CN112007066B - 荠菜提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及荠菜提取物及其制备方法和应用，还涉及荠菜提取物的温敏型眼用凝胶的制备及其在制备治疗白内障和干眼症方面的应用。所述的荠菜提取物通过如下方法制备：将荠菜粉碎、提取或酶解后提取得到总黄酮含量为6％以上的浸膏，将浸膏经水溶解后经D101、AB‑8或AB‑8‑D101串联型大孔树脂富集得到一种总黄酮含量在50％以上荠菜提取物。该提取物具有很好的治疗白内障、干眼症和缓解眼疲劳的作用，用该提取物制备的温敏眼用凝胶在32.5℃发生相的转变，延长了在眼部的滞留时间，本发明中的中药荠菜来源广泛，提取物的制备及凝胶的制备方法简单，易操作，因此将荠菜制备成预防白内障、干眼症等眼部疾病的药物具有十分重要的意义。

Description

荠菜提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及荠菜提取物及其制备方法和应用，还涉及荠菜提取物的温敏型眼用凝胶的制备及其在制备治疗白内障和干眼症药物中的应用。
背景技术
白内障是世界范围内最常见的致盲性眼病，根据病因、发病年龄、发展速度、晶体混浊程度和部位可以分为很多种类，其中最为常见的是老年性白内障，其发病机制主要是跟氧化应激有关，其发病比例随着年龄的增长而增加。但是目前尚无药物可以有效地预防和延缓老年性白内障的发生和发展，手术治疗是其惟一有效的方法。虽然目前手术治疗白内障的方法有很多，例如白内障超声乳化术、白内障囊内和囊外手术，但上述方法都存在一定的风险，并且伴随着许多术后并发症，如青光眼、后囊破裂、手术引起的炎症等。因此，通过寻找治疗白内障的高效低毒的药物，通过药物去预防、控制和治疗早期白内障的形成和发展是很有必要的。
干眼症是指任何原因造成的泪液质或量异常或动力学异常，导致泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适和(或)眼表组织病变特征的多种疾病的总称，患病率达5％～34％。轻度干眼可引起眼部干涩、烧灼、疼痛、易疲劳等眼部不适症状，若无规范治疗，进一步发展可导致角膜上皮持续损害、角膜新生血管形成及眼表鳞状上皮化生等眼表异常，从而产生视力障碍，甚至致盲。目前尚无药物可以彻底地治疗干眼症。因此，开发防治干眼症的高效低毒的药物十分必要。
荠菜(Capsella bursa-pastoris(L.)Medic)别名护生草是一种药食同源的十字花科植物，出自《千金·食治》。据《本草纲目》记载其气味甘、温，具有和中益气，利肝明目的功效。荠菜多为野生广泛分布于全国，在江苏、安徽及上海郊区有栽培。
《中药大辞典》中记载荠菜中的化学成分包含草酸、酒石酸、苹果酸、丙酮酸、对氨基苯磺酸及延胡索酸等有机酸；精氨酸，天冬氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、半胱氨酸等氨基酸；蔗糖、山梨糖、乳糖、氨基葡萄糖、山梨糖醇、甘露糖醇、侧金盏花醇等糖分，又含胆碱、乙酰胆碱、酪胺、马钱子碱，皂苷，同时黄酮类成分包含芸香苷、橙皮苷、木犀草素7-芸香糖苷、槲皮素-3-甲醚、香叶木苷、刺槐乙素等。具有止血，收缩子宫，降血压的作用。
回流法提取荠菜中总黄酮的工艺条件(吴洪特,刘霞.湖北农业科学,2009,48(1),179-180)，该文献通过80℃回流提取，当料液比为1:25(g:mL)，乙醇浓度为75％，NaOH为2％，回流时间为2.5h时得到最佳得提取工艺，此时测得荠菜中总黄酮平均提取率为2.18％，
