KR20080106441A - 핵산 보호기의 탈리 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 목적은, 리보오스의 2'위치 수산기로 치환하는 2-시아노에톡시메톡시(CEM기)를 재현성 좋게, 또한 효율적으로 탈리하는 방법을 제공하는 것에 있다. 다음의 일반식 (10)으로 표시되는 올리고핵산 유도체에, TBAF를 작용시켜 각 리보오스의 2'위치 수산기의 보호기를 탈리하는 공정에 있어서, 술폭시드계 용매 혹은 아미드계 용매 또는 이들의 혼합 용매를 반응 용매로서 이용함으로써, 다음의 일반식 (11)로 표시되는 올리고핵산 유도체를 제조한다.

Description

핵산 보호기의 탈리 방법{METHOD FOR DETACHING PROTECTING GROUP ON NUCLEIC ACID}
본 발명은 올리고 핵산 유도체의 각 리보오스의 2'위치 수산기를 보호하고 있는, 중성 조건하에서 탈리(脫離) 가능한 에테르형 보호기, 예컨대, 2-시아노에톡시메틸(이하, 「CEM기」로 칭함)을 재현성 좋게, 또한 효율적으로 탈리하기 위한 방법에 관한 것이다.
올리고 리보핵산(올리고 RNA)은, 유전자 해석의 RNA 프로브, RNA 의약품 소재(안티센스 RNA, 리보자임, RNAi를 이용한 유전자 발현 제어), 인공 효소, 압타머(aptamer)로서 유용한 것은 주지이다.
올리고 RNA를 제조하기 위한 시약의 하나로서, 리보오스의 2'위치 수산기가 중성 조건에 있어서 탈리 가능한 CEM기로 치환되어 보호되어 있는 포스포라미데이트(phosphoramidite) 화합물이 알려져 있다(비특허 문헌 1).
상기 포스포라미데이트 화합물을 사용하여 올리고 RNA를 제조하는 경우, 고상(固相) 담체 상에서 원하는 사슬 길이의 올리고 RNA를 제조한 후, 상기 올리고 RNA로부터 고상 담체 및 각 치환기의 보호기를 제거할 필요가 있다. 이러한 보호기를 제거하는 공정의 하나로서, 올리고 RNA의 각 리보오스의 2'위치 수산기를 보호 하고 있는, 중성 조건하에서 탈리 가능한 에테르형 보호기를 탈리하는 공정이 있으나, 상기 공정에서는, 탈보호제로서 테트라부틸암모늄플루오라이드(이하, 「TBAF」로 칭함)를, 용매로서 테트라히드로푸란(이하, 「THF」 로 칭함)을 사용하는 것이 일반적이다(비특허 문헌 1).
비특허 문헌 1: 오오기 등, ORGANIC LETTERS, Vol.7, 3477(2005)
본 발명의 목적은, 주로, 올리고핵산 유도체의 각 리보오스의 2'위치 수산기를 보호하고 있는, 중성 조건하에서 탈리 가능한 에테르형 보호기를 재현성 좋게, 또한 효율적으로 탈리하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자는, 상기 목적을 달성하기 위해서, 예의 검토한 결과, 다음의 일반식 (10)으로 표시되는 올리고핵산 유도체에 TBAF를 작용시켜, 각 리보오스의 2'위치 수산기를 보호하고 있는 중성 조건하에서 탈리 가능한 에테르형 보호기를 탈리하는 공정에 있어서, THF를 함유하고 있어도 좋은, 술폭시드계 용매 혹은 아미드계 용매 또는 이들의 혼합 용매를 반응 용매로서 이용함으로써, 다음의 일반식 (11)로 표시되는 올리고핵산 유도체를 효율적으로 제조할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다
[식 1]
Figure 112008065985566-PCT00001
일반식 (10) 및 일반식 (11) 중, 각 B는 각각 독립적으로, 핵산 염기 또는 그 수식체를 나타낸다. n은, 1∼200의 범위 내에 있는 정수를 나타낸다. n은, 10∼100의 범위 내에 있는 정수가 바람직하고, 또한, 보다 바람직하게는, 15∼50의 범위 내에 있는 정수이다. 각 Q는 각각 독립적으로, O 또는 S를 나타낸다. 각 R은 각각 독립적으로, H, 수산기, 할로겐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 디알킬아미노, 알케닐옥시, 알케닐티오, 알케닐아미노, 디알케닐아미노, 알키닐옥시, 알키닐티오, 알키닐아미노, 디알키닐아미노 또는 알콕시알킬옥시를 나타내지만, 적어도 하나는 수산기를 나타낸다. Z는 H, 인산기 또는 티오인산기를 나타낸다.
R1은, 다음의 일반식 (3)으로 표시되는 치환기를 나타낸다.
[식 2]
Figure 112008065985566-PCT00002
일반식 (3) 중, R11, R12, R13은, 동일하거나 또는 다르며, 수소 또는 알콕시를 나타낸다.
각 R4는, 각각 독립적으로, H, 할로겐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 디알킬아미노, 알케닐옥시, 알케닐티오, 알케닐아미노, 디알케닐아미노, 알키닐옥시, 알키닐티오, 알키닐아미노, 디알키닐아미노, 알콕시알킬옥시 또는 다음의 일반식 (4)로 표시되는 치환기를 나타낸다.
[식 3]
Figure 112008065985566-PCT00003
일반식 (4) 중, WG1은, 전자 흡인성 기(基)를 나타낸다.
B로 표시되는 핵산 염기로서는 특별히 한정되는 것은 아니며, 예컨대, 시토신, 우라실, 티민 등의 피리미딘 염기, 아데닌, 구아닌 등의 푸린 염기를 들 수 있다.
B의 「수식체」란, 핵산 염기가 임의의 치환기로 치환되어 있는 기이며, 이러한 치환기로서는, 예컨대, 할로겐, 아실, 알킬, 아릴알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 히드록시, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 카르복시, 시아노, 니트로를 들 수 있고, 이들이 임의의 위치에 1∼3개 치환되어 있다.
B의 수식체에 관련된 「할로겐」으로서는, 예컨대, 불소, 염소, 브롬, 요오드를 들 수 있다.
B의 수식체에 관련된 「아실」로서는, 예컨대, 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1∼6의 알카노일, 탄소수 7∼13의 아로일을 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 포르밀, 아세틸, n-프로피오닐, 이소프로피오닐, n-부티릴, 이소부티릴, tert-부티릴, 발레릴, 헥사노일, 벤조일, 나프토일, 레불리닐 등을 들 수 있다.
B의 수식체에 관련된 「알킬」로서는, 예컨대, 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1∼5의 알킬을 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, tert-펜틸 등을 들 수 있다. 상기 알킬은 치환되어 있어도 좋으며, 이러한 치환기로서는, 예컨대, 할로겐, 알킬, 알콕시, 시아노, 니트로를 들 수 있고, 이들이 임의의 위치에 1∼3개 치환되어 있어도 좋다.
B의 수식체에 있어서의 「아릴알킬」, 「알콕시알킬」, 「모노알킬아미노」 및 「디알킬아미노」의 「알킬」 부분은, 상기의 「알킬」과 동일한 것을 들 수 있다.
B의 수식체에 관련된 「알콕시」로서는, 예컨대, 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 1∼4의 알콕시를 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시 등을 들 수 있다. 그 중에서도 탄소수 1∼3의 것이 바람직하고, 특히 메톡시가 바람직하다.
B의 수식체에 관련된 「알콕시알킬」의 「알콕시」 부분은, 상기의 「알콕시」와 동일한 것을 들 수 있다.
B의 수식체에 관련된 「아릴알킬」의 「아릴」로서는, 예컨대, 탄소수 6∼12의 아릴을 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 비페닐 등을 들 수 있다. 상기 아릴은 치환되어 있어도 좋으며, 이러한 치환기로서는, 예컨대, 할로겐, 알킬, 알콕시, 시아노, 니트로를 들 수 있고, 이들이 임의의 위치에 1∼3개 치환되어 있어도 좋다.
B의 수식체에 관련된 「알킬」, 「아릴」의 치환기인 「할로겐」, 「알킬」 및 「알콕시」로서는, 각각 상기와 동일한 것을 들 수 있다.
R 및 R4에 관련된 「할로겐」, 「알콕시」, 「알킬아미노」 또는 「디알킬아미노」는, 상기 B의 수식체에 관련된 그들과 동일한 것을 들 수 있다.
R 및 R4에 관련된 「알콕시알킬옥시」, 「알킬티오」의 「알킬」 부분으로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 「알킬」과 동일한 것을 들 수 있다.
R 및 R4에 관련된 「알콕시알킬옥시」의 「알콕시」 부분으로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 「알콕시」와 동일한 것을 들 수 있다.
R 및 R4에 관련된 「알케닐옥시」, 「알케닐티오」, 「알케닐아미노」, 「디알케닐아미노」의 「알케닐」 부분으로서는, 예컨대, 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 2∼6의 알케닐을 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 비닐, 알릴, 1-프로페닐, 이소프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 1-펜테닐, 1-헥세닐 등을 들 수 있다.
R 및 R4에 관련된 「알키닐옥시」, 「알키닐티오」, 「알키닐아미노」, 「디알키닐아미노」의 「알키닐」 부분으로서는, 예컨대, 직쇄형 또는 분지쇄형의 탄소수 2∼4의 알키닐을 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 에티닐, 2-프로피닐, 1-부티닐 등을 들 수 있다.
R11, R12, R13에 관련된 「알콕시」로서는, 상기 B의 「알콕시」와 동일한 것을 들 수 있다.
WG1에 관련된 「전자 흡인성 기」로서는, 예컨대, 시아노, 니트로, 알킬술포닐, 아릴술포닐, 할로겐을 들 수 있다. 그 중에서도, 시아노가 바람직하다.
WG1에 관련된 「알킬술포닐」의 「알킬」 부분으로서는, 상기 B의 「알킬」과 동일한 것을 들 수 있다.
WG1에 관련된 「아릴술포닐」의 「아릴」 부분으로서는, 상기 B의 「아릴」과 동일한 것을 들 수 있다.
「술폭시드계 용매」로서는, 예컨대, 하기 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 화합물을 들 수 있다. 구체적으로는, 디메틸술폭시드(이하, 「DMSO」로 칭함), 에틸메틸술폭시드 등을 들 수 있다. 이 중에서, DMSO가 적당하다.
「아미드계 용매」로서는, 예컨대, 하기 일반식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물을 들 수 있다. 구체적으로는, N,N-디메틸포름아미드(이하, 「DMF」로 칭함), N,N-디에틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N,N-디에틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등을 들 수 있다. 이 중에서, DMF가 적당하다.
[식 4]
Figure 112008065985566-PCT00004
일반식 (Ⅰ) 및 일반식 (Ⅱ) 중, Ra, Rb는 동일하거나 또는 다르며, 알킬을 나타낸다. Rc, Rd는 동일하거나 혹은 다르며, 알킬을 나타내고, Re는, 수소 혹은 알킬을 나타내거나, 또는 Rd는, 알킬을 나타내고, Rc와 Re가 인접하는 질소 원자 및 탄소 원자와 합쳐져서 형성하는, 5 혹은 6원의 포화 환상 아미드기를 나타낸다.
또한, 본 발명으로서, 다음의 일반식 (10)으로 표시되는 올리고핵산 유도체에, TBAF를 작용시켜 각 리보오스의 2'위치 수산기를 보호하고 있는 중성 조건하에서 탈리 가능한 에테르형 보호기를 탈리하는 공정에 있어서, THF를 함유하고 있어도 좋은, 술폭시드계 용매 혹은 아미드계 용매 또는 이들의 혼합 용매를 반응 용매로서 이용하는 것을 특징으로 하는, 다음의 일반식 (11)로 표시되는 올리고핵산 유도체를 제조하는 공정을 포함하는, 다음의 일반식 (A)로 표시되는 올리고 RNA (이하, 「올리고 RNA (A)」로 칭함)의 제조 방법을 들 수 있다.
[식 5]
Figure 112008065985566-PCT00005
일반식 (10) 및 일반식 (11) 중, 각 B, 각 Q, 각 R, 각 R4는, 각각 독립적으로, 상기와 동일한 의미이다. n, R1, Z는, 상기와 동일한 의미이다.
[식 6]
Figure 112008065985566-PCT00006
일반식 (A) 중, 각 B, 각 Q, 각 R은, 각각 독립적으로, 상기와 동일한 의미이다. n, Z는, 상기와 동일한 의미이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
I. 포스포라미데이트 화합물
상기 올리고 RNA (A)의 제조에 사용하는 리보핵산 유도체로서, 다음의 일반식 (B)로 표시되는 포스포라미데이트 화합물(이하, 「포스포라미데이트 화합물 (B)」로 칭함)을 들 수 있다.
[식 7]
Figure 112008065985566-PCT00007
일반식 (B) 중, Bz는, 보호기를 갖고 있어도 좋은 핵산 염기 또는 그 수식체를 나타낸다. R1, WG1은, 상기와 동일한 의미이다. WG2는, 전자 흡인성 기를 나타낸다. R2a, R2b는, 동일하거나 혹은 다르며, 알킬을 나타내거나, 또는 R2a, R2b가 인접하는 질소 원자와 합쳐져서 형성하는, 5∼6원의 포화 아미노환기를 나타낸다. 이러한 포화 아미노환기는, 질소 원자 외에 환(環) 구성 원자로서 질소 원자 또는 유황 원자를 1개 갖고 있어도 좋다.
Bz에 관련된 「핵산 염기」로서는, 핵산의 합성에 사용되는 것이면 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 시토신, 우라실 등의 피리미딘 염기, 아데닌, 구아닌 등의 푸린 염기를 들 수 있다.
Bz에 관련된 「핵산 염기」는, 보호되어 있어도 좋으며, 그 중에서도 아미노기를 갖는 핵산 염기, 예컨대, 아데닌, 구아닌, 시토신은, 아미노기가 보호되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 「아미노기의 보호기」로서는, 핵산의 보호기로서 사용되는 것이면 특별히 제한되지 않고, 구체적으로는, 예컨대, 벤조일, 4-메톡시벤조일, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 페닐아세틸, 페녹시아세틸, 4-tert-부틸페녹시아세틸, 4-이소프로필페녹시아세틸, (디메틸아미노)메틸렌 등을 들 수 있다.
Bz의 「수식체」란, 핵산 염기가 임의의 치환기로 치환되어 있는 기이며, Bz의 「수식체」에 관련된 치환기로서는, 예컨대, 할로겐, 아실, 알킬, 아릴알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 히드록시, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 카르복시, 시아노, 니트로를 들 수 있고, 이들이 임의의 위치에 1∼3개 치환되어 있다.
Bz의 수식체에 관련된 「할로겐」, 「아실」, 「알킬」, 「아릴알킬」, 「알콕시」, 「알콕시알킬」, 「모노알킬아미노」, 「디알킬아미노」로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 그들과 동일한 것을 들 수 있다.
R2a, R2b에 관련된 「알킬」로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 「알킬」과 동일한 것을 들 수 있다.
R2a, R2b에 관련된 「5∼6원의 포화 아미노환기」로서는, 예컨대, 피롤리딘-1-일, 피페리딘-1-일, 모르폴린-1-일, 티오모르폴린-1-일을 들 수 있다.
WG2에 관련된 「전자 흡인성 기」로서는, 상기 WG1의 전자 흡인 기와 동일한 것을 들 수 있다.
포스포라미데이트 화합물 (B)는, 2'위치의 수산기에 중성 조건하에서 탈리 가능한 에테르형 보호기를 갖는 포스포라미데이트 화합물이다. 또한, 2'위치의 수산기에 도입된 기가 직쇄형의 치환기이고, 3'위치의 수산기에 결합하는 인 원자 주위에 있어서의 입체가 군집하고 있지 않기 때문에, 종래부터 사용되고 있는 포스포라미데이트 화합물과 비교하여, 올리고 RNA를 합성할 때, 매우 단시간에 축합 반응이 진행되어, 축합 수율이 좋다고 하는 특징을 갖는다. 포스포라미데이트 화합물 (B)를 사용함으로써, 올리고 DNA의 제조와 동일한 수법을 이용하여, 고순도의 올리고 RNA (A)의 제조가 가능하다.
여기서, 「올리고 DNA」란, 디옥시리보핵산(DNA)만으로 이루어지는 올리고핵산을 말한다. 또한, 본 발명에 있어서 「올리고 RNA」란, 리보핵산(RNA) 및 디옥시리보핵산(DNA)으로 이루어지는 올리고핵산이며, 적어도 하나는 리보핵산(RNA)을 함유하는 올리고핵산을 말한다.
