CN112004516A

CN112004516A - 皮肤屏障功能异常的改善用组合物

Info

Publication number: CN112004516A
Application number: CN201980022238.5A
Authority: CN
Inventors: 崔琁国; 金美善
Original assignee: LG Household and Health Care Ltd
Current assignee: LG H&H Co Ltd
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2020-11-27
Anticipated expiration: 2039-03-29
Also published as: US11484484B2; JP2021519769A; EP3777821A4; US20210022976A1; CN112004516B; CN118044994A; KR102166268B1; EP3777821A1; WO2019190290A1; KR20190114900A

Abstract

本发明涉及皮肤屏障功能异常的改善用化妆料组合物、皮肤屏障功能异常的预防或治疗用药学组合物、皮肤屏障功能异常的预防或改善用医药外品组合物、皮肤屏障功能异常的改善方法以及皮肤屏障功能异常的预防或治疗方法。通过本发明，羟基肉桂酸、乙酸异戊酯或甜菜碱独立于mTOR途径而促进角质形成细胞中的自噬作用活性并促进表皮的更替，从而可以通过增加表皮的厚度来改善屏障功能并防止老化导致的表皮层的弱化。

Description

皮肤屏障功能异常的改善用组合物

技术领域

本发明涉及皮肤屏障功能异常的改善用化妆料组合物、皮肤屏障功能异常的预防或治疗用药学组合物、皮肤屏障功能异常的预防或改善用医药外品组合物、皮肤屏障功能异常的改善方法以及皮肤屏障功能异常的预防或治疗方法。

背景技术

表皮(epidermis)是始终与外部的环境接触的组织，主要保护人体免受外部的物理损伤和化学物质的侵害，防止细菌、霉菌、病毒等侵入皮肤，并起到防止水分流失的保护屏障作用。表皮由基底层、有棘层、颗粒层和作为最外层的角质层构成，角质层会依次剥离而脱落，但位于基底膜的角质形成细胞不对称地分裂并向表皮外侧方向分化，从而维持表皮的结构、功能恒常性。最近，由于环境污染等的原因，不仅暴露在强紫外线下的情况增多，而且由微尘等引起的炎症反应、屏障功能的弱化以及由此导致皮肤的水分流失增加，同时皮肤老化加速，皮肤损伤相关的疾病的发病率呈增加趋势(KR 10-2015-0043026A)。

自噬作用(autophagy)是一种当细胞内应激因子过度产生或细胞内能量源耗尽时，通过分解老化或受损的细胞内物质和器官来去除损伤物质并再生能量的机制，不仅在各种上皮组织，而且在表皮中也观察到自噬作用的活性。根据各种报告，自噬作用对于维持表皮层的恒常性并发挥适当的皮肤屏障功能是必不可少的，特别是在表皮层的病毒感染、由紫外线引起的炎症反应、黑素体(melanosome)传递和角质形成细胞的分化中起重要作用，并且当角质形成细胞最终分化为角质层时，对去除线粒体、高尔基体、小胞体、核等起决定性作用。最近，各种研究已经报道，随着老化的进行或老化的加速，细胞内自噬活性迅速降低，并且当自噬作用被抑制时，老化的线粒体或结构变性的蛋白质等在细胞中过度累积，导致细胞中自由基和氧化应激增加，最终引起细胞死亡增加并且老化加速的结果。

LC3(轻链3，Light Chain 3)是一种在自噬作用时其量增加的蛋白质，并且它们在自噬作用过程中经历转录后变形的过程。被翻译成pro-LC3后，通过atg4(自噬相关蛋白4，autophagy-related protein 4)切割羧基末端的第22个氨基酸来生成细胞质形式LC3-I，并且在自噬作用期间LC3-I因atg3和atg7参与的泛素样体系，被磷脂酰乙醇胺(PE)脂质化(lipidation)，同时转换成LC3-II，从而LC3与自噬体相连。

mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，mammalian target of rapamycin)是一种ser/thr激酶，已知对ATP和氨基酸的变化有反应并且起到调节营养成分的利用可能性和细胞生长的均衡的作用。在可以获取充足营养成分的环境中，mTOR通过class I PI3K/Akt信号途径进行磷酸化后，将阳性信号传递至p70S6激酶，并参与eIF4E抑制剂4E-BP1的失活，从而导致特定mRNA群的翻译，并且还抑制自噬作用。