蒙药荠菜总黄酮的提取及抗炎作用研究(苏力德,代那音台,乌恩奇.内蒙古大学学报,2016,31(1),64-67)经95％乙醇回流提取后，使用乙酸乙酯、氯仿进行萃取后利用大孔树脂D101进行富集纯化，该方法不适宜用于工业化生产。药理实验选用的是小鼠耳肿胀模型，是经典的炎症模型，但无法推测出荠菜黄酮对白内障及干眼症具有治疗作用。
中国专利CN 101693075B，CN 106166234A，CN 105687440A，CN 1054524122A所述的均为含有荠菜的用于治疗白内障的复方组合物或中药制剂，但这些组合物所含中药味数较多，皆在10味左右，且荠菜所占比例较低并非为主药，因此并不能证明荠菜单味药材或荠菜单味药材提取物具有预防、治疗、缓解白内障的作用。
中国专利CN 105616997A，CN 105194427A所述的均为含有荠菜的用于治疗干眼症的复方组合物或中药制剂。这些组合物所含中药味数较多皆为10味，荠菜在组合物中所占比例较低并非为主药，因此并不能证明荠菜单味药材或单味药材的提取物具有治疗干眼症的药理作用。
使用传统方法如浸泡法、回流提取法、超声辅助提取法等方法提取荠菜，总黄酮提取率低、且耗时长，而且药材需要粉碎成粗粉才能提取完全，但给过滤带来困难。由于荠菜茎秆表面纤维素包裹内部的有效成分而使其不易提取出来，通过加入纤维素酶浸泡，可以大大减少提取时间。通过大孔树脂串联的方式可以富集黄酮，且荠菜黄酮提取物生物活性方面目前仅有抗炎及体外抗氧化方面的报道，没有文献报道过荠菜单味药材或单味药材提取物或其所制备的药物制剂对白内障及干眼症具有预防、缓解、治疗的作用。因此开发一种提高荠菜黄酮提取率的制备方法，并用此制备方法所制备的提取物在白内障及干眼症防治上具有重要的意义。
发明内容
为了充分利用资源，本发明提供了荠菜提取物的制备方法，以及其在制备治疗白内障等眼部疾病药物中的应用。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
1.荠菜浸膏的制备：
荠菜浸膏制备：
(1)将荠菜粉碎，荠菜粉末用50％-80％醇溶液回流提取，滤液减压浓缩得荠菜浸膏。
(2)将荠菜粉碎，荠菜粉末加入或不加入含有纤维素酶的水或醇溶液进行超声提取，补加一定体积的75％-90％乙醇后再进行回流提取，滤液减压浓缩得到荠菜浸膏。
所述的中药材粉碎目数为10-40目，醇溶液为乙醇的含水溶液。
所述的纤维素酶的浓度为：0.8-1.6mg/mL；
所述的超声提取时间15-30min，超声提取温度为40-60℃，超声提取时溶液为水或浓度为1％-80％的乙醇，加入冰醋酸调节水或醇溶液的pH值至4-6，料液比为：1:8-1:20；
回流提取时乙醇浓度为50％-80％，回流提取时间0.5-2h，回流温度为70～90℃，料液比为：1:8-1:20，回流提取次数为1-3次。
进一步地，回流提取时，提取时间为0.5h-2h，乙醇浓度为70％-80％，料液比为1：18-1：20，提取次数为2-3次。
按照本发明的提取方法(1)所得的荠菜浸膏以总黄酮含量为指标，以荠菜中特有的成分2″-O-α-L-阿拉伯糖异荭草苷为对照品，分光光度法测得其总黄酮含量大于5％。
按照本发明的提取方法(2)，当提取方法为超声-回流法时，超声提取时间为15-30min，超声提取乙醇浓度为20％-75％，超声提取温度为40-60℃，溶液的pH值为4-6，料液比为1：5-1：8，超声提取后加入一定体积的75％-90％乙醇，使回流提取时的乙醇浓度为70％-80％，且料液比达到1：18-1：20，回流提取时间为1-2h，提取次数为2-3次。所得的荠菜浸膏以总黄酮含量为指标，以荠菜中特有的成分2″-O-α-L-阿拉伯糖异荭草苷为对照品，分光光度法测得其总黄酮含量大于6％。
