0mL，2vol/wt)、甲苯(17.5mL，5vol/wt)及乙腈(7.0mL，2vol/wt)，将混合物冷却至0℃左右。此时添加4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(2.85g，8.40mmol，1.2eq.)。将混合物于搅拌室温6小时后，添加甲醇(1.75mL.0.5vol/wt)，将混合物搅拌10分钟。加入由碳酸氢钠(0.53g)和水(10.5mL)组成的溶液，将混合物搅拌15分种，进行分液(进一步重复1次本操作)。向有机层中加入由氯化钠(1.05g)和水(10.5mL)组成的溶液，将混合物搅拌15分钟后，进行分液。使用硫酸钠(1g)干燥有机层后，进行减压浓缩。通过硅胶色谱法纯化残余物(己烷/乙酸乙酯＝1/1～仅乙酸乙酯，硅胶280mL)，得到3.8g白色无定形状的TPM-U-4(收率：67％)。
制造例5
5)TPM-U-5(TPM酰胺化物U)的制造
[化学式45]
Figure BDA0003607398310000261
将TPM-U-4(4.7g，5.85mmol)溶解于无水乙腈(47mL，10vol/wt)后，加入二异丙基铵盐四氮唑(1.10g，6.56mmol，1.12eq.)和分子筛4A(0.94g，0.2wt/wt)，将混合物于室温搅拌30分钟。向该溶液中添加2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰二胺(Phos reagent)(2.65g，8.78mmol，1.5eq.)，将混合物于浴温45℃搅拌1.5小时。将混合物放冷至室温后，过滤，并减压浓缩滤液。通过硅胶色谱法纯化残余物(己烷/丙酮＝2/1+5％吡啶，硅胶380mL)，得到4.75g白色固体的TPM酰胺化物U。
31P-NMR(CDCl3):δ151.89,151.86,150.87
核酸的制造例
使用上述制造例5中制作的TPM酰胺化物U，合成下述序列号1的序列表示的尿苷50聚体。
5’-UUUUUUUUUU UUUUUUUUUU UUUUUUUUUU UUUUUUUUUU UUUUUUUUUU-3’(序列号1)
(式中，U表示尿苷单磷酸钠盐)
使用NTS M-4MX-E(NIHON TECHNO SERVICE CO.,LTD.制)作为核酸合成仪，从3’侧朝向5’侧固相合成。合成中，使用多孔质玻璃作为固相担载体，使用高纯度三氯乙酸甲苯溶液作为解封闭(deblocking)溶液，使用5-苄基巯基-1H-四唑作为缩合剂，使用碘溶液作为氧化剂，使用苯氧基乙酸溶液和N-甲基咪唑溶液作为封端溶液来实施。
固相合成后的寡核苷酸粗产物的纯度的测定通过HPLC来实施。将粗产物通过HPLC(波长260nm，色谱柱ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18，2.1mm×100mm)分离成各成分，由得到的色谱图的总面积值中的主要产物的面积值计算出寡核苷酸的纯度。
(本发明的核酸的制造例)
制造例6
使用实施例5中制备的TPM酰胺化物U合成了尿苷50聚体(分子量15246.53)，结果，每0.173μmol的OD260为37.21OD、纯度为53.5％。由OD260的值计算出每1μmol的收量为8603μg/μmol。
结果在以下表1示出。
(OD260是指1mL溶液(pH＝7.5)中的每10mm光程的UV260nm的吸光度。一般而言，RNA中1OD＝40μg是已知的，由此可利用吸光度来算出RNA的生成量。)
(核酸的比较制造例)
比较例1
使用日本专利第5554881号公报的实施例2中记载的尿苷EMM酰胺化物，进行与制造例6中记载的方法相同的固相合成，制造了尿苷50聚体，结果，每0.228μmol的OD260为41.41OD，纯度为44.1％。由OD260的值计算出每1μmol的收量为7264μg/μmol。
结果在以下表1示出。
[表1]
实施例1 比较例1
尿苷50聚体纯度(％) 53.5 44.1
收量(μg/μmol) 8603 7264
收率(％) 56.4 47.6
如以上的表1所示，使用通过本发明制造的酰胺化物的情况下，尿苷50聚体的纯度能够得到良好的结果。
产业上的可利用性
本发明提供可用作酰胺化物的2’位的羟基的保护基的含有磺基的醚化合物、具有该含有磺基的醚部的酰胺化合物。本发明的酰胺化合物适用于高纯度寡核酸的合成。
配列表自由文本
序列表的序列号1示出了尿苷50聚体的碱基序列。
Figure IDA0003607398350000011

Claims (22)

1.式(1)表示的酰胺化合物，
[化学式1]
Figure FDA0003607398300000011
式(1)中，R表示下式所示的基团：
[化学式2]
Figure FDA0003607398300000012
式中，
Ra及Rb相同或彼此不同，表示甲基、乙基或氢原子，其中，不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况，
Rc表示可被卤素原子、甲基、硝基、甲氧基、或三氟甲基取代的苯基、C1～C10烷基或者苄基，
Ba表示具有可被保护的核酸碱基骨架的基团，
G1及G2相同或彼此不同，表示羟基的保护基，并且，
G3相同或彼此不同，表示烷基。
2.如权利要求1所述的酰胺化合物，其中，Ra为甲基，并且，Rb为氢原子。
3.如权利要求1所述的酰胺化合物，其中，Ra、Rb同为甲基。
4.如权利要求1～3中任一项所述的酰胺化合物，其中，G1为以下的基团，
[化学式3]
Figure FDA0003607398300000021
式中，R1、R2及R3相同或彼此不同，表示氢或烷氧基。