이하에 나타내는 제법에 있어서, 원료가 반응에 영향을 미치는 치환기(예컨대, 히드록시, 아미노, 카르복시)를 갖는 경우는, 원료를 미리 공지의 방법에 따라서, 적당한 보호기로 보호한 후에 반응을 행한다. 보호기는, 최종적으로, 접촉 환원, 알칼리 처리, 산 처리 등의 공지의 방법에 따라서 보호기를 탈리할 수 있다.
Ⅱ. 포스포라미데이트 화합물 (B)의 제법
포스포라미데이트 화합물 (B)는, 다음과 같이 하여 제조할 수 있다.
포스포라미데이트 화합물 (B)는, 공지 화합물 또는 용이하게 제조 가능한 중간체로부터, 예컨대, 다음 공정의 a∼공정 h의 조작을 실시함으로써 제조할 수 있다.
이하, 상세히 설명한다.
(1) 공정 a:
다음의 일반식 (12)로 표시되는 리보핵산 유도체에 알킬화 시약을 작용시킴으로써, 중성 조건하에서 탈리하는 에테르형 보호기를 2'위치의 수산기에 도입하는, 다음의 일반식 (13)으로 표시되는 리보핵산 유도체를 제조하는 공정.
[식 8]
Figure 112008065985566-PCT00008
일반식 (12), 일반식 (13) 및 일반식 (13') 중, Bz, R1, WG1은, 상기와 동일한 의미이다.
「알킬화 시약」으로서, 예컨대, 다음의 일반식 (14)로 표시되는 에테르 화합물을 들 수 있다.
[식 9]
Figure 112008065985566-PCT00009
일반식 (14) 중, L은 할로겐, 아릴티오기, 알킬술폭시드기 또는 알킬티오기를 나타낸다. WG1은 상기와 동일한 의미이다.
L에 관련된 「할로겐」, 「아릴티오기」의 「아릴」, 「알킬술폭시드기」 및 「알킬티오기」의 「알킬」로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 「할로겐」, 「아릴」, 「알킬」과 동일한 것을 들 수 있다.
에테르 화합물 (14)의 구체예로서는, 다음의 1∼2의 화합물을 들 수 있다.
1. 클로로메틸 2-시아노에틸에테르
2. 2-시아노에틸 메틸티오메틸에테르
에테르 화합물 (14)는, 중성 조건하에서 탈리 가능한 에테르형 치환기를, 2'위치의 수산기에 염기성 조건하에서 도입할 수 있는 신규의 알킬화 시약이며, 포스포라미데이트 화합물 (B)를 제조하기 위한 시약으로서 유용하다.
에테르 화합물 (14)는, 다음에 나타내는 공정 1∼공정 4를 실시함으로써 제조할 수 있다.
공정 1:
다음의 일반식 (15)로 표시되는 알코올 화합물을 알킬티오메틸화하여, 다음의 일반식 (16)으로 표시되는 화합물을 제조하는 공정.
[식 10]
Figure 112008065985566-PCT00010
일반식 (15) 및 일반식 (16) 중, WG1은 상기와 동일한 의미이다. R3은 알킬 또는 아릴을 나타낸다.
화합물 (16)은, L이 알킬티오기인 에테르 화합물 (14)이다.
R3에 관련된 「알킬」로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 「알킬」과 동일한 것을 들 수 있다.
R3이 메틸인 경우, 알킬티오메틸화 시약으로서는, 예컨대, 디메틸술폭시드, 무수초산 및 초산의 혼합 용액을 들 수 있다. 「디메틸술폭시드」의 사용량은, 화합물 (15)의 몰량에 대하여, 10∼200배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 20∼100배 몰량이다. 「초산」의 사용량은, 화합물 (15)의 몰량에 대하여, 10∼150배 몰량이 적당 하고, 바람직하게는 20∼100배 몰량이다. 「무수초산」의 사용량은, 화합물 (15)의 몰량에 대하여, 10∼150배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 20∼100배 몰량이다. 반응 온도는, 0℃∼100℃가 적당하다. 반응 시간은, 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 통상 1∼48시간이 적당하다.
공정 2:
화합물 (16)을 할로겐화하여, 다음의 일반식 (17)로 표시되는 화합물을 제조하는 공정.
[식 11]
Figure 112008065985566-PCT00011
일반식 (16) 및 일반식 (17) 중, WG1, R3은, 상기와 동일한 의미이다. X2는 할로겐을 나타낸다.
화합물 (17)은, 에테르 화합물 (14)에 있어서의 L이 할로겐인 화합물이다.
X2에 관련된 「할로겐」으로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 「할로겐」과 동일한 것을 들 수 있다.
본 공정은, 공지의 방법(예컨대, T. Benneche 등, Synthesis 762(1983))에 의해 실시할 수 있다. 사용하는 용매는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않으나, 예컨대, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 1,2-디클로로에탄 등의 할로겐계 탄화수소 등을 들 수 있다. 할로겐화 시약으로서는, 예컨대, 염화술푸릴, 옥시염화인을 들 수 있다. 「할로겐화 시약」의 사용량은, 화합물 (16)의 몰량에 대하여, 0.8∼20배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼10배 몰량이다. 반응 온도는, 0℃∼100℃가 적당하다. 반응 시간은, 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 통상 30분∼24시간이 적당하다.
공정 3:
화합물 (17)을 아릴티오화하여, 다음의 일반식 (18)로 표시되는 화합물을 제조하는 공정.
[식 12]
Figure 112008065985566-PCT00012
일반식 (17) 및 일반식 (18) 중, WG1, X2는 상기와 동일한 의미이다. R3a는 아릴을 나타낸다.
화합물 (18)은, 에테르 화합물 (14)에 있어서의 L이 아릴티오기인 화합물이다.
R3a에 관련된 「아릴」로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 「아릴」과 동일한 것을 들 수 있다.
본 공정은, 공지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 사용하는 용매는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않으나, 예컨대, 디클로로메탄, 아세토니트릴을 들 수 있다. 아릴티오화 시약으로서는, 예컨대, 티오페놀, 4-메틸벤젠티올을 들 수 있다. 「아릴티오화 시약」의 사용량은, 화합물 (17)의 몰량에 대하여, 0.8∼20배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼5배 몰량이다. 반응 온도는, 0℃∼100℃가 적당하다. 반응 시간은, 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 통상 1∼48시간이 적당하다.
공정 4:
화합물 (16)을 산화하여, 다음의 일반식 (19)로 표시되는 화합물을 제조하는 공정.
[식 13]
Figure 112008065985566-PCT00013
일반식 (16) 및 일반식 (19) 중, WG1, R3은, 상기와 동일한 의미이다.
화합물 (19)는, 에테르 화합물 (14)에 있어서의 L이 알킬술폭시드기인 화합물이다.
R3에 관련된 「알킬」로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 「알킬」과 동일한 것을 들 수 있다.
본 공정은, 공지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 사용하는 용매는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않으나, 예컨대, 디클로로메탄, 클로로포름, 메탄올을 들 수 있다. 산화제로서는, 예컨대, 메타클로로과안식향산, 메타과요오드산염, 과산화수소를 들 수 있다. 「산화제」의 사용량은, 화합물 (16)의 몰량에 대하여, 0.8∼10배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼2배 몰량이다. 반응 온도는, 0℃∼100℃가 적당하다. 반응 시간은, 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 통상 1∼48시간이 적당하다.
「알킬화 시약」으로서, 화합물 (17)을 사용하는 경우, 이하와 같이 실시할 수 있다.
본 공정은, 공지의 방법에 따라서, 시판품으로서 입수 가능하거나 또는 문헌에 기재된 방법에 따라서 합성 가능한 리보핵산 유도체 (12)에 알킬화 시약과 염기를 작용시킴으로써 실시할 수 있다. 사용하는 용매는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않으나, 예컨대, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 1,2-디클로로에탄 등의 할로겐계 탄화수소를 들 수 있다. 「알킬화 시약」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (12)의 몰량에 대하여, 0.8∼20배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼10배 몰량이다. 본 공정에서, 필요에 따라서, 리보핵산 유도체 (12)에 금속 시약과 염기를 작용시켜 제조되는 중간체를 경유한 후, 알킬화 시약을 작용시킬 수도 있다. 이러한 「금속 시약」으로서, 예컨대, 이염화디부틸주석을 들 수 있다. 「금속 시약」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (12)의 몰량에 대하여, 0.8∼20배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼10배 몰량이다. 「염기」로서는, 피리딘, 2,6-디메틸피리딘, 2,4,6-트리메틸피리딘, N-메틸이미다졸, 트리에틸아민, 트리부틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 등의 유기 염기 등을 들 수 있다. 「염기」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (12)의 몰량에 대하여, 0.8∼20배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼10배 몰량이다. 반응 온도는, 0℃∼120℃가 적당하다. 반응 시간은, 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 통상 30분∼24시간이 적당하다.
「알킬화 시약」으로서, 화합물 (16) 또는 화합물 (18)을 사용하는 경우, 이하와 같이 실시할 수 있다.
본 공정은, 공지의 방법(예컨대, M. Matteucci, Tetrahedron Letters, Vol.31, 2385(1990))에 따라서, 시판품으로서 입수 가능하거나 또는 문헌에 기재된 방법에 따라서 합성 가능한 리보핵산 유도체 (12)에, 알킬화 시약과 산과 유황 원자에 대한 할로겐화제를 작용시킴으로써 실시할 수 있다. 「알킬화 시약」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (12)의 몰량에 대하여, 0.8∼5배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼3배 몰량이다. 「산」으로서는, 예컨대, 트리플루오로메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산은, 트리메틸실릴트리플루오로메탄술포네이트를 들 수 있다. 「산」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (12)의 몰량에 대하여, 0.01∼20배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 0.02∼10배 몰량이다. 사용하는 용매는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않으나, 예컨대, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 벤젠, 톨루엔, 크실렌, THF, 아세토니트릴 또는 이들의 임의의 혼합 용매를 들 수 있다. 본 공정에서 사용하는 「유황 원자에 대한 할로겐화제」로서, 예컨대, N-브로모숙신이미드(NBS), N-요오드숙신이미드(NIS)를 들 수 있다. 「유황 원자에 대한 할로겐화제」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (12)의 몰량에 대하여, 0.8∼10배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼5배 몰량이다. 반응 온도는, -78℃∼30℃가 적당하다. 반응 시간은, 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 통상 5분∼5시간이 적당하다.
「알킬화 시약」으로서, 화합물 (19)를 사용하는 경우, 이하와 같이 실시할 수 있다.
본 공정은, 공지의 방법에 따라서, 시판품으로서 입수 가능하거나 또는 문헌에 기재된 방법에 따라서 합성 가능한 리보핵산 유도체 (12)에, 알킬화 시약과 산 무수물과 염기를 작용시킴으로써 실시할 수 있다. 「알킬화 시약」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (12)의 몰량에 대하여, 0.8∼5배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼3배 몰량이다. 「산 무수물」로서는, 예컨대, 트리플루오로메탄술폰산 무수물, 무수초산을 들 수 있다. 「산 무수물」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (12)의 몰량에 대하여, 0.01∼20배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 0.02∼10배 몰량이다. 염기로서는, 예컨대, 테트라메틸우레아, 콜리딘(collidine)을 들 수 있다. 「염기」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (12)의 몰량에 대하여, 0.01∼20배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 0.02∼10배 몰량이다. 사용하는 용매는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않으나, 예컨대, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 1,2-디클로로에탄 또는 이들의 임의의 혼합 용매를 들 수 있다. 반응 온도는, -78℃∼30℃가 적당하다. 반응 시간은, 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 통상 5분∼24시간이 적당하다.
(2) 공정 b:
공정 a에서 제조되는 리보핵산 유도체 (13)을 단리 정제하는 공정.
본 공정은, 공정 a에서 제조되는 혼합물로부터 통상의 분리 정제 수단, 예컨대, 박층 크로마토그래피, 실리카 겔 크로마토그래피 등의 수단을 이용함으로써 단리 정제할 수 있다.
(3) 공정 c:
공정 b와는 별도로, 다음의 일반식 (20)으로 표시되는 리보핵산 유도체에 알킬화 시약을 작용시킴으로써, 중성 조건하에서 탈리하는 에테르형 보호기를 2'위치의 수산기에 도입한, 다음의 일반식 (21)로 표시되는 리보핵산 유도체를 제조하는 공정.
[식 14]
Figure 112008065985566-PCT00014
일반식 (20) 및 일반식 (21) 중, Bz, WG1은, 상기와 동일한 의미이다.
A는, 다음의 일반식 (22a) 또는 일반식 (22b)로 표시되는 규소 치환기를 나타낸다.
[식 15]
Figure 112008065985566-PCT00015
일반식 (22a) 및 일반식 (22b) 중, R6은 알킬을 나타낸다.
R6에 관련된 「알킬」로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 「알킬」과 동일한 것을 들 수 있다.
「알킬화 시약」으로서는, 상기와 동일한 것을 들 수 있다.
「알킬화 시약」으로서, 화합물 (17)을 사용하는 경우, 이하와 같이 실시할 수 있다.
본 공정은, 공지의 방법에 따라서, 시판품으로서 입수 가능하거나 또는 문헌에 기재된 방법에 따라서 합성 가능한 리보핵산 유도체 (20)에 알킬화 시약과 염기를 작용시킴으로써 실시할 수 있다. 사용하는 용매는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않으나, 예컨대, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 1,2-디클로로에탄 등의 할로겐계 탄화수소 등을 들 수 있다. 「알킬화 시약」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (20)의 몰량에 대하여, 0.8∼20배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼10배 몰량이다. 본 공정에서, 필요에 따라서, 리보핵산 유도체 (20)에 금속 시약과 염기를 작용시켜 제조되는 중간체를 경유한 후, 알킬화 시약을 작용시킬 수도 있다. 이러한 「금속 시약」으로서, 예컨대, 이염화디부틸주석, tert-부틸마그네슘클로라이드를 들 수 있다. 「금속 시약」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (20)의 몰량에 대하여, 0.8∼20배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼10배 몰량이다. 「염기」로서는, 피리딘, 2,6-디메틸피리딘, 2,4,6-트리메틸피리딘, N-메틸이미다졸, 트리에틸아민, 트리부틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 등의 유기 염기 등을 들 수 있다. 「염기」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (20)의 몰량에 대하여, 0.8∼20배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼10배 몰량이다. 반응 온도는, 0℃∼120℃가 적당하다. 반응 시간은, 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 통상 30분∼24시간이 적당하다.
「알킬화 시약」으로서, 화합물 (16) 또는 화합물 (18)을 사용하는 경우, 이하와 같이 실시할 수 있다.
본 공정은, 공지의 방법(예컨대, M. Matteucci, Tetrahedron Letters, Vol.31, 2385(1990))에 따라서, 시판품으로서 입수 가능하거나 또는 문헌에 기재된 방법에 따라서 합성 가능한 리보핵산 유도체 (20)에, 알킬화 시약과 산과 유황 원자에 대한 할로겐화제를 작용시킴으로써 실시할 수 있다. 「알킬화 시약」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (20)의 몰량에 대하여, 0.8∼5배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼3배 몰량이다. 「산」으로서는, 예컨대, 트리플루오로메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산은, 트리메틸실릴트리플루오로메탄술포네이트를 들 수 있다. 「산」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (20)의 몰량에 대하여, 0.01∼20배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 0.02∼10배 몰량이다. 사용하는 용매는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않으나, 예컨대, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 벤젠, 톨루엔, 크실렌, THF, 아세토니트릴 또는 이들의 임의의 혼합 용매를 들 수 있다. 본 공정에서 사용하는 「유황 원자에 대한 할로겐화제」로서, 예컨대, N-브로모숙신이미드(NBS), N-요오드숙신이미드(NIS)를 들 수 있다.「유황 원자에 대한 할로겐화제」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (20)의 몰량에 대하여, 0.8∼10배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼5배 몰량이다. 반응 온도는, -78℃∼30℃가 적당하다. 반응 시간은, 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 통상 5분∼5시간이 적당하다.
「알킬화 시약」으로서, 화합물 (19)를 사용하는 경우, 이하와 같이 실시할 수 있다.
본 공정은, 공지의 방법에 따라서, 시판품으로서 입수 가능하거나 또는 문헌에 기재된 방법에 따라서 합성 가능한 리보핵산 유도체 (20)에, 알킬화 시약과 산 무수물과 염기를 작용시킴으로써 실시할 수 있다. 「알킬화 시약」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (20)의 몰량에 대하여, 0.8∼5배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼3배 몰량이다. 「산 무수물」로서는, 예컨대, 트리플루오로메탄술폰산 무수물, 무수초산을 들 수 있다. 「산 무수물」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (20)의 몰량에 대하여, 0.01∼20배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 0.02∼10배 몰량이다. 염기로서는, 예컨대, 테트라메틸우레아, 콜리딘을 들 수 있다. 「염기」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (20)의 몰량에 대하여, 0.01∼20배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 0.02∼10배 몰량이다. 사용하는 용매는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않으나, 예컨대, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 1,2-디클로로에탄 또는 이들의 임의의 혼합 용매를 들 수 있다. 반응 온도는, -78℃∼30℃가 적당하다. 반응 시간은, 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 통상 5분∼24시간이 적당하다.