按照本发明的提取方法(2)，当提取方法为超声-回流法时，超声提取时间为15-30min，超声提取为水溶液或浓度为1％-20％的乙醇溶液，超声提取温度为40-60℃，溶液的pH值为4-6，料液比为1：5-1：8，超声提取后加入一定体积的75％-90％乙醇，使回流提取时的乙醇浓度为70％-80％，且料液比达到1：18-1：20，回流提取时间为1-2h，提取次数为2-3次。所得的荠菜浸膏以总黄酮含量为指标，以荠菜中特有的成分2″-O-α-L-阿拉伯糖异荭草苷为对照品，分光光度法测得其总黄酮含量大于7％。
2.荠菜提取物的制备：
浸膏用水溶解，经大孔树脂富集，得到醇溶液洗脱部位，减压蒸干得荠菜提取物。
所述的树脂为D101、AB-8或AB-8-D101串联型大孔树脂，所述的醇溶液部位均为10％-90％。树脂上样浓度为0.2-0.3g生药/mL；树脂柱径高比为1:3-1:7；洗脱流速为1-3BV/h。按照本发明的提取方法，所得的荠菜提取物以总黄酮含量为指标，以荠菜中特有的成分2″-O-α-L-阿拉伯糖异荭草苷为对照品，分光光度法测得其总黄酮含量大于50％。
当大孔树脂型号为AB-8或AB-8-D101串联型大孔树脂时，所述醇溶液部位为30％-70％，上样浓度为0.2-0.3g生药/mL，树脂柱径高比为1:3-1:7。按照本发明的提取方法所得的荠菜提取物以总黄酮含量为指标，以荠菜中特有的成分2″-O-α-L-阿拉伯糖异荭草苷为对照品，分光光度法测得其总黄酮含量大于60％。
当大孔树脂型号为AB-8-D101串联型大孔树脂时，所述醇溶液部位为40-85％,上样浓度为0.25-0.3g生药/mL,串联时D101大孔树脂柱径高比为1:5-1:6，AB-8大孔树脂柱径高比为1:6-1:7。按照本发明的提取方法所得的荠菜提取物以总黄酮含量为指标，以荠菜中特有的成分2″-O-α-L-阿拉伯糖异荭草苷为对照品，分光光度法测得其总黄酮含量大于70％。
综合以上，本发明所述的提取方法，提取总黄酮收率高，方法简单重现性好。总黄酮含量在50％以上。
3.荠菜提取物颗粒剂的研究
以糖粉和糊精为辅料，加入一定量的荠菜提取物，制软材，过筛、干燥、整粒后即得荠菜提取物颗粒剂。
4.荠菜提取物口服液的研究
以纯化水将荠菜提取物溶解、木糖醇和苯甲酸溶解，分装，热压灭菌30分钟，冷却，即得荠菜提取物口服液。
5.荠菜提取物温敏型眼用凝胶的研究
以泊洛沙姆407与泊洛沙姆188按一定比例(P407：P188＝10：1-15：1)混合所得溶液为基质，加入一定浓度的pH值为7.4荠菜提取物磷酸盐缓冲溶液，4℃水浴搅拌使泊洛沙姆颗粒均被水润湿，然后4℃冰箱保存24h，直至得到澄清、无团块、均匀分散的溶液，紫外灭菌30分钟。即得荠菜提取物温度敏感型眼用凝胶。
荠菜提取物磷酸盐缓冲溶液的配制：取荠菜提取物适量，加0.01mol/L的磷酸盐缓冲液使成浓度为5-6mg/mL。
荠菜提取物、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188的质量比为：0.01～0.05：1～12：0.1～0.8。
6.荠菜提取物防治白内障的研究
分别建立动物D-半乳糖性白内障模型(口服给药)、硒性白内障模型(滴眼给药)，给予一定浓度荠菜浸膏或提取物治疗，裂隙灯显微镜下观察晶状体浑浊程度，检测晶状体脂质过氧化物丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量；实验数据采用SPSS16.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析(One-WayANOVA)，方差齐性时用LSD t-test分析方法进行组间比较，方差不齐时用Dunnett’sT3分析，实验结果以平均值±标准误差(Mean±SEM)表示。与模型组相比，荠菜提取物组白内障发展明显减缓(P<0.05)，MDA含量较模型组显著降低，SOD，GSH-px含量显著高于模型组(P<0.05)。