发明内容

技术课题

在本发明中，为了通过激活因老化或外部刺激而减少的自噬作用促进表皮分化来改善屏障功能，从源于天然物的单个化合物库中检索促进角质形成细胞的自噬作用活性的化合物，从而找出了羟基肉桂酸(hydroxycinnamic acid)、乙酸异戊酯(isoamyl acetate)和甜菜碱(betaine)。另外，基于体外实验确认了在3D人造皮肤模型(skin model)中促进自噬作用活性和增加表皮层厚度的功效，从而完成了本发明。

课题解决手段

本发明的一个目的是提供一种皮肤屏障功能异常的改善用化妆料组合物，其包含选自由羟基肉桂酸(hydroxycinnamic acid)、乙酸异戊酯(isoamyl acetate)和甜菜碱(betaine)组成的组中的一种以上的化合物或其可允许的盐作为有效成分。

本发明的另一目的是提供一种皮肤屏障功能异常的预防或治疗用药学组合物，其包含选自由羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱组成的组中的一种以上的化合物或其药学上可允许的盐作为有效成分。

本发明的又一目的是提供一种皮肤屏障功能异常的预防或改善用医药外品组合物，其包含选自由羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱组成的组中的一种以上的化合物或其药学上可允许的盐作为有效成分。

本发明的又一目的是提供一种皮肤屏障功能异常的改善方法，包括将上述化妆料组合物涂抹于个体的皮肤的步骤。

本发明的又一目的是提供一种皮肤屏障功能异常的预防或治疗方法，包括将上述药学组合物投入至除人以外的个体或涂抹于除人以外的个体的皮肤的步骤。

发明效果

通过本发明，羟基肉桂酸、乙酸异戊酯或甜菜碱独立于mTOR途径而促进角质形成细胞中的自噬作用活性并促进表皮的更替，从而可以通过增加表皮的厚度来改善屏障功能并防止老化导致的表皮层的弱化。

附图说明

图1是筛选角质形成细胞内自噬作用的活性化材料的结果。具体而言，图1A示出了对源于各种天然物的单个化合物库中细胞质内GFP-LC3的点(puncta)状小胞体增加的细胞数目进行比较的结果。

图1B示出了对引入GFP-LC3载体的HaCaT细胞，进行未处理(NT)、羟基肉桂酸、乙酸异戊酯或甜菜碱处理的荧光显微镜观察结果。

图2是确认甜菜碱的细胞毒性和是否促进角质形成细胞内自噬作用的结果。

具体而言，图2A确认了甜菜碱的按浓度处理的细胞毒性，图2B示出了甜菜碱的按浓度处理/按时间处理的LC3-II的增加。

图3示出了确认甜菜碱引起的自噬体的增加机制的实验结果。

图4示出了确认独立于mTOR途径自噬作用活性化机制的实验结果。

图5是在3D人造皮肤模型中确认表皮内分化促进效果和表皮厚度是否增加的结果。具体而言，图5a、5b和5c示出了在3D人造皮肤模型中将霜剂型的羟基肉桂酸、乙酸异戊酯或甜菜碱按浓度处理来确认是否促进自噬作用的结果，图5d示出了确认表皮厚度增加的结果。

具体实施方式

下面将对此进行具体说明。另一方面，本发明中公开的每个说明和实施形式也可适用于每个不同说明和实施形式。即，本发明中公开的多种要素的所有组合均属于本发明的范畴。另外，不能因以下记载的具体描述而限制本发明的范畴。

在用于实现上述目的的本发明的一个方面，提供一种皮肤屏障功能异常的改善用化妆料组合物，其包含选自由羟基肉桂酸(hydroxycinnamic acid)、乙酸异戊酯(isoamylacetate)和甜菜碱(betaine)组成的组中的一种以上的化合物或其可允许的盐作为有效成分。上述化妆料组合物可以包括选自由羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱组成的组中的两种以上的组合，但不限于此。

上述化妆料组合物中包含的选自由羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱组成的组中的一种以上的化合物或其可允许的盐促进角质形成细胞中的自噬作用活性并促进表皮的更替，从而可以通过增加表皮的厚度来改善屏障功能并防止老化导致的表皮层的弱化。

在本发明的一个实验例中，对引入GFP-LC3载体的HaCaT细胞处理预测为可促进自噬作用的候选化合物后，比较各细胞中GFP-LC3的点(puncta)状小胞体增加的细胞数目。其结果确认了，当进行羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱处理时，GFP-LC3的点状小胞体增加的细胞比例分别为20.8％、16.4％、25％，显著高于其他化合物。由此确认了，选自由羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱组成的组中的一种以上的化合物或其可允许的盐可用作用于激活角质形成细胞内自噬作用并改善皮肤屏障功能的化合物材料。