(4) 공정 d:
공정 a∼공정 c와는 별도로, 리보핵산 유도체 (20)에 디메틸술폭시드와 초산과 무수초산을 작용시킴으로써, 다음의 일반식 (23)으로 표시되는 리보핵산 유도체를 제조하는 공정.
[식 16]
Figure 112008065985566-PCT00016
일반식 (20) 및 일반식 (23) 중, A, Bz는 상기와 동일한 의미이다.
본 공정은, 공지의 방법에 따라서, 시판품으로서 입수 가능하거나 또는 문헌에 기재된 방법에 따라서 합성 가능한 리보핵산 유도체 (20)에, 디메틸술폭시드와 초산과 무수초산을 작용시킴으로써 실시할 수 있다.
「디메틸술폭시드」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (20)의 몰량에 대하여, 10∼200배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 20∼100배 몰량이다. 「초산」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (20)의 몰량에 대하여, 10∼150배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 20∼100배 몰량이다. 「무수초산」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (20)의 몰량에 대하여, 10∼150배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 20∼100배 몰량이다. 반응 온도는, 10℃∼50℃가 적당하다. 반응 시간은, 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 통상 30분∼24시간이 적당하다.
(5) 공정 e:
공정 d에서 제조되는 리보핵산 유도체 (23)에 다음의 일반식 (24)로 표시되는 알코올 화합물과 산과 유황 원자에 대한 할로겐화제를 작용시킴으로써, 중성 조건하에서 탈리하는 에테르형 보호기를 2'위치의 수산기에 도입한, 다음의 일반식 (21)로 표시되는 리보핵산 유도체를 제조하는 공정.
[식 17]
Figure 112008065985566-PCT00017
일반식 (21), 일반식 (23) 및 일반식 (24) 중, A, Bz, WG1은 상기와 동일한 의미이다.
본 공정은, 공지의 방법에 따라서, 리보핵산 유도체 (23)에, 알코올 화합물 (24)와 산과 유황 원자에 대한 할로겐화제를 작용시킴으로써 실시할 수 있다.
사용하는 용매는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않으나, 예컨대, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 벤젠, 톨루엔, 크실렌, THF, 아세토니트릴 또는 이들의 임의의 혼합 용매를 들 수 있다. 「알코올 화합물 (24)」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (23)의 몰량에 대하여, 0.8∼20배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼10배 몰량이다. 「산」으로서는, 예컨대, 트리플루오로메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산은, 트리메틸실릴트리플루오로메탄술포네이트를 들 수 있다. 「유황 원자에 대한 할로겐화제」로서는, 예컨대, N-브로모숙신이미드(NBS), N-요오드숙신이미드(NIS)를 들 수 있다. 「유황 원자에 대한 할로겐화제」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (23)의 몰량에 대하여, 0.1∼20배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 0.2∼10배 몰량이다. 반응 온도는, -100℃∼20℃가 적당하다. 반응 시간은, 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 통상 5분∼12시간이 적당하다.
(6) 공정 f:
공정 c 또는 공정 e에서 제조되는 리보핵산 유도체 (21)의 3'위치와 5'위치의 수산기의 보호기를 탈리하는 반응을 행함으로써, 다음의 일반식 (25)로 표시되는 리보핵산 유도체를 제조하는 공정.
[식 18]
Figure 112008065985566-PCT00018
일반식 (21) 및 일반식 (25) 중, A, Bz, WG1은, 상기와 동일한 의미이다.
본 공정은, 리보핵산 유도체 (21)을 유기 용매에 용해하고, 불소화제 단독 또는 불소화제와 산(예컨대, 초산, 염산, 황산)을 임의의 혼합비의 혼합 시약으로서 반응시킴으로써 실시할 수 있다. 본 공정에 사용할 수 있는 「불소화제」로서는, 예컨대, 불화암모늄, TBAF, 트리에틸아민트리히드로플루오라이드, 불화수소피리딘을 들 수 있다. 「불소화제」의 사용량으로서는, 리보핵산 유도체 (21)의 몰량에 대하여, 0.1∼20배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 0.2∼10배 몰량이다. 반응 온도는, 0℃∼120℃가 적당하다. 반응 시간은, 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 통상 30분∼24시간이 적당하다.
혼합 시약에 있어서의 불소화제와 산과의 혼합비는, 1:2∼1:0.1(불소화제:산)이 적당하고, 1:1.2∼1:1이 바람직하다.
(7) 공정 g:
공정 f에서 제조되는 리보핵산 유도체 (25)의 5'위치의 수산기에 산성 조건하에서 탈리하는 보호기 (R1)을 도입하는, 리보핵산 유도체 (13)을 제조하는 공정.
[식 19]
Figure 112008065985566-PCT00019
일반식 (13) 및 일반식 (25) 중, Bz, R1, WG1은, 상기와 동일한 의미이다. X3은, 할로겐을 나타낸다.
X3에 관련된 「할로겐」으로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 「할로겐」과 동일한 것을 들 수 있다.
본 공정은, 공지의 방법에 따라서, 리보핵산 유도체 (25)에 R1X3을 작용시킴으로써 실시할 수 있다. R1X3의 사용량은, 리보핵산 유도체 (25)의 몰량에 대하여, 0.8∼20배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼10배 몰량이다. 사용하는 용매는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않으나, 예컨대, 아세토니트릴, THF를 들 수 있다. 「염기」로서는, 피리딘, 2,6-디메틸피리딘, 2,4,6-트리메틸피리딘, N-메틸이미다졸, 트리에틸아민, 트리부틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 등의 유기 염기를 들 수 있다. 「염기」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (25)의 몰량에 대하여, 0.8∼20배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼10배 몰량이다. 반응 온도는, 0℃∼120℃가 적당하다. 반응 시간은, 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 통상 30분∼24시간이 적당하다.
(8) 공정 h:
공정 b 또는 공정 f에서 제조되는 리보핵산 유도체 (13)에 포스포라미데이트화 시약과, 필요에 따라서 활성화제를 작용시킴으로써, 3'위치의 수산기가 포스포라미데이트화된 포스포라미데이트 화합물 (B)를 제조하는 공정.
[식 20]
Figure 112008065985566-PCT00020
일반식 (13) 및 일반식 (B) 중, Bz, R1, R2a, R2b, WG1, WG2는, 상기와 동일한 의미이다.
「포스포라미데이트화 시약」으로서는, 예컨대, 다음의 일반식 (26a), 일반식 (26b)로 표시되는 화합물을 들 수 있다.
[식 21]
Figure 112008065985566-PCT00021
일반식 (26a) 및 일반식 (26b) 중, R2a, R2b, WG2는, 상기와 동일한 의미이다. X1은, 할로겐을 나타낸다.
X1에 관련된 「할로겐」으로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 「할로겐」과 동일한 것을 들 수 있다.
본 공정은, 리보핵산 유도체 (13)에 포스포라미데이트 시약을 작용시켜, 3'위치의 수산기를 포스포라미데이트화하는 반응이며, 공지의 방법에 따라서 실시할 수 있다. 필요에 따라서, 활성화제를 사용할 수도 있다. 사용하는 용매는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않으나, 예컨대, 아세토니트릴, THF를 들 수 있다.
「포스포라미데이트화 시약」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (13)의 몰량에 대하여, 0.8∼20배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼10배 몰량이다. 「활성화제」로서는, 예컨대, 1H-테트라졸, 5-에틸티오테트라졸, 5-벤질메르캅토-1H-테트라졸, 4,5-디클로로이미다졸, 4,5-디시아노이미다졸, 벤조트리아졸트리플레이트, 이미다졸트리플레이트, 피리디늄트리플레이트, N,N-디이소프로필에틸아민, 2,4,6-콜리딘/N-메틸이미다졸을 들 수 있다. 「활성화제」의 사용량은, 리보핵산 유도체 (13)의 몰량에 대하여, 0.8∼20배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼10배 몰량이다. 반응 온도는, 0℃∼120℃가 적당하다. 반응 시간은, 사용하는 원료의 종류, 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 통상 30분∼24시간이 적당하다.
이렇게 해서 제조되는 포스포라미데이트 화합물 (B)는, 그 자체 공지의 수단, 예컨대, 농축, 액성 변환, 전용(轉溶), 용매 추출, 결정화, 재결정, 분류, 크로마토그래피 등에 의해 분리 정제할 수 있다.
Ⅲ. 올리고 RNA (A)의 제조 방법
올리고 RNA (A)의 제조 방법에 대해서, 이하에 상세히 서술한다.
[식 22]
Figure 112008065985566-PCT00022
일반식 (A) 중, 각 B, 각 Q, 각 R은, 각각 독립적으로, 상기와 동일한 의미이다. n, Z는, 상기와 동일한 의미이다.
올리고 RNA (A)의 제법은, 공지의 방법에 따라서 행할 수 있으나, 예컨대, 다음에 나타내는 공정 A∼공정 H의 조작을 실시함으로써, 단계적으로 3'로부터 5'의 방향으로 핵산 모노머 화합물을 축합함으로써 행할 수 있다.
하기 공정에 사용되고 있는 화합물 및 시약 중, 포스포라미데이트 화합물 (B) 이외에 대해서는, 올리고 RNA 또는 올리고 DNA의 합성에 일반적으로 사용되고 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 또한, 기존의 핵산 합성 시약을 이용한 경우와 마찬가지로, 모든 공정을 매뉴얼 또는 시판의 DNA 자동 합성기를 이용하여 제조할 수 있다. 자동 합성기로 행함으로써 조작법의 간편화, 또한 합성의 정확성의 점에서 자동 합성기를 이용하는 방법이 바람직하다. 또한, 하기 공정 A∼공정 H에 기재되어 있는 화합물 및 시약 중, 핵산 모노머 화합물 이외에 대해서는, 올리고 DNA 또는 올리고 RNA의 합성에 일반적으로 사용되고 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다.
또한, 올리고 RNA (A)의 제조 방법에 있어서, 핵산 모노머 화합물로서 적어도 1회는 포스포라미데이트 화합물 (B)를 사용함으로써, 각 R 중 적어도 하나가 수산기인 올리고 RNA (A)를 제조할 수 있다. 또한, 예컨대, 후기하는 공정 B에 있어서, 핵산 모노머 화합물로서, 모두 포스포라미데이트 화합물 (B)를 사용함으로써 각 R이 모두 수산기인 올리고 RNA (A)를 제조할 수 있다.
(1) 공정 A:
다음의 일반식 (1)로 표시되는 (올리고)핵산 유도체에 산을 작용시킴으로써, 5'위치의 수산기의 보호기를 탈리하여, 다음의 일반식 (2)로 표시되는 (올리고)핵산 유도체를 제조하는 공정.
[식 23]
Figure 112008065985566-PCT00023
일반식 (1) 및 일반식 (2) 중, n, R1은 상기와 동일한 의미이다. 각 Q, 각 R4, 각 WG2는, 각각 독립적으로, 상기와 동일한 의미이다. 각 Bx는, 각각 독립적으로, 보호기를 갖고 있어도 좋은 핵산 염기 또는 그 수식체를 나타낸다.
E는, 아실 또는 다음의 일반식 (5)로 표시되는 치환기를 나타낸다.
[식 24]
-E1-링커-고상담체 (5)
일반식 (5) 중, E1은, 단결합 또는 다음의 일반식 (6)으로 표시되는 치환기를 나타낸다.
[식 25]
Figure 112008065985566-PCT00024
일반식 (6) 중, Q, WG2는, 상기와 동일한 의미이다.
T는, H, 아실옥시, 할로겐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 디알킬아미노, 알케닐옥시, 알케닐티오, 알케닐아미노, 디알케닐아미노, 알키닐옥시, 알키닐티오, 알키닐아미노, 디알키닐아미노, 알콕시알킬옥시, 상기 일반식 (4)로 표시되는 치환기 또는 상기 일반식 (5)로 표시되는 치환기를 나타낸다. 단, E 또는 T 중 어느 한쪽은 치환기 (5)를 나타낸다.
Bx에 관련된 「핵산 염기」로서는, 핵산의 합성에 사용되는 것이면 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 시토신, 우라실, 티민 등의 피리미딘 염기, 아데닌, 구아닌 등의 푸린 염기를 들 수 있다.
Bx에 관련된 「핵산 염기」는, 보호되어 있어도 좋으며, 그 중에서도 아미노기를 갖는 핵산 염기, 예컨대, 아데닌, 구아닌, 시토신은, 아미노기가 보호되어 있는 것이 바람직하다.
이러한 「아미노기의 보호기」로서는, 핵산의 보호기로서 사용되는 것이면 특별히 제한되지 않고, 구체적으로는, 예컨대, 벤조일, 4-메톡시벤조일, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 페닐아세틸, 페녹시아세틸, 4-tert-부틸페녹시아세틸, 4-이소프로필페녹시아세틸, (디메틸아미노)메틸렌을 들 수 있다.
Bx의 「수식체」란, 핵산 염기가 임의의 치환기로 치환되어 있는 기이며, Bx의 「수식체」에 관련된 치환기로서는, 예컨대, 할로겐, 아실, 알킬, 아릴알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 히드록시, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 카르복시, 시아노, 니트로를 들 수 있고, 이들이 임의의 위치에 1∼3개 치환되어 있다.
Bx의 수식체에 관련된 「할로겐」, 「아실」, 「알킬」, 「아릴알킬」, 「알콕시」, 「알콕시알킬」, 「모노알킬아미노」, 「디알킬아미노」로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 그들과 동일한 것을 들 수 있다.
E에 관련된 「아실」로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 「아실」과 동일한 것을 들 수 있다.
T의 「아실옥시」에 관련된 「아실」 부분으로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 「아실」과 동일한 것을 들 수 있다.
T에 관련된 「할로겐」, 「알콕시」, 「알킬아미노」 및 「디알킬아미노」로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 그들과 동일한 것을 들 수 있다.
T에 관련된 「알콕시알킬옥시」 및 「알킬티오」의 「알킬」 부분으로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 「알킬」과 동일한 것을 들 수 있다.
T에 관련된 「알콕시알킬옥시」의 「알콕시」 부분으로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 「알콕시」와 동일한 것을 들 수 있다.
T에 관련된 「알케닐옥시」, 「알케닐티오」, 「알케닐아미노」, 「디알케닐아미노」의 「알케닐」 부분으로서는, 상기 R에 관련된 「알케닐」과 동일한 것을 들 수 있다.
T에 관련된 「알키닐옥시」, 「알키닐티오」, 「알키닐아미노」, 「디알키닐아미노」의 「알키닐」 부분으로서는, 상기 R에 관련된 「알키닐」과 동일한 것을 들 수 있다.
T에 관련된 「알킬아미노」, 「알케닐아미노」, 「알키닐아미노」는 보호되어 있어도 좋으며, 이러한 보호기는 아미노기의 보호기로서 사용되는 것이면 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 트리플루오로아세틸, 벤조일, 4-메톡시벤조일, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 페닐아세틸, 페녹시아세틸, 4-tert-부틸페녹시아세틸, 4-이소프로필페녹시아세틸, (디메틸아미노)메틸렌을 들 수 있다. 특히, 트리플루오로아세틸이 바람직하다.
본 공정은, 고상 담체에 담지되어 있는 다음의 일반식 (27a), 일반식 (27b)로 표시되는 핵산 유도체(n=1인 핵산 유도체 (1)), 또는, 공정 A∼공정 D의 조작을 행함으로써 제조되는 고상 담체에 담지되어 있는 올리고 RNA 혹은 올리고 DNA(n=2∼100인 올리고핵산 유도체 (1))(이하, 「고상 담체에 담지되어 있는 올리고핵산 유도체」로 칭함)에 산을 작용시킴으로써 실시할 수 있다.
[식 26]
Figure 112008065985566-PCT00025
일반식 (27a) 및 일반식 (27b) 중, BX, R1은, 상기와 동일한 의미이다. R2L, R4L은, 치환기 (5)를 나타낸다. R2는, 아실옥시를 나타낸다. R4a는, H, 아실옥시, 할로겐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 디알킬아미노, 알케닐옥시, 알케닐티오, 알케닐아미노, 디알케닐아미노, 알키닐옥시, 알키닐티오, 알키닐아미노, 디알키닐아미노, 알콕시알킬옥시 또는 치환기 (4)를 나타낸다.