7.荠菜提取物防治干眼症的研究
建立动物干眼症模型(滴眼给药)，给予一定浓度荠菜提取物治疗，裂隙灯显微镜下观察眼角膜炎症程度，检测泪液分泌量、根据角膜炎症程度评分、观察角膜组织切片，检测角膜组织中TNF-α、IL-1β蛋白的表达量；实验数据采用SPSS16.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，方差齐性时用LSDt-test分析方法进行组间比较，方差不齐时用Dunnett’sT3分析，实验结果以平均值±标准误差(Mean±SEM)表示。与模型组相比，荠菜浸膏组及提取物组干眼症治疗效果明显(P<0.05)，泪液量显著高于模型组(P＜0.05)，炎症评分、TNF-α、IL-1β蛋白的表达均显著低于模型组(P<0.05)。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例进行进一步阐述。应理解为这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
具体实施方式
实施例1
将荠菜粉碎，取50g荠菜粉末，加入5倍量，pH值为4.7，纤维素酶浓度为0.8-1.2mg/ml的水溶液超声提取20分钟，加入荠菜粉末15倍量的75％乙醇后回流提取2次，每次1小时，减压回收溶剂，浓缩至干，得荠菜浸膏。以2″-O-α-L-阿拉伯糖异荭草苷为对照品，分光光度法测得荠菜浸膏中总黄酮含量为7.81％。取50mL浓度为0.25g生药/mL的样品溶液，使其被体积共40ml的型号为D101/AB-8型大孔树脂串联吸附，其中D101树脂柱径高比(d/H)为1:5，AB-8树脂柱径高比(d/H)为1:7，上样流速为2BV/h，洗脱流速为2BV/h。先用水洗脱，至洗脱液进行Molish反应为阴性，再用10％乙醇洗脱后，最后用40％的乙醇洗脱，均洗至洗脱液近无色。收集40％乙醇洗脱液减压回收至干，得荠菜提取物，测得提取物总黄酮含量为70.6％。
实施例2
将荠菜粉碎，取50g荠菜粉末，加入6倍量pH值为4.7，纤维素酶浓度为1.2-1.6mg/ml的75％乙醇溶液超声提取1次，共20分钟，加入荠菜粉末14倍量的75％乙醇之后回流提取2次，每次1小时，减压回收溶剂，浓缩至干，得荠菜浸膏。以2″-O-α-L-阿拉伯糖异荭草苷为对照品，分光光度法测得荠菜浸膏中总黄酮含量为6.49％。取浓度为0.2g生药/mL的样品溶液50mL，使其吸附于40ml型号为D101型大孔树脂柱上,其径高比(d/H)为1:3，上样流速为2BV/h，洗脱流速为1BV/h。先用水洗脱，至洗脱液进行Molish反应为阴性，用10％乙醇洗脱后，再用50％的乙醇洗脱，均洗至洗脱液近无色。收集50％乙醇洗脱液减压回收至干，得荠菜提取物，测得提取物总黄酮含量为54.2％。
实施例3
将荠菜粉碎，取50g荠菜粉末，加入5倍量pH值为5，纤维素酶浓度为0.8-1.2mg/ml的25％乙醇超声提取20分钟之后，加入荠菜粉末15倍量的90％乙醇回流提取2次，每次1小时，减压回收溶剂，减压浓缩至干，得荠菜浸膏，以2″-O-α-L-阿拉伯糖异荭草苷为对照品，分光光度法测得荠菜浸膏中总黄酮含量为6.96％。取浓度为0.2g生药/mL的样品溶液50mL，使其吸附于40ml型号为AB-8型大孔树脂柱上,其径高比(d/H)为1:5，上样流速为2BV/h，洗脱流速为1BV/h。先用水洗脱，至洗脱液进行Molish反应为阴性，再用10％乙醇洗脱后，最后用60％的乙醇洗脱，均洗至洗脱液近无色。收集60％乙醇洗脱液减压回收至干，得荠菜提取物，测得提取物总黄酮含量为59.1％。