在本发明中，术语“羟基肉桂酸(hydroxycinnamic acid,C₉H₈O₃)”根据异构体的形式称为香豆酸(coumaric acid,，反式羟基肉桂酸(trans-hydroxycinnamic acid))或羟苯基丙烯酸(coumarinic acid,cis-hydroxycinnamic acid)，天然型是指反式香豆酸。上述香豆酸具有比羟苯基丙烯酸更稳定的形式，并具有无色的针状晶体。易溶于热水和乙醇，熔点为208℃。

在本发明中，术语“乙酸异戊酯(isoamyl acetate,C₇H1₄O₂)”也称为醋酸异戊酯(isopentyl acetate)，并且已知为透明液体形式的带有香蕉味的着香料。不易溶于水，溶于乙醇和有机溶剂，比重为0.868～0.878，沸点为142℃。

在本发明中，术语“甜菜碱(betaine)”是指化学式C₅H₁₁NO₂的三甲基甘氨酸(trimethylglycine,TMG)，并且在生物体内的线粒体中通过胆碱的不可逆氧化过程合成。由于对于传递结合到甘氨酸氮原子上的甲基来合成蛋氨酸是必不可少的，因此广泛用作作为一般饮食习惯摄取量较少的蛋氨酸的补充剂。另外，甜菜碱具有减少眼睛和皮肤刺激的效果，并具有特有的两性离子(zwitterionic)电磁特性。

在本发明中，术语“皮肤”是指覆盖动物体表的组织，并且是不仅包括覆盖面部或身体等的体表的组织，而且包括头皮和毛发的最广义的概念。同时，在本说明书中，皮肤不仅可以包括生物体皮肤，而且可以包括实现生物体皮肤状态的人造皮肤或皮肤模拟物。

在本发明中，术语“皮肤屏障功能”是指皮肤，特别是表皮的角质层防止水分向外部流出并控制从外部进出物质等起到与外部的隔离层作用的所有功能，但不限于此。

在本发明中，术语“皮肤屏障功能异常”不仅指上述皮肤屏障功能劣化或受损的状况，而且还指具有劣化或受损可能性的状况以及需要预防这些的所有状况，并且不受具体症状的种类或程度的限制。更具体地，上述皮肤屏障功能异常可以包括所有由紫外线、微尘等外部刺激引起的炎症反应、老化导致的表皮层的弱化等，但不限于此。

因此，在本发明中，术语“改善”是指所有摆脱皮肤屏障功能劣化或受损的状态，具有受损可能性的状态以及需要预防这些的状态的行为，但不限于此。更具体地，上述改善可以包括通过激活因外部刺激或老化而减少的表皮角质形成细胞的自噬作用，诱导表皮的分化并促进表皮的更替，结果，恢复表皮的屏障功能并防止老化的行为，但不限于此。

在本发明中，术语“更替(turn-over)”是指在真皮层中产生的新细胞上升至角质层并变成死细胞而脱落，并且再次在基底层中产生新细胞的过程，尽管根据部位或年龄而不同，但正常皮肤中表皮的更替周期可以为4周至6周，但不限于此。在本发明的组合物的情况下，可以通过激活表皮角质形成细胞的自噬作用来促进表皮的更替，并且可以通过促进表皮的更替来改善皮肤屏障功能的异常。

在本发明中，上述“化妆料组合物”可以制备成选自由溶液、外用软膏、霜、泡沫、营养化妆水、柔肤水、面膜、柔软水、乳液、妆前底乳、精华、液体清洗料、入浴剂、防晒霜、防晒油、悬浮液、乳浊液、膏、凝胶、露、粉末、皂、含有表面活性剂的清洗剂、油、粉末粉底、乳浊液粉底、蜡粉底、贴剂和喷雾组成的组中的剂型，但不限于此。具体而言，本发明的上述化妆料组合物优选地可以制备成诸如外用软膏、露等的半固体制剂，但不限于此。

另外，本发明的上述化妆料组合物还可以包含一种以上配入一般皮肤化妆料中的化妆品学上可允许的载体，作为通常的成分，可以适当地配入例如油分、水、表面活性剂、保湿剂、低级醇、增稠剂、螯合剂、色素、防腐剂、香料等，但不限于此。根据剂型，本发明的化妆料组合物中包含的化妆品学上可允许的载体也多种多样。

当本发明的剂型是软膏、膏、霜或凝胶时，作为载体成分，可以使用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌等，但不限于此。这些可以单独使用或两种以上混合使用。

当本发明的剂型是粉末或喷雾时，作为载体成分，可以使用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙、聚酰胺粉末等，特别是，当喷雾时，可以附加地包含诸如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚的推进剂，但不限于此。这些可以单独使用或两种以上混合使用。