R2, R4a의 「아실옥시」에 관련된 「아실」로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 「아실」과 동일한 것을 들 수 있다.
R4a에 관련된 「할로겐」, 「알콕시」, 「알킬아미노」 및 「디알킬아미노」로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 그들과 동일한 것을 들 수 있다.
R4a에 관련된 「알콕시알킬옥시」 및 「알킬티오」의 「알킬」 부분으로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 「알킬」과 동일한 것을 들 수 있다.
R4a에 관련된 「알콕시알킬옥시」의 「알콕시」 부분으로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 「알콕시」와 동일한 것을 들 수 있다.
R4a에 관련된 「알케닐옥시」, 「알케닐티오」, 「알케닐아미노」, 「디알케닐아미노」의 「알케닐」 부분으로서는, 상기 R에 관련된 「알케닐」과 동일한 것을 들 수 있다.
R4a에 관련된 「알키닐옥시」, 「알키닐티오」, 「알키닐아미노」, 「디알키닐아미노」의 「알키닐」 부분으로서는, 상기 R에 관련된 「알키닐」과 동일한 것을 들 수 있다.
R4a에 관련된 「알킬아미노」, 「알케닐아미노」, 「알키닐아미노」는 보호되어 있어도 좋으며, 이러한 보호기는 아미노기의 보호기로서 사용되는 것이면 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 트리플루오로아세틸, 벤조일, 4-메톡시벤조일, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 페닐아세틸, 페녹시아세틸, 4-tert-부틸페녹시아세틸, 4-이소프로필페녹시아세틸, (디메틸아미노)메틸렌을 들 수 있다. 특히, 트리플루오로아세틸이 바람직하다.
「고상 담체」로서는, 예컨대, 정공 유리(controlled pore glass; CPG), 옥사릴화-정공 유리(예컨대, Alul 등, Nucleic Acids Research, Vol.19, 1527(1991)을 참조), TentaGel 지지체-아미노폴리에틸렌글리콜 유도체화 지지체(예컨대, Wright 등, Tetrahedron Letters, Vol.34, 3373(1993)을 참조), Poros-폴리스티렌/디비닐벤젠의 코폴리머를 들 수 있다.
「링커」로서는, 예컨대, 3-아미노프로필, 숙시닐, 2,2'-디에탄올술포닐, 롱 체인 알킬아미노(LCAA)를 들 수 있다.
핵산 유도체 (27a), 핵산 유도체 (27b)는, 공지의 방법에 따라서 제조되거나 또는 시판품으로서 입수할 수 있는 고상 담체에 담지되어 있는 핵산 유도체이며, 바람직한 형태로서는, 예컨대, 다음의 일반식 (28) 및 일반식 (29)로 표시되는 핵산 유도체를 들 수 있다.
[식 27]
Figure 112008065985566-PCT00026
일반식 (28) 및 일반식 (29) 중, BX, Q, R1, R4, WG2는, 상기와 동일한 의미이다.
R4가 치환기 (4)인 핵산 유도체 (28) 및 (29)는, 포스포라미데이트 화합물 (B)로부터 공지의 방법에 따라서 제조할 수 있다.
본 공정에 사용할 수 있는 「산」으로서는, 예컨대, 트리플루오로초산, 디클로로초산, 트리클로로초산을 들 수 있다. 본 공정에 사용할 수 있는 산은, 1∼5%의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석하여 사용할 수도 있다. 용매로서는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않으나, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 물 또는 이들의 임의의 혼합 용매를 들 수 있다. 상기 반응에 있어서의 반응 온도는, 20℃∼50℃가 바람직하다. 반응 시간은, 올리고핵산 유도체 (1)의 종류, 사용하는 산의 종류, 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 통상 1분∼1시간이 적당하다. 사용하는 시약의 양은 고상 담체에 담지되어 있는 (올리고)핵산 유도체에 대하여 0.8∼100배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼10배 몰량이다.
(2) 공정 B:
공정 A에서 제조되는 (올리고)핵산 유도체 (2)에, 활성화제를 이용하여 핵산 모노머 화합물을 축합시켜, 다음의 일반식 (7)로 표시되는 올리고핵산 유도체를 제조하는 공정.
[식 28]
Figure 112008065985566-PCT00027
일반식 (2) 및 일반식 (7) 중, 각 BX, 각 Q, 각 R4, 각 WG2는, 각각 독립적으로, 상기와 동일한 의미이다. E, n, R1, T는, 상기와 동일한 의미이다.
본 공정은, 고상 담체에 담지되어 있는 올리고핵산 유도체에 핵산 모노머 화합물과 활성화제를 작용시킴으로써 실시할 수 있다.
「핵산 모노머 화합물」로서는, 포스포라미데이트 화합물 (B) 또는 다음의 일반식 (30)으로 표시되는 핵산 유도체를 들 수 있다.
[식 29]
Figure 112008065985566-PCT00028
일반식 (30) 중, R1, R2a, R2b, R4a, WG2는, 상기와 동일한 의미이다. BY는, 보호기를 갖고 있어도 좋은 핵산 염기 또는 그 수식체를 나타낸다.
BY에 관련된 「핵산 염기」로서는, 핵산의 합성에 사용되는 것이면 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 시토신, 우라실, 티민 등의 피리미딘 염기, 아데닌, 구아닌 등의 푸린 염기를 들 수 있다.
BY에 관련된 「핵산 염기」는, 보호되어 있어도 좋으며, 그 중에서도 아미노기를 갖는 핵산 염기, 예컨대, 아데닌, 구아닌, 시토신은, 아미노기가 보호되어 있는 것이 바람직하다.
이러한 「아미노기의 보호기」로서는, 핵산의 보호기로서 사용되는 것이면 특별히 제한되지 않고, 구체적으로는, 예컨대, 벤조일, 4-메톡시벤조일, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 페닐아세틸, 페녹시아세틸, 4-tert-부틸페녹시아세틸, 4-이소프로필페녹시아세틸, (디메틸아미노)메틸렌을 들 수 있다.
BY의 「수식체」란, 핵산 염기가 임의의 치환기로 치환되어 있는 기이며, BY의 「수식체」에 관련된 치환기로서는, 예컨대, 할로겐, 아실, 알킬, 아릴알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 히드록시, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 카르복시, 시아노, 니트로를 들 수 있고, 이들이 임의의 위치에 1∼3개 치환되어 있다.
BY의 수식체에 관련된 「할로겐」, 「아실」, 「알킬」, 「아릴알킬」, 「알콕시」, 「알콕시알킬」, 「모노알킬아미노」, 「디알킬아미노」로서는, 상기 B의 수식체에 관련된 그들과 동일한 것을 들 수 있다.
「활성화제」로서는, 상기와 동일한 것을 들 수 있다.
반응 용매로서는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않으나, 예컨대, 아세토니트릴, THF를 들 수 있다. 상기 반응에 있어서의 반응 온도는, 20℃∼50℃가 바람직하다. 반응 시간은, 올리고핵산 유도체 (2)의 종류, 사용하는 활성화제의 종류, 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 통상 1분∼1시간이 적당하다. 사용하는 시약의 양은 고상 담체에 담지되어 있는 올리고핵산 유도체에 대하여 0.8∼100배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼10배 몰량이다.
(3) 공정 C:
공정 B에서 미반응인 (올리고)핵산 유도체 (2)의 5'위치의 수산기를 캡핑(capping)하는 공정.
[식 30]
Figure 112008065985566-PCT00029
일반식 (2) 및 일반식 (8) 중, 각 BX, 각 Q, 각 R4, 각 WG2는, 각각 독립적으로, 상기와 동일한 의미이다. E, n, T는, 상기와 동일한 의미이다. R5는, 메틸, 페녹시메틸, tert-부틸페녹시메틸을 나타낸다.
본 공정은, 공정 B에 있어서 미반응이던 5'위치의 수산기를 보호하는 반응 이며, 고상 담체에 담지되어 있는 올리고핵산 유도체에 캡화제를 작용함으로써 실시할 수 있다.
「캡화제(capping agent)」로서는, 예컨대, 무수초산, 페녹시초산 무수물 또는 tert-부틸페녹시초산 무수물을 들 수 있다. 캡화제는, 0.05∼1 M의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석하여 사용할 수도 있다. 용매로서는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않으나, 피리딘, 디클로로메탄, 아세토니트릴, THF 또는 이들의 임의의 혼합 용매를 들 수 있다. 또한, 본 공정에 있어서 필요에 따라서, 「반응 촉진제」로서, 예컨대, 4-디메틸아미노피리딘, N-메틸이미다졸을 사용할 수 있다. 상기 반응에 있어서의 반응 온도는, 20℃∼50℃가 바람직하다. 반응 시간은, 올리고핵산 유도체 (2)의 종류, 사용하는 캡화제의 종류, 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 통상 1분∼30분이 적당하다. 사용하는 시약의 양은 고상 담체에 담지되어 있는 올리고핵산 유도체에 대하여 0.8∼100배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼10배 몰량이다.
(4) 공정 D:
공정 B에서 제조되는 올리고핵산 유도체 (7)에 산화제를 작용시킴으로써 아인산기를 인산기 또는 티오인산기로 변환하는 공정.
[식 31]
Figure 112008065985566-PCT00030
일반식 (7) 및 일반식 (9) 중, 각 BX, 각 Q, 각 R4, 각 WG2는, 각각 독립적으로, 상기와 동일한 의미이다. E, n, R1, T는, 상기와 동일한 의미이다.
본 공정은, 3가의 인으로부터 5가의 인으로 산화제를 사용하여 변환하는 반응이며, 고상 담체에 담지되어 있는 올리고핵산 유도체에 산화제를 작용시킴으로써 실시할 수 있다.
인을 산소로 산화하는 경우에는, 「산화제」로서, 예컨대, 요오드, tert-부틸히드로퍼옥사이드를 사용할 수 있다. 상기 산화제는, 0.05∼2 M의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석하여 사용할 수 있다. 반응에 사용하는 용매로서는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않으나, 피리딘, THF, 물 또는 이들의 임의의 혼합 용매를 들 수 있다. 예컨대, 요오드/물/피리딘-THF 또는 요오드/피리딘-초산이나 과산화제(tert-부틸히드로퍼옥사이드/메틸렌클로라이드 등)를 이용할 수 있다.
또한, 인을 유황으로 산화하는 경우에는, 「산화제」로서, 예컨대, 유황, Beaucage 시약(3H-1,2-벤조디티올-3-온-1,1-디옥사이드), 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온(ADTT)을 사용할 수 있다. 상기 산화제는, 0.01∼2 M의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석하여 사용할 수 있다. 반응에 사용하는 용매로서는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않으나, 예컨대, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 피리딘 또는 이들의 임의의 혼합 용매를 들 수 있다.
반응 온도는, 20℃∼50℃가 바람직하다. 반응 시간은, 올리고핵산 유도체 (7)의 종류, 사용하는 산화제의 종류, 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 통상 1분∼30분이 적당하다. 사용하는 시약의 양은 고상 담체에 담지되어 있는 올리고핵산 유도체에 대하여 0.8∼100배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 10∼50배 몰량이다.
(5) 공정 E:
공정 D에서 제조되는 올리고핵산 유도체 (9)를 고상 담체로부터 분리하고, 각 핵산 염기부 및 각 인산기의 보호기를 탈리하는 공정.
[식 32]
Figure 112008065985566-PCT00031
일반식 (9) 및 일반식 (10) 중, 각 B, 각 BX, 각 Q, 각 R4, 각 WG2는, 각각 독립적으로, 상기와 동일한 의미이다. E, n, R, R1, T, Z는, 상기와 동일한 의미이다.
분리 공정은, 원하는 사슬 길이의 올리고 RNA를 분리제에 의해. 고상 담체 및 링커로부터 떼어내는 반응이며, 원하는 사슬 길이의 올리고핵산 유도체가 담지된 고체 담체에 분리제를 첨가함으로써 실시할 수 있다. 본 공정에 있어서, 핵산 염기부의 보호기를 탈리할 수 있다.
「분리제」로서는, 예컨대, 농축 암모니아수, 메틸아민을 들 수 있다. 본 공정에 사용할 수 있는 「분리제」는, 예컨대, 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알코올, 아세토니트릴, THF 또는 이들의 임의의 혼합 용매로 희석하여 사용할 수도 있다. 그 중에서도, 에탄올이 바람직하다.
반응 온도는, 15℃∼75℃가 적당하고, 바람직하게는 15℃∼30℃이며, 보다 바람직하게는 18℃∼25℃이다. 탈(脫)보호 반응 시간은, 올리고핵산 유도체 (9)의 종류, 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 10분∼30시간이 적당하고, 바람직하게는 30분∼24시간이며, 보다 바람직하게는 1∼4시간이다. 탈보호에 사용되는 용액 중의 수산화암모늄의 농도는, 20∼30 중량%가 적당하고, 바람직하게는 25∼30 중량%이며, 보다 바람직하게는 28∼30 중량%이다. 사용하는 시약의 양은, 고상 담체에 담지되어 있는 올리고핵산 유도체에 대하여 1∼100배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 10∼50배 몰량이다.
(6) 공정 F:
다음의 일반식 (10)으로 표시되는 올리고핵산 유도체에, TBAF를 작용시켜, 각 리보오스의 2'위치 수산기의 보호기를 탈리하는 공정에 있어서, THF를 함유하고 있어도 좋은, 술폭시드계 용매 혹은 아미드계 용매 또는 이들의 혼합 용매를 반응용매로서 이용함으로써, 다음의 일반식 (11)로 표시되는 올리고핵산 유도체를 제조하는 공정.
[식 33]
Figure 112008065985566-PCT00032
일반식 (10) 및 일반식 (11) 중, 각 B, 각 Q, 각 R, 각 R4는, 각각 독립적으로, 상기와 동일한 의미이다. n, R1, Z는, 상기와 동일한 의미이다.
본 공정은, 올리고핵산 유도체 (10)에 TBAF를 작용시킴으로써 실시할 수 있다. 사용하는 TBAF의 양은 제거되는 보호기에 대하여 1∼500배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 5∼10배 몰량이다. 반응 용매로서, THF를 함유하고 있어도 좋은, 술폭시드계 용매 혹은 아미드계 용매 또는 이들의 혼합 용매를 사용할 수 있다. 또한, 술폭시드계 용매 혹은 아미드계 용매 또는 이들의 혼합 용매를 THF와의 혼합 용매로서 사용하는 경우, 술폭시드계 용매 혹은 아미드계 용매 또는 이들의 혼합 용매에 대한 THF의 사용량은, 0∼95%가 적당하고, 바람직하게는 0∼50%이다. 「THF를 함유하고 있어도 좋은, 술폭시드계 용매 혹은 아미드계 용매 또는 이들의 혼합 용매(반응 용매)」의 사용량은, 올리고핵산 유도체 (10)의 종류나 사용하는 반응 용매 등에 따라서 다르지만, TBAF에 대하여, 0.8∼100배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼10배 몰량이다. 반응 온도는, 올리고핵산 유도체 (10)의 종류나 사용하는 반응 용매 등에 따라서 다르지만, 20℃∼80℃가 바람직하다. 반응 시간은, 올리고핵산 유도체 (10), 사용하는 반응 용매나 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 통상 1시간∼100시간이 적당하다.
또한, 필요하다면, 본 공정에 있어서의 부생성물인 아크릴로니트릴을 포착하기 위해서, 아크릴로니트릴의 포착제로서, 예컨대, 니트로알칸, 알킬아민, 아미딘, 티올, 티올 유도체 또는 이들의 임의의 혼합물을 첨가할 수 있다. 「니트로알칸」으로서는, 직쇄형의 탄소수 1∼6의 니트로알칸을 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 니트로메탄을 들 수 있다. 예컨대, 「알킬아민」으로서는, 예컨대, 직쇄형의 탄소수 1∼6의 알킬아민을 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 메틸아민, 에틸아민, n-프로필아민, n-부틸아민, n-펜틸아민, n-헥실아민을 들 수 있다. 「아미딘」으로서는, 예컨대, 벤즈아미딘, 포름아미딘을 들 수 있다. 「티올」로서는, 예컨대, 직쇄형의 탄소수 1∼6의 티올을 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 메탄티올, 에탄티올, 1-프로판티올, 1-부탄티올, 1-펜탄티올, 1-헥산티올을 들 수 있다. 「티올 유도체」로서는, 예컨대, 동일하거나 또는 다른 직쇄형의 탄소수 1∼6의 알킬티올기를 갖는 알코올 또는 에테르를 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 2-메르캅토에탄올, 4-메르캅토-1-부탄올, 6-메르캅토-1-헥사놀, 메르캅토메틸에테르, 2-메르캅토에틸에테르, 3-메르캅토프로필에테르, 4-메르캅토부틸에테르, 5-메르캅토펜틸에테르, 6-메르캅토헥실에테르를 들 수 있다.