实施例4
将荠菜粉碎，取50g荠菜粉末以20倍量浓度为75％的乙醇溶液回流提取3次，每次1h，减压回收溶剂，减压浓缩至干，得荠菜浸膏，以2″-O-α-L-阿拉伯糖异荭草苷为对照品，分光光度法测得荠菜浸膏中总黄酮含量为6.20％。取浓度为0.25g生药/mL的样品溶液50mL，使其被共40ml，型号为D101/AB-8型串联的大孔树脂吸附，其中D101树脂柱径高比(d/H)为1:5，AB-8树脂柱径高比(d/H)为1:7，上样流速为2BV/h，洗脱流速为2BV/h。先用水洗脱，至洗脱液进行Molish反应为阴性，再用10％乙醇洗脱后，最后用40％的乙醇洗脱，均洗至洗脱液近无色。收集40％乙醇洗脱液减压回收至干得荠菜提取物，得荠菜提取物，测得提取物总黄酮含量为63.2％。
实施例5
荠菜提取物来自实施例3。取荠菜提取物20g加入20g糖粉、70g糊精，以80％乙醇混匀制成软材(握之成团，轻压即散)，过20目筛制粒，70℃进行干燥，10目筛、80目筛整粒后得荠菜提取物颗粒98g。
实施例6
荠菜提取物来自实施例3。取荠菜提取物5g，木糖醇5g，苯甲酸钠0.3g，加水至100ml，搅匀，静置，滤过，分装入10ml口服液玻璃瓶密封，流动蒸汽100℃灭菌30min，即得荠菜提取物口服液。
实施例7
荠菜提取物来自实施例3。分别称取配制不同浓度泊洛沙姆溶液所需的P4072.3g、P1880.5g，于磁力搅拌下少量多次加入装有10mL浓度为5mg/ml，pH值为7.4的荠菜提取物磷酸盐缓冲盐溶液的西林瓶中，4℃水浴搅拌使泊洛沙姆颗粒均被水润湿，然后4℃冰箱保存24h，直至得到澄清、无团块、均匀分散的溶液，紫外灯下灭菌30分钟。采用倒置试管法测定胶凝温度T：量取制备的温度敏感型凝胶溶液2mL，置于5mL试管中，恒温水浴缓慢升温，升温速率为0.2℃·min-1，每升高0.2℃，迅速倒置试管，观察溶液的流动情况，试管内液体不再流动时的温度即为T，每个样品测定3次，取平均值。测得胶凝温度为32.5℃。
实施例8
荠菜提取物对D-半乳糖性白内障大鼠的防治作用
荠菜提取物来自实施例3。
Wistar大鼠，50只，5周齡，体重130-150g，雌雄各半，SPF级。大鼠经裂隙灯显微镜检查眼部无异常者，按性别和体重随机分为5组，每组10只，左右眼均为实验眼。具体处理方案如下：正常对照组：不注射半乳糖，实验第8d开始灌胃0.5％CMC-Na；造模组：第1周，50％D-半乳糖腹腔注射，剂量为10ml/(kg*d)，每日1次；第2周和第3周的剂量分别为15、20ml/(kg*d)。另在腹腔注射第7d起，饮水中加入5％D-半乳糖，诱发大鼠白内障，至第21天造模结束。实验第8d开始灌胃0.5％CMC-Na。阳性药组：诱发白内障同模型组，实验第8d开始灌胃给药障眼明片(0.225g/kg)；荠菜提取物高剂量组：诱发白内障同模型组，实验第8d开始给药，给药剂量为324mg/kg体重。荠菜提取物低剂量组：诱发白内障同模型组，实验第8d开始给药，给药剂量为108mg/kg体重。每日给药1次，给药途径为灌胃，各组给药量均为1ml/100g。造模期间定时以裂隙灯观察白内障形成情况。分别于给药第5、10、20、30d，用复方托吡卡胺滴眼液滴眼，左右眼各1滴充分扩瞳，30min后在裂隙灯显微镜下观察鼠眼白内障程度，按照表1中方法将晶状体混浊分成6期。