5.如权利要求1～4中任一项所述的酰胺化合物，其中，G2为以下的基团，
[化学式4]
Figure FDA0003607398300000022
6.如权利要求1～5中任一项所述的酰胺化合物，其中，G3为异丙基。
7.如权利要求1～6中任一项所述的酰胺化合物，其中，Rc为苯基或甲苯基。
8.含有式(2)表示的多核苷酸骨架的化合物的制造方法，其包括将权利要求1～7中任一项所述的酰胺化合物供于固相合成反应的工序，
[化学式5]
Figure FDA0003607398300000023
式(2)中，Ba相同或彼此不同，表示具有可被保护的核酸碱基骨架的基团，
X表示氧原子或硫原子，并且，
m表示正整数。
9.如权利要求8所述的制造方法，其中，含有式(2)的多核苷酸骨架的化合物是使四烷基氟化铵与通过使用所述酰胺化合物的固相合成反应生成的具有式(3)表示的寡核苷酸骨架的化合物进行反应而得的，
[化学式6]
Figure FDA0003607398300000031
式(3)中，Ba相同或彼此不同，表示具有可被保护的核酸碱基骨架的基团，
X表示氧原子或硫原子，并且，
R相同或彼此不同，表示下式所示的基团：
[化学式7]
Figure FDA0003607398300000032
式中，
Ra及Rb相同或彼此不同，表示甲基、乙基或氢原子，其中，不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况，
Rc表示可被氢原子、卤素原子、甲基、硝基、甲氧基、或三氟甲基取代的苯基、C1～C10烷基或者苄基。
10.如权利要求9所述的制造方法，其中，Ra为甲基，并且Rb为氢原子。
11.式(4)表示的醚化合物，
[化学式8]
Figure FDA0003607398300000041
式(4)中，
Ra及Rb相同或彼此不同，表示甲基、乙基或氢原子，其中，不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况，
Rc表示可被卤素原子、甲基、硝基、甲氧基、或三氟甲基取代的苯基、C1～C10烷基或苄基，Rd表示C1～C10烷基或苯基。
12.如权利要求11所述的醚化合物，其中，Ra为甲基，Rb为氢原子，并且Rc为苯基或甲苯基。
13.式(4)表示的醚化合物的制造方法，其包括工序a：在卤化剂及酸的存在下，在溶剂中使式(5)表示的2-羟基烷基砜与式(12)表示的双硫醚化合物进行反应的工序，
[化学式9]
Figure FDA0003607398300000042
式(5)中，
Ra及Rb相同或彼此不同，表示甲基、乙基或氢原子，其中，不包括Ra及Rb同时表示氢原子的情况，
Rc表示可被卤素原子、甲基、硝基、甲氧基、或三氟甲基取代的苯基、C1～C10烷基或者苄基，
[化学式10]
(RdSCH2)2O (12)
式(12)中，Rd与前述权利要求11中定义相同，
[化学式11]
Figure FDA0003607398300000051
式(4)中，Ra、Rb、Rc及Rd与前述定义相同。
14.如权利要求13所述的制造方法，其中，Ra为甲基或乙基，Rb为氢原子，并且Rc为苯基或甲苯基。
15.如权利要求13所述的制造方法，其中，Ra为甲基，Rb为氢原子，并且Rc为苯基或甲苯基。
16.式(8)表示的化合物的制造方法，其特征在于，使式(7)表示的化合物在卤化剂的存在下与式(4)表示的化合物进行反应，
[化学式12]
Figure FDA0003607398300000052
式(7)中，Ba表示具有可被保护的核酸碱基骨架的化合物，并且，G4表示羟基的保护基，
[化学式13]
Figure FDA0003607398300000053
式(4)中，Ra、Rb、Rc及Rd与前述权利要求11中定义相同，
[化学式14]
Figure FDA0003607398300000054
式(8)中，Ba、Ra、Rb、及Rc与前述定义相同，并且，G4表示羟基的保护基。
17.权利要求1所述的式(1)的化合物的制造方法，其包括以下工序：
将式(8)的化合物进一步去保护而得到式(9)表示的化合物的工序；
选择性地保护式(9)的化合物的5’的羟基而得到式(10)表示的化合物的工序；和
使式(10)的化合物与式(11)表示的亚磷酰二胺进行反应的工序，
[化学式15]
Figure FDA0003607398300000061
式(9)中，Ba、Ra、Rb及Rc与前述权利要求16中定义相同，
[化学式16]
Figure FDA0003607398300000062
式(10)中，Ba、Ra、Rb及Rc与前述定义相同，并且G1表示羟基的保护基，
[化学式17]
Figure FDA0003607398300000063
式(11)中，G2表示羟基的保护基，G3相同或彼此不同，表示烷基。
18.如权利要求16所述的制造方法，其中，G4具有G4-1或G4-2结构，
[化学式18]
Figure FDA0003607398300000071
19.式(8)表示的化合物，
[化学式19]
Figure FDA0003607398300000072
式(8)中，Ba、Ra、Rb、Rc、G4与前述权利要求16中定义相同。
20.式(9)表示的化合物，
[化学式20]
Figure FDA0003607398300000073
式(9)中，Ba、Ra、Rb及Rc与前述权利要求16中定义相同。
21.式(10)表示的化合物，
[化学式21]
Figure FDA0003607398300000074
式(10)中，Ba、Ra、Rb、Rc及G1与前述权利要求17中定义相同。
22.所述式(1)的酰胺化合物在RNA的制造中的用途。
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