「아크릴로니트릴의 포착제」의 사용량으로서는, 올리고핵산 유도체 (10)의 종류 등에 따라서 다르지만, 올리고핵산 유도체 (10)의 각 리보오스의 2'위치 수산기를 보호하고 있는 2-시아노에톡시메틸에 대하여, 0.1∼500배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼10배 몰량이다.
(7) 공정 G:
올리고핵산 유도체 (11)의 5'위치의 수산기를 탈리하는 공정.
[식 34]
Figure 112008065985566-PCT00033
일반식 (11) 및 일반식 (A) 중, 각 B, 각 Q, 각 R은, 각각 독립적으로, 상기와 동일한 의미이다. n, R1, Z는, 상기와 동일한 의미이다.
본 공정은, 최종적으로 올리고 RNA의 5'위치 수산기의 보호기를 탈리하는 반응이며, 고체 담체로부터 분리된 올리고 RNA에 산을 작용시킴으로써 실시할 수 있다.
본 공정에서 사용할 수 있는 「산」으로서는, 예컨대, 트리클로로초산, 디클로로초산, 초산을 들 수 있다. 본 공정에 사용할 수 있는 산은, 적당한 용매로 희석하여 사용할 수도 있다. 용매로서는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않으나, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 물, pH가 2∼5인 완충액 또는 이들의 임의의 혼합 용매를 들 수 있다. 완충액으로서는, 예컨대, 초산 완충액을 들 수 있다. 상기 반응에 있어서의 반응 온도는, 20℃∼50℃가 바람직하다. 반응 시간은, 올리고핵산 유도체 (11)의 종류, 사용하는 산의 종류, 반응 온도 등에 따라서 다르지만, 통상 1분∼1시간이 적당하다. 사용하는 시약의 양은 고상 담체에 담지되어 있는 올리고핵산 유도체에 대하여 0.8∼100배 몰량이 적당하고, 바람직하게는 1∼10배 몰량이다.
(8) 공정 H:
공정 G에서 제조되는 올리고 RNA (A)를 분리 정제하는 공정.
「분리 정제 공정」이란, 상기 반응 혼합물로부터 통상의 분리 정제 수단, 예컨대, 추출, 농축, 중화, 여과, 원심 분리, 재결정, C8로부터 C18의 역상 칼럼크로마토그래피, C8로부터 C18 역상 카트리지 칼럼, 양이온 교환 칼럼크로마토그래피, 음이온 교환 칼럼크로마토그래피, 겔 여과 칼럼크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 투석, 한외 여과 등의 수단을 단독 또는 조합하여 이용함으로써, 원하는 올리고 RNA를 단리 정제하는 공정이다.
「용출 용매」로서는, 예컨대, 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알코올, 물의 단독 용매 또는 임의의 비율의 혼합 용매를 들 수 있다. 이 경우 첨가물로서, 예컨대, 인산나트륨, 인산칼륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 초산암모늄, 초산트리에틸암모늄, 초산나트륨, 초산칼륨, 트리스염산, 에틸렌디아민사초산을 1 mM∼2 M의 농도로 첨가하여, 용액의 pH를 1∼9의 범위에서 조정할 수도 있다.
공정 A∼공정 D의 조작을 반복함으로써, 원하는 사슬 길이의 올리고 RNA (A)를 제조할 수 있다. 또, 본 제법에 있어서 올리고 RNA (A)를 제조하기 위한 출발 원료로서, R4a가 치환기 (4)인 화합물 (27a), R4a가 H 혹은 아실옥시인 핵산 유도체 (27a), 또는 R2가 아실인 핵산 유도체 (27b) 등을 사용할 수 있다. 단, 출발 원료로서, R4a가 H 혹은 아실옥시인 핵산 유도체 (27a), 또는 R2가 아실옥시인 핵산 유도체 (27b)를 사용한 경우, 핵산 모노머 화합물로서, 적어도 하나는 본 발명의 포스포라미데이트 화합물을 사용할 필요가 있다.
이하에 참고예, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들에만 한정되지 않는다.
참고예 1 클로로메틸 2- 시아노에틸에테르
공정 1 메틸티오메틸 2- 시아노에틸에테르의 제조
3-히드록시프로피오니트릴 32 g(450 mmol)을 디메틸술폭시드 450 ml에 용해하고, 무수초산 324 mL, 초산 231 mL를 첨가하여 실온에서 24시간 교반하였다. 탄산수소나트륨 990 g을 물 4.5 L에 용해한 것을 조제하고, 이것에 반응액을 1시간에 걸쳐서 적하하였다. 그대로 1시간 교반하고, 반응액을 초산에틸로 추출하며, 무수황산마그네슘으로 건조하고, 용매를 증류 제거해서 얻어진 유상물(油狀物)을 실리카 겔 칼럼크로마토그래피로 정제하여, 무색 유상물의 메틸티오메틸 2-시아노에틸에테르를 41 g 얻었다(수율 70%).
1H-NMR(CDCl3): 2.18(s, 3H); 2.66(t, 2H, J=6.3Hz); 3.77(t, 2H, J=6.3Hz); 4.69(s, 2H)
공정 2 클로로메틸 2- 시아노에틸에테르의 제조
공정 1에서 얻어진 메틸티오메틸 2-시아노에틸에테르 3.3 g(25 mmol)을 70 mL의 염화메틸렌에 용해시키고, 빙냉(氷冷)하에서 2 mL(25 mmol)의 염화술푸릴을 적하하며, 또한 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 용매를 증류 제거하고 진공 중에서 증류하여, 목적 화합물을 무색 유상물로서 2.5 g 얻었다(수율 85%).
비점: 84-85℃(0.3 Torr)
1H-NMR(CDCl3): 2.72(t, 2H, J=6.3Hz); 3.92(t, 2H, J=6.3Hz); 5.52(s, 2H)
참고예 2 5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 우리딘 3'-O-(2-시 아노 에틸 N,N- 디이소프로필포스포라미데이트 )
공정 1 5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 우리딘의 제조
5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)우리딘 546 ㎎(1 mmol)을 1,2-디클로로에탄 4 mL에 용해하고, 디이소프로필에틸아민 452 ㎎(3.5 mmol)을 첨가하며, 이어서 365 ㎎(1.2 mmol)의 이염화디부틸주석을 첨가한 후, 실온에서 1시간 반응하였다. 그 후 80℃로 하고 클로로메틸 2-시아노에틸에테르 155.4 ㎎(1.3 mmol)을 적하하며, 그대로 30분간 교반하였다. 반응 종료 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액에 반응액을 첨 가하고 염화메틸렌으로 추출을 행하며 무수황산마그네슘으로 건조하고, 용매를 증류 제거하며, 얻어진 혼합물을 30 g의 실리카 겔 칼럼크로마토그래피로 정제하여, 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)우리딘을 얻었다(197 ㎎; 수율 34%).
1H-NMR(CDCl3): 2.47(d, 1H, J=7.8Hz); 2.69(t, 2H, J=6.3Hz); 3.55(dd, 1H, 11.3, 2.2Hz); 3.62(dd, 1H, 11.3, 2.2Hz); 3.83(s, 6H); 3.87(t, 2H, J=6.3Hz); 4.07-4.08(m, 1H); 4.32(dd, 1H, J=5.3, 1.9Hz); 4.54(q, 1H, J=5.3Hz); 4.94, 5.11(2d, 2H, J=6.9Hz); 5.32(d, 1H, J=8.2Hz); 6.00(d, 1H, J=1.9Hz); 6.85-6.88(m, 4H); 7.29-7.41(m, 9H); 8.02(d, 1H, J=8.2Hz); 8.53(br.s, 1H)
ESI-Mass: 652[M+Na]+
공정 2 5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 우리딘 3'-O-(2-시 아노에 틸 N,N- 디이소프로필포스포라미데이트 )의 제조
공정 1에서 얻어진 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)우리딘 209 ㎎(0.332 mmol), 테트라졸 23 ㎎(0.332 mmol)을 아세토니트릴 2 mL에 용해하고 150 ㎎의 (0.498 mmol)의 2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미데이트를 적하하여, 45℃에서 1.5시간 반응시켰다. 반응 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고 초산에틸로 추출하며, 무수황산마그네슘으로 건조하고, 용매를 증류 제거해서 얻어진 혼합물을 20 g의 실리카 겔 칼럼크로마토그래피로 정제하여, 목적 화합물을 얻었다(200 ㎎; 수율 73%).
ESI-Mass: 852[M+Na]+
참고예 3 2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 우리딘
공정 1 3',5'-O-( 테트라이소프로필디실록산 -1,3- 디일 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 우리딘의 제조
3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)우리딘 150 ㎎(0.3 mmol)을 아르곤 분위기하에서 THF 7mL에 용해하고, 메틸티오메틸 2-시아노에틸에테르 54 ㎎(0.4 mmol), 분자체(molecular sieves) 4A 100 ㎎을 첨가하여, 10분 교반하였다. 0℃로 하고 트리플루오로메탄술폰산 10 ㎎(0.06 mmol)의 THF 2mL 용액을 첨가하여 교반한 후, N-요오드숙신이미드 92 ㎎(0.4 mmol)을 첨가하여, 1시간 교반하였다. 반응액을 셀라이트 여과하고, 염화메틸렌으로 세정한 후, 유기상(有機相)을 1 M의 티오황산수소나트륨 수용액으로 세정하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정하며, 무수황산마그네슘으로 건조하고, 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를 박층 크로마토그래피로 정제하여, 3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)우리딘을 얻었다(150 ㎎; 수율 85%).
1H-NMR(CDCl3): 0.97-1.12(m, 28H); 2.68-2.73(m, 2H); 3.78-3.86(m, 1H); 3.96-4.05(m, 2H); 4.12-4.30(m, 4H); 5.0-5.04(m, 2H); 5.70(d, 1H, J=8.2Hz); 5.75(s, 1H); 7.90(d, 1H, J=8.2Hz); 9.62(br.s, 1H)
ESI-Mass:570[M+H]+
공정 2 2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 우리딘의 제조
공정 1에서 얻어진 3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)우리딘 200 ㎎(0.35 mmol)을 메탄올 2 mL에 용해하고, 불화암모늄 65 ㎎(1.76 mmol)을 첨가하여 50℃에서 5시간 가열 교반하였다. 방냉 후 아세토니트릴을 첨가하여 교반하고, 여과 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카 겔 칼럼크로마토그래피로 정제하여, 목적 화합물을 얻었다(108 ㎎; 수율 94%).
1H-NMR(CD3OD); 2.72-2.76(t, 2H, J=6.2Hz); 3.68-3.92(m, 4H); 4.00-4.03(m, 1H); 4.26-4.32(m, 2H); 4.81-4.95(m, 2H); 5.71(d, 1H, J=8.1Hz); 6.00(d, 1H, J=3.3Hz); 8.10(d, 1H, J=8.1Hz)
ESI-Mass: 350[M+Na]+
참고예 4 5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 우리딘의 제조
2'-O-(2-시아노에톡시메틸)우리딘 14 g(43 mmol)을 피리딘으로 공비(共沸)하고 진공 펌프로 30분 건조하였다. THF 300 mL에 용해하고, 아르곤 분위기하에서 피리딘 68 g(856 mmol), 분자체 4A 20 g을 첨가하여 10분 교반하였다. 이것에 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 19.6 g(57.8 mmol)을 3회로 나누어 1시간마다 첨가하고, 또한 1시간 교반하였다. 메탄올 10 mL를 첨가하여 2분 교반한 후, 셀라이트 여과하고 초산에틸로 세정하였다. 여과액을 농축한 후, 잔사를 초산에틸에 용해하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액과 분액하였다. 유기상을 포화 염화나트륨 수용액으로 세 정하고, 무수황산마그네슘으로 건조한 후 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 목적 화합물을 얻었다(26.5 g; 수율 98%).
참고예 5 N 4 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 )시티딘 3'-O-(2- 시아노에틸 N,N- 디이소프로필포스포라미데이트 )
공정 1 N 4 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 시 티딘의 제조
N4-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)시티딘 588 ㎎(1 mmol)을 1,2-디클로로에탄 4 mL에 용해하고, 디이소프로필에틸아민 452 ㎎(3.5 mmol)을 첨가하며, 이어서 365 ㎎(1.2 mmol)의 이염화디부틸주석을 첨가한 후, 실온에서 1시간 반응하였다. 그 후 80℃로 하고 클로로메틸 2-시아노에틸에테르 155.4 ㎎(1.3 mmol)을 적하하며, 그대로 60분간 교반하였다. 반응 종료 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액에 반응액을 첨가하고 염화메틸렌으로 추출을 행하며 무수황산마그네슘으로 건조하고, 용매를 증류 제거하며, 얻어진 혼합물을 30 g의 실리카 겔 칼럼크로마토그래피로 정제하여, N4-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)시티딘을 얻었다(219 ㎎; 수율 35%).
1H-NMR(CDCl3): 2.19(s, 3H); 2.56(d, 1H, J=8.8Hz); 2.65(t, 2H, J=6.2Hz); 3.55(dd, 1H, 10.5, 2.5Hz); 3.63(dd, 1H, 10.5, 2.5Hz); 3.82(s, 6H); 3.86(t, 2H, J=6.2Hz); 4.09-4.14(m, 1H); 4.28(d, 1H, J=5.1Hz); 4.44-4.49(m, 1H); 4.97, 5.24(2d, 2H, J=6.9Hz); 5.96(s, 1H); 6.86-6.88(m, 4H); 7.09(d, 1H, J=6.9Hz); 7.26-7.42(m, 9H); 8.48(d, 1H, J=6.9Hz); 8.59(br.s, 1H)
ESI-Mass: 693[M+Na]+
공정 2 N 4 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 시 티딘 3'-O-(2- 시아노에틸 N,N- 디이소프로필포스포라미데이트 )의 제조
공정 1에서 얻어진 N4-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)시티딘 205 ㎎(0.306 mmol)을 염화메틸렌 2 mL에 용해하고, 디이소프로필에틸아민 105 ㎎(0.812 mmol)을 첨가하며 2-시아노에틸N,N-디이소프로필클로로포스포라미데이트 116 ㎎(0.49 mmol)을 적하하여, 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 용매를 증류 제거하여 얻어진 혼합물을 20 g의 실리카 겔 칼럼크로마토그래피로 정제하여, 목적 화합물을 얻었다(242 ㎎; 수율 91%).
ESI-Mass: 871[M+H]+
참고예 6 N 4 -아세틸-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 시티딘
공정 1 N 4 -아세틸-3',5'-O-( 테트라이소프로필디실록산 -1,3- 디일 )-2'-O-(2- 시 아노에톡시메틸) 시티딘의 제조
N4-아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)시티딘 1.00 g(1.89 mmol)과 메틸티오메틸 2-시아노에틸에테르 500 ㎎(3.79 mmol)을 혼합하고, 톨루엔 10 mL와 THF 10 mL의 혼합 용매에 용해하였다. 이어서 트리플루오로메탄술폰산은 975 ㎎(3.79 mmol)을 첨가하고, 분자체 4A를 첨가하여, 건조하였다. 빙냉하에서, N-브로모숙신이미드 370 ㎎(2.08 mmol)을 첨가하고, 반응 용기를 차광하여, 10분간 교반하였다. 또한 N-브로모숙신이미드 70 ㎎(0.39 mmol)을 추가하여, 25분간 교반하였다. 반응 종료 후, 염화메틸렌을 첨가하여 희석하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정을 행하며, 무수황산나트륨으로 건조하고, 용매를 증류 제거하며, 얻어진 혼합물을 실리카 겔 칼럼크로마토그래피로 정제하여, N4-아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)시티딘을 얻었다(936 ㎎; 수율 81%).
1H-NMR(CDCl3): 0.90-1.11(m, 28H); 2.28(s, 3H); 2.62-2.79(m, 2H); 3.78-3.89(m, 1H); 3.96-4.04(m, 2H); 4.19-4.23(m, 3H); 4.30(d, 1H, J=13.6Hz); 5.00(d, 1H, J=6.8Hz); 5.09(d, 1H, J=6.8Hz); 5.77(s, 1H); 7.44(d, 1H, J=7.5Hz); 8.30(d, 1H, J=7.5Hz); 10.13(s, 1H)
ESI-Mass: 611[M+H]+
공정 2 N 4 -아세틸-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 시티딘의 제조
공정 1에서 얻어진 N4-아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)시티딘 500 ㎎(0.819 mmol)을 THF 2.5 mL와 메탄올 2.5 mL의 혼합 용매에 용해하고, 불화암모늄 150 ㎎(4.10 mmol)을 첨가하여, 50℃ 에서 4시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 아세토니트릴로 희석하고, 여과하며, 용매를 증류 제거해서 얻어진 혼합물을 실리카 겔 칼럼크로마토그래피로 정제하여, 목적 화합물을 얻었다(210 ㎎; 수율 70%).