表1晶体混浊度分期标准
Figure BDA0002725173080000071
Figure BDA0002725173080000081
给药结束后将上述5组大鼠均脱臼处死，剥离晶体，冰冷生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重，置于EP管中，加入9倍晶体质量体积的4℃PBS，将EP管浸入冰水混合物中，用超声波处理器充分破碎，制成质量体积分数为10％的晶体匀浆。4℃，4000r/min离心10min，取上清液进行SOD、MDA、GSH-px检测。同时用BCA法测定晶体匀浆中的可溶性蛋白含量。计量资料以平均值±标准差
Figure BDA0002725173080000082
表示，采用组间t检验。统计软件为SPSS16.0。
用裂隙灯显微镜观察鼠眼晶体混浊度，结果见表2、表3，表中以单只眼进行统计。由表2、表3可知，模型组大鼠第10天已经全部发生早期白内障，病情发展至第30天，白内障程度以Ⅲ期为主，占总数的75％，高度混浊，空泡扩展至中央，明显比正常对照组严重。
观察结果可知，荠菜提取物组大鼠白内障的发展速度比模型组明显要慢，障眼明组大鼠白内障发展速度比模型组及其他给药组都要慢些。
取大鼠眼晶体匀浆的上清液测定MDA、SOD和GSH-px水平，结果见表4。结果显示，白内障模型组大鼠晶体内MDA含量明显高于正常对照组，差异有显著性(P<0.01)，而荠菜提取物高剂量组动物晶体内MDA含量明显低于白内障模型组，差异有显著性(P<0.05)。正常对照组SOD和GSH-px含量高于白内障模型组，差异有统计学意义(P<0.01)，荠菜提取物高剂量组大鼠晶状体SOD、GSH-px活力明显高于白内障模型组，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。障眼明组大鼠晶状体MDA含量、SOD、GSH-px活力与白内障模型组比较均有极显著性差异(P<0.01)。
表2荠菜提取物对D-半乳糖性白内障大鼠的防治作用
Figure BDA0002725173080000083
表3给药第30天各组大鼠白内障发展程度的比较(％)
Figure BDA0002725173080000091
表4大鼠晶状体内MDA含量、GSH-px和SOD活性的变化
Figure BDA0002725173080000092
Figure BDA0002725173080000093
注：与对照组比较：##，P<0.01；与模型组比较：*，P<0.05；**，P<0.01
结论：荠菜提取物在一定剂量下，通过灌胃给予大鼠，有增强晶体中SOD和GSH-px活力，降低MDA含量的作用，说明荠菜提取物(324mg/kg体重)可通过提高晶体抗氧化能力，减少脂质过氧化物的生成，而起到防治D-半乳糖性白内障的作用。
实施例9
荠菜浸膏及提取物对硒性白内障大鼠的防治作用
荠菜浸膏Ⅰ和Ⅱ分别来自实施例1和4
荠菜提取物Ⅰ和Ⅱ分别来自实施例1和3
Wistar幼鼠，70只，13天龄，SPF级。选取吡诺克辛钠滴眼液为阳性药。正常对照组(10只)颈背部皮下注射生理盐水，造模组(60只)颈背部皮下注射Na2SeO3溶液，隔天注射一次，共四次，每次15μmol/kg，每注射一次亚硒酸钠溶液24h后裂隙灯观察晶状体浑浊情况，记录并分按等级划分。14天幼鼠开眼，同时开始给药。