1H-NMR(D2O): 2.13(s, 3H); 2.66-2.71(m, 2H); 3.72-3.78(m, 3H); 3.90(dd, 1H, 13.0, 2.6Hz); 4.06-4.11(m, 1H); 4.20(dd, 1H, J=7.1, 5.2Hz); 4.29(dd, 1H, J=5.1, 2.9Hz); 4.83(d, 1H, J=7.2Hz); 4.94(d, 1H, J=7.2Hz); 5.95(d, 1H, J=2.9Hz); 7.25(d, 1H, J=7.6Hz); 8.25(d, 1H, J=7.6Hz)
ESI-Mass: 391[M+Na]+
참고예 7 N 4 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 )시티딘의 제조
2'-O-(2-시아노에톡시메틸)시티딘 9.9 g(26.8 mmol)을 피리딘으로 공비하고 진공 펌프로 30분 건조하였다. THF 190 mL에 용해하고, 아르곤 분위기하에서 피리딘 43 g(538 mmol), 분자체 4A 20g을 첨가하여 10분 교반하였다. 이것에 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 11.8 g(34.9 mmol)을 3회로 나누어 1시간마다 첨가하고, 또한 1시간 교반하였다. 메탄올 2 mL를 첨가하여 2분 교반한 후, 셀라이트 여과하고 초산에틸로 세정하였다. 여과액을 증발기(evaporator)로 농축한 후 잔사를 초산에틸에 용해하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액과 분액하였다. 유기상을 포화 염화나트륨 수용액으로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조한 후 용매를 증류 제거하였 다. 얻어진 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 목적 화합물을 얻었다(15 g; 수율 83%).
참고예 8 N 2 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 )구아노신 3'-O-(2- 시아노에틸 N,N- 디이소프로필포스포라미데이트 )
공정 1 N 2 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 구 아노신의 제조
N2-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)구아노신 627 ㎎(1 mmol)을 1,2-디클로로에탄 4 mL에 용해하고, 디이소프로필에틸아민 452 ㎎(3.5 mmol)을 첨가하며, 이어서 365 ㎎(1.2 mmol)의 이염화디부틸주석을 첨가한 후, 실온에서 1시간 반응하였다. 그 후 80℃로 하고 클로로메틸 2-시아노에틸에테르 155.4 ㎎(1.3 mmol)을 적하하며, 그대로 60분간 교반하였다. 반응 종료 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액에 반응액을 첨가하고 염화메틸렌으로 추출을 행하며 무수황산마그네슘으로 건조하고, 용매를 증류 제거하며, 얻어진 혼합물을 30 g의 실리카 겔 칼럼크로마토그래피로 정제하여, N2-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)구아노신을 얻었다(450 ㎎; 수율 63%).
1H-NMR(CDCl3): 1.92(s, 3H); 2.47-2.51(m, 2H); 2.68(br.s, 1H); 3.30(dd, 1H, 10.7, 3.8Hz); 3.47(dd, 1H, 10.7, 3.8Hz); 3.55-3.60(m, 1H); 3.65-3.70(m, 1H); 3.74, 3.75(2s, 6H); 4.22-4.23(m, 1H); 4.55-4.58(m, 1H); 4.78, 4.83(2d, 2H, J=7.0Hz); 5.01(t, 1H, J=5.1Hz); 5.99(d, 1H, J=5.1Hz); 6.76-6.79(m, 4H); 7.17-7.44(m, 9H); 7.88(s, 1H); 8.36(br.s, 1H); 12.06(br.s, 1H)
공정 2 N 2 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 구 아노신 3'-O-(2- 시아노에틸 N,N- 디이소프로필포스포라미데이트 )의 제조
공정 1에서 얻어진 N2-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)구아노신 400 ㎎(0.563 mmol)을 염화메틸렌 2 mL에 용해하고, 디이소프로필에틸아민 181 ㎎(1.4 mmol)을 첨가하며 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미데이트 161 ㎎(0.68 mmol)을 적하하여, 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 용매를 증류 제거하여 얻어진 혼합물을 20 g의 실리카 겔 칼럼크로마토그래피로 정제하여, 목적 화합물을 얻었다(471 ㎎; 수율 92%).
참고예 9 N 6 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 )아데노신 3'-O-(2- 시아노에틸 N,N- 디이소프로필포스포라미데이트 )
공정 1 N 6 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 )아데노신의 제조
N6-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)아데노신 22.0 g(36.0 mmol)을 1,2-디클로로에탄 170 mL에 용해하고, 디이소프로필에틸아민 16.3 g(126 mmol)을 첨가하며, 이어서 12.1 g(39.7 mmol)의 이염화디부틸주석을 첨가한 후, 실온에서 1시간 반응하였다. 그 후, 80℃로 하여 15분간 교반한 후, 클로로메틸 2-시아노에틸에테 르 4.30 g(36.0 mmol)을 적하하고, 그대로 30분간 교반하였다. 반응 종료 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액에 반응액을 첨가하고 염화메틸렌으로 추출을 행하며 무수황산마그네슘으로 건조하고, 용매를 증류 제거하며, 얻어진 혼합물을 실리카 겔 칼럼크로마토그래피로 정제하여, N6-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)아데노신을 얻었다(7.47 g; 수율 33%)
1H-NMR(CDCl3): 2.51(t, 2H, J=6.2Hz); 2.58(d, 1H, J=5.5Hz); 2.61(s, 3H); 3.45(dd, 1H, J=10.7, 4.0Hz); 3.54(dd, 1H, J=10.7, 3.2Hz); 3.62-3.79(m, 2H); 3.79(s, 6H); 4.25(br.q, 1H, J=4.6Hz); 459(q, 1H, J=5.2Hz); 4.87-4.94(m, 3H); 6.23(d, 1H, J=4.4Hz); 6.80-6.83(m, 4H); 7.22-7.32(m, 7H); 7.40-7.43(m, 2H); 8.20(s, 1H); 8.61(br.s, 1H); 8.62(s, 1H)
ESI-Mass: 695[M+H]+
공정 2 N 6 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 )아데노신 3'-O-(2- 시아노에틸 N,N- 디이소프로필포스포라미데이트 )의 제조
공정 1에서 얻어진 N6-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)아데노신 10.0 g(14.4 mmol)을 염화메틸렌 75 mL에 용해하고, 디이소프로필에틸아민 4.7 g(36 mmol)을 첨가하며 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미데이트 4.82 g(20.3 mmol)을 적하하여, 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 용매를 30 mL 정도 남기고 증류 제거하여 얻어진 반응 혼합물을 실리카 겔 칼 럼크로마토그래피로 정제하여, 목적 화합물을 얻었다(12.0 g; 수율 93%).
ESI-Mass: 895[M+H]+
참고예 10 N 6 -아세틸-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 )아데노신
공정 1 N 6 -아세틸-3',5'-O-( 테트라이소프로필디실록산 -1,3- 디일 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 )아데노신의 제조
N-요오드숙신이미드 245 ㎎(1.09 mmol)과 트리플루오로메탄술폰산은 280 ㎎(1.09 mmol)을 염화메틸렌 8 mL에 현탁시키고, 분자체 4A를 첨가하여, 건조하였다. 여기에, N6-아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)아데노신 400 ㎎(0.73 mmol)과 메틸티오메틸 2-시아노에틸에테르 145 ㎎(1.11 mmol)을 염화메틸렌 4mL에 용해하여, 빙냉하에서 첨가하였다. 그대로 3시간 교반하였다. 반응 종료 후, 염화메틸렌을 첨가하여 희석하고, 티오황산나트륨 수용액과 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정을 행하며, 무수황산마그네슘으로 건조하고, 용매를 증류 제거하며, 얻어진 혼합물을 실리카 겔 칼럼크로마토그래피로 정제하여, N6-아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)아데노신을 얻었다(201 ㎎; 수율45%)
1H-NMR(CDCl3): 0.98-1.11(m, 28H); 2.62(s, 3H); 2.69(td, 2H, 6.5, J=1.5Hz); 3.81-3.89(m, 1H); 4.02-4.09(m, 2H); 4.17(d, 1H, J=9.4Hz); 4.28(d, 1H, J=13.4Hz); 4.50(d, 1H, J=4.5Hz); 4.67(dd, 1H, J=8.8, 4.5Hz); 5.02(d, 1H, J=7.0Hz); 5.08(d, 1H, J=7.0Hz); 6.10(s, 1H); 8.34(s, 1H); 8.66(s, 1H); 8.67(s, 1H)
ESI-Mass: 636[M+H]+
공정 2 N 6 -아세틸-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 )아데노신의 제조
공정 1에서 얻어진 N6-아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)아데노신 300 ㎎(0.47 mmol)을, 초산 0.1 mL와 0.5 M TBAF의 THF 용액 2 mL의 혼합 용액에 용해하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응 종료 후, 얻어진 반응 혼합물을 실리카 겔 칼럼크로마토그래피로 정제하여, 목적 화합물을 얻었다(160 ㎎; 수율 86%).
1H-NMR(DMSO-d6): 2.25(s, 3H); 2.53-2.68(m, 2H); 3.41-3.46(m, 1H); 3.56-3.64(m, 2H); 3.69-3.73(m, 1H); 4.00-4.01(m, 1H); 4.36-4.37(m, 1H); 4.72-4.78(m, 3H); 5.20(bt, 2H); 5.41(d, 1H, J=5.2Hz); 6.17(d, 1H, J=5.7Hz); 8.66(s, 1H); 8.72(s, 1H); 10.72(s, 1H)
ESI-Mass: 415[M+Na]+
참고예 11 N 6 -아세틸-5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메 틸)아데노신의 제조
N6-아세틸-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)아데노신 9.50 g(24.2 mmol)을 탈수 피리딘 100 mL에 용해하고, 농축하여 건조한 후, 아르곤 분위기하에서, 탈수 피리딘 100 mL에 용해하였다. 빙냉하에서, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 10.7 g(31.2 mmol)을 첨가하고, 실온에서 1시간 20분 반응하였다. 반응 종료 후, 염화메틸렌으로 희석하고, 물로 세정을 행하며 무수황산나트륨으로 건조하고, 용매를 증류 제거하며, 얻어진 혼합물을 실리카 겔 칼럼크로마토그래피로 정제하여, 목적 화합물을 얻었다(13.8 g; 수율 82%)
참고예 12 N 2 - 페녹시아세틸 -5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 구아노신 3'-O-(2- 시아노에틸 N,N- 디이소프로필포스포라미데이트 )
공정 1 N 2 - 페녹시아세틸 -5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시 메틸) 구아노신의 제조
N2-페녹시아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)구아노신 720 ㎎(1 mmol)을 1,2-디클로로에탄 4 mL에 용해하고, 디이소프로필에틸아민 452 ㎎(3.5 mmol)을 첨가하며, 이어서 365 ㎎(1.2 mmol)의 이염화디부틸주석을 첨가한 후, 실온에서 1시간 반응하였다. 그 후 80℃로 하고 클로로메틸 2-시아노에틸에테르 155.4 ㎎(1.3 mmol)을 적하하며, 그대로 60분간 교반하였다. 반응 종료 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액에 반응액을 첨가하고 염화메틸렌으로 추출을 행하며 무수황산마그네슘으로 건조하고, 용매를 증류 제거하며, 얻어진 혼합물을 30 g의 실리카 겔 칼럼크로마토 그래피로 정제하여, N2-페녹시아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)구아노신을 얻었다(384 ㎎; 수율 48%).
1H-NMR(CDCl3): 2.47-2.51(m, 2H); 2.58(br.s, 1H); 3.42(dd, 1H, 10.1, 3.8Hz); 3.46(dd, 1H, 10.1, 3.8Hz); 3.53-3.57(m, 1H); 3.69-3.73(m, 1H); 3.77(s, 6H); 4.24-4.26(m, 1H); 4.48-4.50(m, 1H); 4.61-4.65(m, 2H); 4.83, 4.87(2d, 2H, J=7.0Hz); 4.88(t, 1H, J=5.7Hz); 6.05(d, 1H, J=5.7Hz); 6.80-6.82(m, 4H); 6.92-6.96(m, 3H); 7.07-7.11(m, 2H); 7.20-7.42(m, 9H); 7.84(s, 1H); 8.99(s, 1H); 11.81(br.s, 1H)
ESI-Mass: 825[M+Na]+
공정 2 N 2 - 페녹시아세틸 -5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 구아노신 3'-O-(2- 시아노에틸 N,N- 디이소프로필포스포라미데이트 )의 제조
공정 1에서 얻어진 N2-페녹시아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)구아노신 320 ㎎(0.399 mmol)을 염화메틸렌 4 mL에 용해하고, 디이소프로필에틸아민 128.8 ㎎(0.996 mmol)을 첨가하며 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미데이트 141.5 ㎎(0.598 mmol)을 적하하여, 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 용매를 증류 제거하여 얻어진 혼합물을 30 g의 실리카 겔 칼럼크로마토그래피로 정제하여, 목적 화합물을 얻었다(316 ㎎; 수율 79%).
ESI-Mass: 1003[M+H]+
참고예 13 N 2 - 페녹시아세틸 -2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 구아노신
공정 1 N 2 - 페녹시아세틸 -3',5'-O-( 테트라이소프로필디실록산 -1,3- 디일 )-2'-O-(2-시 아노에톡시 메틸) 구아노신의 제조
N2-페녹시아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)구아노신 2.0 g(3.0 mmol)을 THF 16 mL에 용해하고, 메틸티오메틸 2-시아노에틸에테르 0.99 g(7.6 mmol), 분자체 4A 1.0 g을 첨가하며, 아르곤 분위기하에서 -45℃에서 10분 교반하였다. 트리플루오로메탄술폰산 0.68 g(4.5 mmol)의 THF 5 mL 용액을 첨가하여 교반한 후, N-요오드숙신이미드 1.02 g(4.5 mmol)을 첨가하여, 15분 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 여과 후 초산에틸로 추출하며, 유기상을 1 M의 티오황산수소나트륨 수용액으로 세정하고, 물, 이어서 포화 염화나트륨 수용액으로 세정하며, 무수황산마그네슘으로 건조하고, 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, N2-페녹시아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)구아노신을 얻었다(2.0 g; 수율 89%).
1H-NMR(CDCl3): 0.99-1.11(m, 28H); 2.59-2.77(m, 2H); 3.82-4.05(m, 3H); 4.15(d, 1H, J=9.3Hz); 4.25-4.35(m, 2H); 4.52-456(dd, 1H, J=9.3, 4.3Hz); 5.00, 5.07(2d, 2H, J=7.2Hz); 5.95(s, 1H); 6.99-7.12(m, 3H); 7.35-7.40(m, 2H); 8.09(s, 1H); 9.38(br.s, 1H); 11.85(br.s, 1H)
ESI-Mass: 766[M+Na]+
공정 2 N 2 - 페녹시아세틸 -2'-O-(2- 시아노에톡시메틸 ) 구아노신의 제조
1 M TBAF의 THF 용액 2.83 mL(2.83 mmol)에 초산 0.14 mL(0.14 mmol)를 첨가한 용액을 조정한다. 공정 1에서 얻어진 N2-페녹시아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)구아노신 1.0 g(1.35 mmol)을 THF 2.83 mL에 용해하고, 위에서 조정한 용액을 첨가하여 아르곤 분위기하에서 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 감압하에서 농축한 후, 염화메틸렌에 용해하고 실리카 겔 크로마토그래피에 얹어 정제하여, 목적 화합물을 얻었다(0.67 g; 수율 99%).
1H-NMR(DMSO-d6): 2.59-2.66(m, 2H); 3.41-3.63(m, 4H); 3.98(m, 1H); 4.32(m, 1H); 4.58-4.62(t, 1H, J=5.3Hz); 4.71-4.78(dd, 2H, J=13.1, 6.8Hz); 4.87(s, 2H); 5.12(s, 1H) 5.37(s, 1H); 5.97(d, 1H, J-6.1Hz) 6.96-6.99(m, 3H); 7.28-7.34(m, 2H); 8.30(s, 1H); 11.78(br.s, 2H)
ESI-Mass: 500[M-H]-
참고예 14 N 2 - 페녹시아세틸 -5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2'-O-(2- 시아노에톡 시메틸) 구아노신의 제조
N2-페녹시아세틸-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)구아노신 660 ㎎(1.32 mmol)을 피리딘으로 공비하고 진공 펌프로 30분 건조하였다. THF 9mL에 용해하고, 아르곤 분위기하에서 피리딘 2.1 g(26.4 mmol), 분자체 4A 600 ㎎을 첨가하여 10분 교반하였다. 이것에 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 540 ㎎(1.58 mmol)을 3회로 나누어 1시간마다 첨가하고, 또한 1시간 교반하였다. 메탄올 2 mL를 첨가하여 2분 교반한 후, 셀라이트 여과하고 초산에틸로 세정하였다. 여과액을 증발기로 농축한 후 잔사를 초산에틸에 용해하며, 포화 탄산수소나트륨 수용액과 분액하였다. 유기상을 포화 염화나트륨 수용액으로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조한 후 용매를 증류 제거하였다. 얻어진 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 목적 화합물을 얻었다(800 ㎎; 수율 75%).
참고예 15 N 6 -아세틸-3',5'-O-( 테트라이소프로필디실록산 -1,3- 디일 )-2'-O-(2-시 아노에톡시메 틸)아데노신
공정 1 N 6 -아세틸-3',5'-O-( 테트라이소프로필디실록산 -1,3- 디일 )-2'-O- 메틸티오메틸아데노신의 제조
N6-아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)아데노신 2.00 g(3.62 mmol)을 디메틸술폭시드 25 mL에 용해하고, 무수초산 17.5 mL, 초산 12.5 mL를 첨가하여 실온에서 14시간 교반하였다. 반응 종료 후, 물 200 mL에 반응액을 첨가하고, 초산에틸로 추출을 행하며, 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정을 행하고, 무수황산나트륨으로 건조하며, 용매를 증류 제거하고, 얻어진 혼합물을 실리카 겔 칼럼크로마토그래피로 정제하여, N6-아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-메틸티오메틸아데노신을 얻었다(1.36 g; 수율 61%)
1H-NMR(CDCl3): 0.96-1.11(m, 28H); 2.20(s, 3H); 2.61(s, 3H); 4.03(dd, 1H, J=13.4, 2.4Hz); 4.18(d, 1H, J=9.1Hz); 4.27(d, 1H, J=13.4Hz); 4.63-4.71(m, 2H); 5.00(d, 1H, J=11.5Hz); 5.07(d, 1H, J=11.5Hz); 6.09(s, 1H); 8.31(s, 1H); 8.65(s, 1H); 8.69(s, 1H)
ESI-Mass: 635[M+Na]+
공정 2 N 6 -아세틸-3',5'-O-( 테트라이소프로필디실록산 -1,3- 디일 )-2'-O-(2- 시 아노에톡시메틸)아데노신의 제조
공정 1에서 얻어진 N6-아세틸-3',5'-O-(테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-2'-O-메틸티오메틸아데노신 1.00 g(1.63 mmol)을, THF 25 mL에 용해하였다. 3-히드록시프로피오니트릴 5.88 g(82.7 mmol)을 첨가하고, 분자체 4A를 첨가하여 건조하며, -45℃로 냉각하였다. N-요오드숙신이미드 440 ㎎(1.96 mmol)을 첨가하고, 이어서 트리플루오로메탄술폰산 490 ㎎(3.26 mmol)을 첨가한 후, -45℃에서 15분간 교반하였다. 반응 종료 후, 냉각한 채로 트리에틸아민을 첨가하여 중화하고, 염화메틸렌으로 희석하며, 티오황산나트륨 수용액과 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정을 행하고, 무수황산나트륨으로 건조하며, 용매를 증류 제거하고, 얻어진 혼합물을 실리카 겔 칼럼크로마토그래피로 정제하여, 목적 화합물을 얻었다(722 ㎎; 수율 71%).
참고예 16 우리디릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕-우리디릴-〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕- 우리딘
시판의 2'/3'-O-벤조일-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)우리딘이 담지되어 있는 CPG 고상 담체(37 ㎎, 1 μmol)를 유리 필터를 갖는 칼럼에 넣고, 핵산 자동 합성기(ExpediteTM: 어플라이드 바이오 시스템즈사)를 사용하여, 표기 화합물의 올리고 RNA의 합성을 행하였다.
핵산 모노머 화합물로서, 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)우리딘 3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필포스포라미데이트)를, 축합 촉매로서 테트라졸을, 산화제로서 요오드 용액을, 캡핑 용액으로서 무수초산과 N-메틸이미다졸 용액을 사용하였다. 핵산 모노머 화합물을 20회 축합시킨 후, 분리제로서 10 M의 메틸아민의 에탄올 수용액을 이용하여, 실온 중에서 1∼2시간에 걸쳐서 CPG 고상 담체로부터의 분리 및 각 인산 부위의 보호기의 탈리 반응을 행하였다. 반응 혼합물을 감압하에서, 농축한 후, 역상 칼럼(ODS)으로 불요 피크를 제거한 후, 용출 용매(아세토니트릴-50 mM 트리에틸아민-초산 완충액)를 이용하여 정제하였다. 잔사를 감압하에서 농축한 후, 1 M TBAF의 THF 용액을 이용하여 실온에서 1시간 반응하여, 2'위치의 수산기의 보호기를 탈리하였다. 용액을 탈염 처리한 후, 80% 초산으로 5'말단의 보호기를 제거하였다(실온하에서 10분). 감압하에서 농축한 후, 수층(水層)을 에테르 세정하고, 정제를 하지 않고, 고순도의 목적 화합물을 얻었다.
MALDI-TOF-MS: 계산치 6367.52[M+H]+
실측치 6366.50[M+H]+
참고예 17 포스포로티오에이트 결합을 갖는 올리고 RNA의 제조
시티디릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕- 아데니릴 -〔3'→5'〕- 시티디릴 -〔3'→5'〕- 구아니릴 -〔3'→5'〕- 시티디릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕- 구아니릴 -〔3'→5'〕- 아데니릴 -〔3'→5'〕- 구아니릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕- 아데니릴 -〔3'→5'〕- 시티디릴 -〔3'→5'〕- 우리디릴 -〔3'→5'〕-우리디릴-〔3'→5'〕- 시티디릴 -〔3'→5'〕- 구아니릴 -〔3'→5'〕- 아데니릴 -〔3'→5'〕- 티미디릴 -〔3'→5'〕- 티미딘
시판의 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)티미딘이 담지되어 있는 CPG 고상 담체(22 ㎎, 1 μmol)를 유리 필터를 갖는 칼럼에 넣고, 핵산 자동 합성기(ExpediteTM: 어플라이드 바이오 시스템즈사)를 사용하여, 표기 화합물의 올리고 RNA의 합성을 행하였다.
핵산 모노머 화합물로서, 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)우리딘 3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필포스포라미데이트), N4-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)시티딘 3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필포스포라미데이트), N6-아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)아데노신 3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필포스포라미데이트), N2-페녹시아세틸-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-(2-시아노에톡시메틸)구아노신 3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필포스포라미데이트), 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)시티딘 3'-O-(2-시아노에틸 N,N-디이소프로필포스포라미데이트)를, 축합제로서 벤질메르캅토테트라졸을, 산화제로서 Beaucage 시약(3H-1,2-벤조디티올-3-온-1,1-디옥사이드)을, 캡핑 용액으로서 페녹시초산 무수물과 N-메틸이미다졸 용액을 사용하였다. 핵산 모노머 화합물을 20회 축합시킨 후, 분리제로서, 농축 암모니아수-에탄올 혼합액(3:1)을 이용하여, 40℃에서, 4시간에 걸쳐서 CPG 고상 담체로부터의 분리 및 각 인산 부위의 보호기의 탈리 반응 및 염기의 보호기의 제거를 행하였다. 반응 혼합물을 감압하에서 농축한 후, 2.5 μL의 니트로메탄을 포함하는 0.5 M TBAF의 DMSO 용액 500 μL를 이용하여 실온에서 2시간 반응해서, 2'위치의 수산기의 보호기를 탈리하였다. 250 μL의 1 M Tris-HCl 완충액(pH7.5)을 첨가한 후, 8 mL의 에탄올에 적하하고, 반응 생성물을 침전시켰다. 하룻밤 동안 냉장고에 보존한 후, 상청액을 제거하고, ODS 칼럼(LiChroprep RP-18)으로 정제하였다. 80% 초산 수용액으로 4,4'-디메톡시트리틸을 탈보호하고, 초산에틸과 물로 분액 조작을 행하며, 수층을 농축하여, 목적 화합물을 얻었다(80OD260; 수율 40%).
MALDI-TOF-MS: 계산치 6928.4[M+H]+
실측치 6930.1[M+H]+
시험예 1 아미드계 용매의 탈보호 효과
시판의 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)티미딘이 담지되어 있는 CPG 고상 담체(333 ㎎, 15 μmol)를 필터를 갖는 칼럼에 넣고, 핵산 자동 합성기(ExpediteTM: 어플라이드 바이오 시스템즈사)를 사용하여, 고상 상에서 아데니릴-〔3'→5'〕-시티디릴-〔3'→5'〕-우리디릴-〔3'→5'〕-구아니릴-〔3'→5'〕-아데니릴-〔3'→5'〕-시티디릴-〔3'→5'〕-우리디릴-〔3'→5'〕-구아니릴-〔3'→5'〕-아데니릴-〔3'→5'〕-시티디릴-〔3'→5'〕-우리디릴-〔3'→5'〕-구아니릴-〔3'→5'〕-아데니릴-〔3'→5'〕-시티디릴-〔3'→5'〕-우리디릴-〔3'→5'〕-구아니릴-〔3'→5'〕-아데니릴-〔3'→5'〕-시티디릴-〔3'→5'〕-우리디릴-〔3'→5'〕-구아니릴-〔3'→5'〕-티미딘의 합성을 행하며, 고상 상에서, 4,4'-디메톡시트리틸을 탈리하였다. 올리고 RNA 2 μmol분의 레진에 대하여, 분리제로서, 농축 암모니아수-에탄올 혼합액(3:1) 6 mL를 사용하여, 40℃에서, 4시간에 걸쳐서 CPG 고상 담체로부터의 분리 및 각 인산 부위의 보호기의 탈리 반응 및 염기의 보호기의 제거를 행하였다. 반응 혼합물을 10등분하여 감압하에서 농축하고, 하기 표 1에 기재된 탈보호 조건에 있어서, 각 리보오스의 2'위치 수산기의 보호기를 탈리하는 반응을 행하였다. 단, 각 반응에 있어서, 100 μmol의 TBAF에 대하여, 1 μL의 니트로메탄을 첨가하였다. 반응 용액량과 동량의 1 M의 Tris-HCl 완충액(pH7.5)을 첨가한 후, 각 올리고 RNA를 HPLC로 분석하였다.
HPLC에 있어서의 측정 조건은, 이하와 같다.
측정 조건:
HPLC 장치
송액 유닛: LC-10AT(시마즈 세이사쿠쇼사 제조)
검출기: SPD-10A(시마즈 세이사쿠쇼사 제조)
역상 HPLC 칼럼
DNAPac PA100<4 mmφx250 mm>(DIONEX사 제조)
칼럼 온도: 50℃
이동상(移動相)
그라디언트: 리니어 그라디언트 20분(B액: 5%-25%)
A액: 10% 아세토니트릴을 포함하는 25 mM Tris-HCl 완충액
B액: 10% 아세토니트릴과 700 mM 과염소산나트륨을 포함하는 25 mM Tris-HCl 완충액
이동상의 유량: 1.5 ml/분
자외선 가시 분광기 검출 파장: 260 ㎚
아미드계 용매의 탈보호 효과
탈보호 조건 TBAF의 활성의 정도
1 200μL의 1M TBAF/THF 용매 3시간 정도에 반응완료
2 200μL의 1M TBAF/THF 용매에 200μL의 DMF를 첨가한 용매 1시간에 반응완료
3 100μL의 1M TBAF/THF 용매에 100μL의 DMF를 첨가한 용매 3시간에 반응완료
상기 표 1에 나타내는 바와 같이, TBAF의 THF 용액에, DMF를 첨가함으로써, 반응 시간의 단축 또는 TBAF 시약의 양을 저감할 수 있는 것이 분명하다.
시험예 2 아미드계 용매 및 술폭시드계 용매의 탈보호 효과
시판의 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)티미딘이 담지되어 있는 CPG 고상 담체(333 ㎎, 15 μmol)를 필터를 갖는 칼럼에 넣고, 핵산 자동 합성기(ExpediteTM: 어플라이드 바이오 시스템즈사)를 사용하여, 고상 상에서 아데니릴-〔3'→5'〕-시티디릴-〔3'→5'〕-우리디릴-〔3'→5'〕-구아니릴-〔3'→5'〕-아데니릴-〔3'→5'〕-시티디릴-〔3'→5'〕-우리디릴-〔3'-5'〕-구아니릴-〔3'→5'〕-아데니릴-〔3'→5'〕-시티디릴-〔3'→5'〕-우리디릴-〔3'→5'〕-구아니릴-〔3'→5'〕-아데니릴-〔3'→5'〕-시티디릴-〔3'→5'〕-우리디릴-〔3'→5'〕-구아니릴-〔3'→5'〕-아데니릴-〔3'→5'〕-시티디릴-〔3'→5'〕-우리디릴-〔3'→5'〕-구아니릴-〔3'→5'〕-티미딘의 합성을 행하고, 고상 상에서, 4,4'-디메톡시트리틸을 탈리하였다. 이 중, 올리고 RNA 1 μmol분의 레진에 대하여, 분리제로서, 농축 암모니아수-에탄올 혼합액(3:1) 3 mL를 이용하여, 40℃에서, 4시간에 걸쳐서 CPG 고상 담체로부터의 분리 및 각 인산 부위의 보호기의 탈리 반응 및 염기의 보호기의 제거를 행하였다. 상기 반응 혼합물을 감압하에서 농축한 후, 실온하에서, 하기 표 2에 기재된 탈보호 조건에 있어서, 각 리보오스의 2'위치 수산기의 보호기를 탈리하는 반응을 행하였다. 단, 각 반응에 있어서, 100 μmol의 TBAF에 대하여, 1 μL의 니트로메탄을 첨가하였다. 또한, 100 μmol의 TBAF에 대하여, 100 μL의 1 M Tris-HCl 완충액(pH7.5)을 첨가한 후, 2 mL(단, 엔트리 3에 대해서는, 1.5 mL)의 에탄올에 적하하여, 반응 생성물을 침전시켰다. 하룻밤 동안, 냉장고에 보존한 후, 상청액을 제거하고, 반응 생성물을 HPLC로 분석하여, 본 반응의 종점을 확인하였다. HPLC에 있어서의 측정 조건은, 시험예 1과 동일하다.
아미드계 용매 및 술폭시드계 용매의 탈보호 효과
탈보호 조건 TBAF의 활성의 정도
1 500μL의 1M TBAF/THF 용매 1시간에 반응완료
2 500μL의 1M TBAF/DMSO 용매 1시간에 반응완료
3 400μL의 0.5M TBAF/DMSO 용매 1시간에 반응완료
상기 표 2에 나타내는 바와 같이, 반응 용매로서 THF 대신에 DMSO 또는 DMF를 사용한 경우, 현격하게 반응성이 향상되는 것이 분명하다.
또한, 상기 결과로부터 명백하듯이, 반응 용매로서 DMSO를 사용한 경우, TBAF의 사용량, 반응 용매의 사용량을 저감할 수 있었다. TBAF의 사용량은, 반응 용매로서 THF를 사용했을 때보다도, 약 1/5로 감소시킬 수 있었다. 이에 따라, 고가의 TBAF의 사용량을 저감함과 아울러, 최종 생성물을 석출시키기 위해서 사용하는, 에탄올의 사용량도 저감할 수 있는 것이 분명하다.
TBAF를 작용시켜 각 리보오스의 2'위치 수산기의 보호기를 탈리하는 공정에 있어서, 술폭시드계 용매 혹은 아미드계 용매 또는 이들의 혼합 용매를 반응 용매로서 이용하는, 올리고핵산 유도체의 각 리보오스의 2'위치 수산기의 보호기가 제거된 올리고핵산 유도체를 제조하는 공정을 경유함으로써, 대량으로 또한 고순도로의 올리고 RNA (A)의 제조가 가능해졌다.