造模组随机分为白内障模型组，吡诺克辛钠组、荠菜浸膏Ⅰ组、荠菜浸膏Ⅱ组、荠菜提取物Ⅰ组、荠菜提取物Ⅱ组，每组10只，白内障模型组、吡诺克辛钠组、荠菜浸膏Ⅰ组、荠菜浸膏Ⅱ组、荠菜提取物Ⅰ组、荠菜提取物Ⅱ组分别用pH7.4磷酸盐缓冲液、吡诺克辛钠滴眼液滴眼、5mg/mL荠菜浸膏Ⅰ滴眼液、5mg/mL荠菜浸膏Ⅱ滴眼液、5mg/mL荠菜提取物Ⅰ滴眼、5mg/mL荠菜提取物Ⅱ滴眼，50μL/次，4次/日，每日裂隙灯观察晶状体并记录，结果见表5、6，表中以单只眼进行统计。由表5、表6可知，模型组大鼠第5天已经全部发生早期白内障，病情发展至第15天，白内障程度以Ⅳ期为主，占总数的70％，高度混浊，空泡扩展至中央，明显比正常对照组严重；吡诺克辛钠组、荠菜浸膏Ⅰ组、荠菜浸膏Ⅱ组、荠菜提取物Ⅰ组、荠菜提取物Ⅱ组，未全部发展成早期白内障，说明荠菜浸膏及提取物对早期白内障有明显的防治作用。
实验15天后取鼠眼晶体匀浆的上清液测定MDA、SOD和GSH-px水平，结果见表7。晶状体处理方法同实施例8。
表5荠菜提取物对硒性白内障大鼠的防治作用
Figure BDA0002725173080000101
表6给药第15天各组白内障发展程度的比较(％)
Figure BDA0002725173080000102
Figure BDA0002725173080000111
表7幼鼠晶状体内MDA含量、GSH-px和SOD活性的变化
Figure BDA0002725173080000112
Figure BDA0002725173080000113
注：与对照组比较：##，P<0.01；与模型组比较：*，P<0.05；**，P<0.01.
结论：荠菜浸膏及提取物在一定剂量下，有增强晶状体中SOD和GSH-px活力，降低MDA含量的作用，说明荠菜浸膏及提取物可通过提高晶状体抗氧化能力，减少脂质过氧化物的生成，而起到防治硒性白内障的作用。
实施例10
荠菜浸膏及提取物对干眼症的防治作用
荠菜浸膏Ⅰ和Ⅱ分别来自实施例1和4
荠菜提取物Ⅰ和Ⅱ分别来自实施例1和3
BALB/C小鼠，30只，雄性，体重18～20g，SPF级，健康且无眼表异常。其中25只小鼠(50眼)予以0.2％苯扎氯铵溶液滴眼，3次/天(早8∶00，晚18∶00)，50μl/次，持续14天诱导干眼模型，剩余5只(10眼)不作任何处理，作为正常对照组。每隔7天小鼠麻醉用泪液检测专用滤纸测泪液量、裂隙灯显微镜观察眼角膜炎症。角膜荧光素钠染色：小鼠结膜囊内滴入1％的荧光素钠溶液1滴，1min后，裂隙灯显微镜钴蓝光下观察角膜上皮荧光素钠染色情况。评分参照Pauly A标准，角膜分为4个象限，每象限0～4分，总分为16分。0分：无着染；1分：点状着染，但少于30个；2分：着染点数多于30个，但不弥散；3分：明显弥散着染但无斑块状染色；4分：斑块状染色。筛选条件：角膜荧光素染色总分12分以上。
14天造模结束后，25只小鼠随机分为干眼症模型组、荠菜浸膏Ⅰ组、荠菜浸膏Ⅱ组、荠菜提取物Ⅱ、组荠菜提取物Ⅰ组，5只/组。分别滴眼pH7.4磷酸盐缓冲液、5mg/mL荠菜浸膏Ⅰ滴眼液、5mg/mL荠菜浸膏Ⅱ滴眼液、5mg/mL荠菜提取物Ⅰ滴眼液、5mg/mL荠菜提取物Ⅱ滴眼液，4次/天，14天后摘除眼角膜，制作病理切片考察各组炎症情况。每隔7天小鼠麻醉测泪液量、裂隙灯显微镜观察眼角膜炎症。结果见表12，表中以单只眼进行统计。计量资料以平均值±标准差
Figure BDA0002725173080000121
表示，采用组间t检验。统计软件为SPSS16.0。
表8BALB/C小鼠泪液分泌量、角膜染色评分比较
Figure BDA0002725173080000122
Figure BDA0002725173080000123
注：与对照组比较：##，P<0.01；与模型组比较：*，P<0.05；**，P<0.01.