Claims (23)

  1. 다음의 일반식 (10)으로 표시되는 올리고핵산 유도체에, 테트라부틸암모늄플루오라이드(TBAF)를 작용시켜, 각 리보오스의 2'위치 수산기의 보호기를 탈리하는 공정에 있어서, 테트라히드로푸란을 함유하고 있어도 좋은, 술폭시드계 용매 혹은 아미드계 용매 또는 이들의 혼합 용매를 반응 용매로서 이용하는 것을 특징으로 하는, 다음의 일반식 (11)로 표시되는 올리고핵산 유도체의 제조 방법:
    [식 1]
    Figure 112008065985566-PCT00034
    일반식 (10) 및 일반식 (11) 중, 각 B는, 각각 독립적으로, 핵산 염기 또는 그 수식체를 나타내고, n은, 1∼200의 범위 내에 있는 정수를 나타내고, 각 Q는, 각각 독립적으로, O 또는 S를 나타내고, 각 R은, 각각 독립적으로, H, 수산기, 할로겐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 디알킬아미노, 알케닐옥시, 알케닐티오, 알케닐아미노, 디알케닐아미노, 알키닐옥시, 알키닐티오, 알키닐아미노, 디알키닐아미노 또는 알콕시알킬옥시를 나타내지만, 적어도 하나는 수산기를 나타내고, Z는, H, 인산기 또는 티오인산기를 나타내고,
    R1은, 다음의 일반식 (3)으로 표시되는 치환기를 나타내고,
    [식 2]
    Figure 112008065985566-PCT00035
    일반식 (3) 중, R11, R12, R13은, 동일하거나 또는 다르며, 수소 또는 알콕시를 나타내고,
    각 R4는, 각각 독립적으로, H, 할로겐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 디알킬아미노, 알케닐옥시, 알케닐티오, 알케닐아미노, 디알케닐아미노, 알키닐옥시, 알키닐티오, 알키닐아미노, 디알키닐아미노, 알콕시알킬옥시 또는 다음의 일반식 (4)로 표시되는 치환기를 나타내고,
    [식 3]
    Figure 112008065985566-PCT00036
    일반식 (4) 중, WG1은, 전자 흡인성 기(基)를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, 술폭시드계 용매가 다음의 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 화합물인 올리고핵산 유도체의 제조 방법:
    [식 4]
    Figure 112008065985566-PCT00037
    일반식 (Ⅰ) 중, Ra, Rb는 동일하거나 또는 다르며, 알킬을 나타낸다.
  3. 제2항에 있어서, 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 화합물이 디메틸술폭시드인 올리고핵산 유도체의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 아미드계 용매가 다음의 일반식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물인 올리고핵산 유도체의 제조 방법:
    [식 5]
    Figure 112008065985566-PCT00038
    일반식 (Ⅱ) 중, Rc, Rd는 동일하거나 혹은 다르며, 알킬을 나타내고, Re는 수소 혹은 알킬을 나타내거나, 또는 Rd는 알킬을 나타내며, Rc와 Re는 인접하는 질 소 원자와 탄소 원자가 합쳐져서 형성하는, 5 혹은 6원의 포화 환상 아미드기를 나타낸다.
  5. 제4항에 있어서, 일반식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물이 N,N-디메틸포름아미드인 올리고핵산 유도체의 제조 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, WG1이 시아노인 올리고핵산 유도체의 제조 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로, 니트로알칸, 알킬아민, 아미딘, 티올 혹은 티올 유도체 또는 이들의 임의의 혼합물을 함유하는 반응 용매를 이용하는 것을 특징으로 하는 올리고핵산 유도체의 제조 방법.
  8. 하기 공정을 포함하는, 다음의 일반식 (A)로 표시되는 올리고 RNA의 제조 방법:
    [식 6]
    Figure 112008065985566-PCT00039
    [일반식 (A) 중, 각 B는, 각각 독립적으로, 핵산 염기 또는 그 수식체를 나타내고, n은, 1∼200의 범위 내에 있는 정수를 나타내고, 각 Q는, 각각 독립적으로, O 또는 S를 나타내고, 각 R은, 각각 독립적으로, H, 수산기, 할로겐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 디알킬아미노, 알케닐옥시, 알케닐티오, 알케닐아미노, 디알케닐아미노, 알키닐옥시, 알키닐티오, 알키닐아미노, 디알키닐아미노 또는 알콕시알킬옥시를 나타내지만, 적어도 하나는 수산기를 나타내고, Z는, H, 인산기 또는 티오인산기를 나타낸다.]
    공정:
    다음의 일반식 (10)으로 표시되는 올리고핵산 유도체에, 테트라부틸암모늄플루오라이드(TBAF)를 작용시켜, 각 리보오스의 2'위치 수산기의 보호기를 탈리하는 공정에 있어서, 테트라히드로푸란을 함유하고 있어도 좋은, 술폭시드계 용매 혹은 아미드계 용매 또는 이들의 혼합 용매를 반응 용매로서 이용하는 것을 특징으로 하는, 다음의 일반식 (11)로 표시되는 올리고핵산 유도체를 제조하는 공정:
    [식 7]
    Figure 112008065985566-PCT00040
    일반식 (10) 및 일반식 (11) 중, 각 B, 각 Q, 각 R은, 각각 독립적으로, 상기와 동일한 의미이고, n, Z는, 상기와 동일한 의미이고,
    R1은, 다음의 일반식 (3)으로 표시되는 치환기를 나타내고,
    [식 8]
    Figure 112008065985566-PCT00041
    일반식 (3) 중, R11, R12, R13은, 동일하거나 또는 다르며, 수소 또는 알콕시를 나타내고,
    각 R4는, 각각 독립적으로, H, 할로겐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 디알킬아미노, 알케닐옥시, 알케닐티오, 알케닐아미노, 디알케닐아미노, 알키닐옥시, 알키닐티오, 알키닐아미노, 디알키닐아미노, 알콕시알킬옥시 또는 다음의 일반식 (4)로 표시되는 치환기를 나타내고,
    [식 9]
    Figure 112008065985566-PCT00042
    일반식 (4) 중, WG1은, 전자 흡인성 기를 나타낸다.
  9. 제8항에 있어서, 술폭시드계 용매가 다음의 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 화합물인 올리고핵산 유도체의 제조 방법:
    [식 10]
    Figure 112008065985566-PCT00043
    일반식 (Ⅰ) 중, Ra, Rb는, 동일하거나 또는 다르며, 알킬을 나타낸다.
  10. 제9항에 있어서, 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 화합물이 디메틸술폭시드인 올리고핵산 유도체의 제조 방법.
  11. 제8항에 있어서, 아미드계 용매가 다음의 일반식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물인 올리고핵산 유도체의 제조 방법:
    [식 11]
    Figure 112008065985566-PCT00044
    일반식 (Ⅱ) 중, Rc, Rd는, 동일하거나 혹은 다르며, 알킬을 나타내고, Re는, 수소 혹은 알킬을 나타내거나, 또는 Rd는 알킬을 나타내며, Rc와 Re는 인접하는 질소 원자와 탄소 원자가 합쳐져서 형성하는, 5 혹은 6원의 포화 환상 아미드기를 나타낸다.
  12. 제11항에 있어서, 일반식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물이 N,N-디메틸포름아미드인 올리고 RNA의 제조 방법.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, WG1이 시아노인 올리고 RNA의 제조 방법.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로, 니트로알칸, 알킬아민, 아미딘, 티올 혹은 티올 유도체 또는 이들의 임의의 혼합물을 함유하는 반응 용매를 이용하는 것을 특징으로 하는 올리고 RNA의 제조 방법.
  15. 하기 공정 A∼H를 포함하는, 다음의 일반식 (A)로 표시되는 올리고 RNA의 제조 방법:
    [식 12]
    Figure 112008065985566-PCT00045
    [일반식 (A) 중, 각 B는, 각각 독립적으로, 핵산 염기 또는 그 수식체를 나타내고, n은, 1∼200의 범위 내에 있는 정수를 나타내고, 각 Q는, 각각 독립적으로, O 또는 S를 나타내고, 각 R은, 각각 독립적으로, H, 수산기, 할로겐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 디알킬아미노, 알케닐옥시, 알케닐티오, 알케닐아미노, 디알케닐아미노, 알키닐옥시, 알키닐티오, 알키닐아미노, 디알키닐아미노 또는 알콕시알킬옥시를 나타내지만, 적어도 하나는 수산기를 나타내고, Z는, H, 인산기 또는 티오인산기를 나타낸다.]
    공정 A:
    다음의 일반식 (1)로 표시되는 (올리고)핵산 유도체에 산을 작용시킴으로써, 5'위치의 수산기의 보호기를 탈리하여, 다음의 일반식 (2)로 표시되는 (올리고)핵 산 유도체를 제조하는 공정,
    [식 13]
    Figure 112008065985566-PCT00046
    일반식 (1) 및 일반식 (2) 중, 각 Q는, 각각 독립적으로, 상기와 동일한 의미이고, n은 상기와 동일한 의미이고, 각 Bx는, 각각 독립적으로, 보호기를 갖고 있어도 좋은 핵산 염기 또는 그 수식체를 나타내고, R1은, 다음의 일반식 (3)으로 표시되는 치환기를 나타내고,
    [식 14]
    Figure 112008065985566-PCT00047
    일반식 (3) 중, R11, R12, R13은, 동일하거나 또는 다르며, 수소 또는 알콕시를 나타내고,
    각 WG2는, 전자 흡인성 기를 나타내고, 각 R4는, 각각 독립적으로, H, 할로겐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 디알킬아미노, 알케닐옥시, 알케닐티오, 알케닐아미노, 디알케닐아미노, 알키닐옥시, 알키닐티오, 알키닐아미노, 디알키닐아미노, 알콕시알킬옥시 또는 다음의 일반식 (4)로 표시되는 치환기를 나타내고,
    [식 15]
    Figure 112008065985566-PCT00048
    일반식 (4) 중, WG1은, 전자 흡인성 기를 나타내고,
    E는, 아실 또는 다음의 일반식 (5)로 표시되는 치환기를 나타내고,
    [식 16]
    -E1-링커-고상담체 (5)
    일반식 (5) 중, E1은, 단결합 또는 다음의 일반식 (6)으로 표시되는 치환기를 나타내고,
    [식 17]
    Figure 112008065985566-PCT00049
    일반식 (6) 중, Q, WG2는, 상기와 동일한 의미이고,
    T는, H, 아실옥시, 할로겐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 디알킬아미노, 알케닐옥시, 알케닐티오, 알케닐아미노, 디알케닐아미노, 알키닐옥시, 알키닐티오, 알키닐아미노, 디알키닐아미노, 알콕시알킬옥시, 상기 일반식 (4)로 표시되는 치환기 또는 상기 일반식 (5)로 표시되는 치환기를 나타내고, 단, E 또는 T 중 어느 한쪽은 치환기 (5)이다.
    공정 B:
    공정 A에서 제조되는 (올리고)핵산 유도체 (2)에, 활성화제를 이용하여 핵산 모노머 화합물을 축합시켜, 다음의 일반식 (7)로 표시되는 올리고핵산 유도체를 제조하는 공정,
    [식 18]
    Figure 112008065985566-PCT00050
    일반식 (2) 및 일반식 (7) 중, 각 BX, 각 Q, 각 R4, 각 WG2는, 각각 독립적으 로, 상기와 동일한 의미이고, E, n, R1, T는, 상기와 동일한 의미이다.
    공정 C:
    공정 B에서 미반응인 (올리고)핵산 유도체 (2)의 5'위치의 수산기를 캡핑(capping)하는 공정,
    [식 19]
    Figure 112008065985566-PCT00051
    일반식 (2) 및 일반식 (8) 중, 각 BX, 각 Q, 각 R4, 각 WG2는, 각각 독립적으로, 상기와 동일한 의미이고, E, n, T는, 상기와 동일한 의미이고, R5는, 메틸, 페녹시메틸, tert-부틸페녹시메틸을 나타낸다.
    공정 D:
    공정 B에서 제조되는 올리고핵산 유도체 (7)에 산화제를 작용시킴으로써 아인산기를 인산기 또는 티오인산기로 변환하는 공정,
    [식 20]
    Figure 112008065985566-PCT00052
    일반식 (7) 및 일반식 (9) 중, 각 BX, 각 Q, 각 R4, 각 WG2는, 각각 독립적으로, 상기와 동일한 의미이고, E, n, R1, T는, 상기와 동일한 의미이다.
    공정 E:
    공정 D에서 제조되는 올리고핵산 유도체 (9)를 고상 담체로부터 분리하고, 각 핵산 염기부 및 각 인산기의 보호기를 탈리하는 공정,
    [식 21]
    Figure 112008065985566-PCT00053
    일반식 (9) 및 일반식 (10) 중, 각 B, 각 BX, 각 Q, 각 R4, 각 WG2는, 각각 독립적으로, 상기와 동일한 의미이고, E, n, R, R1, T, Z는, 상기와 동일한 의미이다.
    공정 F:
    다음의 일반식 (10)으로 표시되는 올리고핵산 유도체에, 테트라부틸암모늄플루오라이드(TBAF)를 작용시켜, 각 리보오스의 2'위치 수산기의 보호기를 탈리하는 공정에 있어서, 테트라히드로푸란을 함유하고 있어도 좋은, 술폭시드계 용매 혹은 아미드계 용매 또는 이들의 혼합 용매를 반응 용매로서 이용하는 것을 특징으로 하는, 다음의 일반식 (11)로 표시되는 올리고핵산 유도체를 제조하는 공정,
    [식 22]
    Figure 112008065985566-PCT00054
    일반식 (10) 및 일반식 (11) 중, 각 B, 각 Q, 각 R, 각 R4는, 각각 독립적으로, 상기와 동일한 의미이고, n, R1, Z는, 상기와 동일한 의미이다.
    공정 G:
    공정 F에서 제조되는 올리고핵산 유도체 (11)의 5'위치의 수산기를 탈리하는 공정,
    [식 23]
    Figure 112008065985566-PCT00055
    일반식 (11) 및 일반식 (A) 중, 각 B, 각 Q, 각 R은, 각각 독립적으로, 상기와 동일한 의미이고, n, R1, Z는, 상기와 동일한 의미이다.
    공정 H:
    공정 G에서 제조되는 올리고 RNA (A)를 분리 정제하는 공정.
  16. 제15항에 있어서, 공정 A∼D를 반복함으로써 원하는 사슬 길이의 올리고 RNA (A)를 제조하는 올리고 RNA의 제조 방법.
  17. 제15항에 있어서, 공정 B에 있어서, 적어도 하나는, 핵산 모노머 화합물로서 다음의 일반식 (B)로 표시되는 화합물을 이용하는 것을 특징으로 하는 올리고 RNA의 제조 방법:
    [식 24]
    Figure 112008065985566-PCT00056
    일반식 (B) 중, Bz는, 보호기를 갖고 있어도 좋은 핵산 염기 또는 그 수식체를 나타내고,
    R1은, 다음의 일반식 (3)으로 표시되는 치환기를 나타내고,
    [식 25]
    Figure 112008065985566-PCT00057
    일반식 (3) 중, R11, R12, R13은, 동일하거나 또는 다르며, 수소 또는 알콕시를 나타내고,
    R2a, R2b는, 동일하거나 혹은 다르며, 알킬을 나타내거나, 또는, R2a, R2b가 인접하는 질소 원자와 합쳐져서 형성하는, 5∼6원의 포화 아미노환기를 나타내고, 이러한 포화 아미노환기는, 질소 원자 외에 환(環) 구성 원자로서 산소 원자 또는 유 황 원자를 1개 갖고 있어도 좋고, WG1, WG2는, 동일하거나 또는 다르며, 전자 흡인성 기를 나타낸다.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 술폭시드계 용매가 다음의 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 화합물인 올리고핵산 유도체의 제조 방법:
    [식 26]
    Figure 112008065985566-PCT00058
    일반식 (Ⅰ) 중, Ra, Rb는, 동일하거나 또는 다르며, 알킬을 나타낸다.
  19. 제18항에 있어서, 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 화합물이 디메틸술폭시드인 올리고핵산 유도체의 제조 방법.
  20. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 아미드계 용매가 다음의 일반식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물인 올리고핵산 유도체의 제조 방법:
    [식 27]
    Figure 112008065985566-PCT00059
    일반식 (Ⅱ) 중, Rc, Rd는, 동일하거나 혹은 다르며, 알킬을 나타내고, Re는, 수소 혹은 알킬을 나타내거나, 또는 Rd는 알킬을 나타내며, Rc와 Re는 인접하는 질소 원자와 탄소 원자가 합쳐져서 형성하는, 5 혹은 6원의 포화 환상 아미드기를 나타낸다.
  21. 제20항에 있어서, 일반식 (Ⅱ)로 표시되는 화합물이 N,N-디메틸포름아미드인올리고 RNA의 제조 방법.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, WG1이 시아노인 올리고 RNA의 제조 방법.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 F에 있어서, 추가로, 니트로알칸, 알킬아민, 아미딘, 티올, 티올 유도체 또는 이들의 임의의 혼합물을 함유하는 반응 용매를 이용하는 것을 특징으로 하는 올리고 RNA의 제조 방법.
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