结论：荠菜浸膏及提取物能够显著提高干眼症小鼠泪液分泌量，显著降低角膜染色评分。说明荠菜提取物对小鼠干眼症有明显的防治作用。

Claims (4)

1.荠菜提取物在制备治疗白内障或干眼症药物中的应用，其特征在于，所述的荠菜提取通过如下方法制备：
将荠菜粉碎，取50g荠菜粉末，加入5倍量，pH值为4.7，纤维素酶浓度为0.8-1.2 mg/ml的水溶液超声提取20分钟，加入荠菜粉末15倍量的75%乙醇后回流提取2次，每次1小时，减压回收溶剂，浓缩至干，得荠菜浸膏；取50mL浓度为0.25g生药/mL的样品溶液，使其被体积共40ml的型号为D101/AB-8型大孔树脂串联吸附，其中D101树脂柱径高比d/H为1:5，AB-8树脂柱径高比d/H为1:7，上样流速为2 BV/h，洗脱流速为2BV/h；先用水洗脱，至洗脱液进行Molish反应为阴性，再用10 %乙醇洗脱后，最后用40%的乙醇洗脱，均洗至洗脱液近无色，收集40%乙醇洗脱液减压回收至干，得荠菜提取物。
2.荠菜提取物在制备治疗白内障或干眼症药物中的应用，其特征在于，所述的荠菜提取通过如下方法制备：
将荠菜粉碎，取50g荠菜粉末，加入6倍量pH值为4.7，纤维素酶浓度为1.2-1.6 mg/ml的75%乙醇溶液超声提取1次，共20分钟，加入荠菜粉末14倍量的75%乙醇之后回流提取2次，每次1小时，减压回收溶剂，浓缩至干，得荠菜浸膏；取浓度为0.2g生药/mL的样品溶液50mL，使其吸附于40ml型号为D101型大孔树脂柱上,其径高比d/H为1:3，上样流速为2 BV/h，洗脱流速为1BV/h；先用水洗脱，至洗脱液进行Molish反应为阴性，用10 %乙醇洗脱后，再用50%的乙醇洗脱，均洗至洗脱液近无色，收集50%乙醇洗脱液减压回收至干，得荠菜提取物。
3.荠菜提取物在制备治疗白内障或干眼症药物中的应用，其特征在于，所述的荠菜提取通过如下方法制备：
将荠菜粉碎，取50g荠菜粉末，加入5倍量pH值为5，纤维素酶浓度为0.8-1.2mg/ml的25%乙醇超声提取20分钟之后，加入荠菜粉末15倍量的90%乙醇回流提取2次，每次1小时，减压回收溶剂，减压浓缩至干，得荠菜浸膏；取浓度为0.2g生药/mL的样品溶液50mL，使其吸附于40ml型号为AB-8型大孔树脂柱上,其径高比d/H为1:5，上样流速为2 BV/h，洗脱流速为1BV/h；先用水洗脱，至洗脱液进行Molish反应为阴性，再用10 %乙醇洗脱后，最后用60%的乙醇洗脱，均洗至洗脱液近无色，收集60%乙醇洗脱液减压回收至干，得荠菜提取物。
4.荠菜提取物在制备治疗白内障或干眼症药物中的应用，其特征在于，所述的荠菜提取通过如下方法制备：
将荠菜粉碎，取50g荠菜粉末以20倍量浓度为75%的乙醇溶液回流提取3次，每次1h，减压回收溶剂，减压浓缩至干，得荠菜浸膏；取浓度为0.25g生药/mL的样品溶液50mL，使其被共40ml，型号为D101/AB-8型串联的大孔树脂吸附，其中D101树脂柱径高比d/H为1:5，AB-8树脂柱径高比d/H为1:7，上样流速为2 BV/h，洗脱流速为2BV/h，先用水洗脱，至洗脱液进行Molish反应为阴性，再用10 %乙醇洗脱后，最后用40%的乙醇洗脱，均洗至洗脱液近无色，收集40%乙醇洗脱液减压回收至干得荠菜提取物，得荠菜提取物。
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