当本发明的剂型是溶液或乳浊液时，作为载体成分，可以使用溶剂、溶解剂或乳浊剂等，例如，可以使用水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油等，特别是，可以使用棉籽油、花生油、玉米胚种油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或脱水山梨醇的脂肪酸酯，但不限于此。这些可以单独使用或两种以上混合使用。

当本发明的剂型是悬浮液时，作为载体成分，可以使用诸如水、乙醇或丙二醇的液体稀释剂、诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯脱水山梨醇酯的悬浮剂、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄蓍胶等，但不限于此。这些可以单独使用或两种以上混合使用。

当本发明的剂型是皂时，作为载体成分，可以使用脂肪酸的碱金属盐、脂肪酸半酯盐、脂肪酸蛋白水解物、羟乙基磺酸盐、羊毛脂衍生物、脂肪醇、植物油、甘油、糖等，但不限于此。这些可以单独使用或两种以上混合使用。

在本发明的上述化妆料组合物中，基于上述全部化妆料组合物的重量，上述选自由羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱组成的组中的一种以上的化合物或其可允许的盐的含量可以优选为0.0001重量％至10重量％，更优选为0.0005重量％至10重量％，但不限于此。

上述化妆料组合物中包含的选自由羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱组成的组中的一种以上的化合物或其可允许的盐可以诱导表皮分化。

在上述化妆料组合物的情况下，可以通过促进角质形成细胞的自噬来诱导或促进表皮的分化，由此可以改善皮肤屏障的功能。

在本发明中，术语“表皮(epidermis)”是覆盖动物体表面的皮肤的上皮组织，可以意味着始终与外部的环境接触，从而主要保护人体免受外部的物理损伤和化学物质的侵害，防止细菌、霉菌、病毒等侵入皮肤，并起到防止水分流失的保护屏障作用。

在本发明中，术语“表皮分化”是指存在于皮肤结构中最外侧的表皮细胞经历基底细胞、有棘细胞、颗粒细胞、角质细胞的四步骤的过程的过程，这是因基因表达变化，多种蛋白质按时机表达，同时伴随各细胞周期的变化和显著细胞形状的变化的过程。在上述化妆料组合物的情况下，可以通过诱导或促进表皮的分化来生成、维持皮肤屏障功能或者改善皮肤屏障功能异常。

上述化妆料组合物中包含的选自由羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱组成的组中的一种以上的化合物或其可允许的盐可以促进角质形成细胞的自噬作用。

在本发明中，术语“角质形成细胞”是表皮的主要构成细胞，分裂后向上侧移动，同时开始发生分化，可以意味着起到以下作用的细胞：在最终分化过程中通过分裂和分化形成皮肤屏障。

上述化妆料组合物中包含的选自由羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱组成的组中的一种以上的化合物或其可允许的盐可以增加LC3的量。另外，上述化妆料组合物可以增加LC3-I或LC3-II的量。

上述化妆料组合物中包含的选自由羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱组成的组中的一种以上的化合物或其可允许的盐可以独立于mTOR途径而促进角质形成细胞中的自噬作用。

通过促进上述自噬作用的活性，可以增加LC3-II蛋白质的产生，结果，可以改善皮肤屏障功能异常，并且可以防止老化导致的表皮层的弱化。

在本发明中，术语“自噬作用(autophagy)”是一种当细胞内应激因子过度产生或细胞内能量源耗尽时，通过分解老化或受损的细胞内物质和器官来去除损伤物质并再生能量的机制，不仅在各种上皮组织，而且在表皮中也观察到自噬作用的活性。自噬作用对于维持表皮层的恒常性并发挥适当的皮肤屏障功能是必不可少的，特别是在表皮层的病毒感染、由紫外线引起的炎症反应、黑素体(melanosome)传递和角质形成细胞的分化中起重要作用，并且当角质形成细胞最终分化为角质层时，对去除线粒体、高尔基体、小胞体、核等起决定性作用。随着老化的进行或老化的加速，细胞内自噬活性迅速降低，并且当自噬作用被抑制时，老化的线粒体或结构变性的蛋白质等在细胞中过度累积，导致细胞中自由基和氧化应激增加，最终引起细胞死亡增加并且老化加速的结果。

上述自噬作用可通过溶酶体发生。

在本发明的一个具体例中，为了确认甜菜碱引起的自噬体的合成促进不是由于溶酶体功能缺陷而引起的问题，一起处理甜菜碱和溶酶体活性抑制剂的结果，确认了通过甜菜碱形成的自噬体通过溶酶体发生分解过程。

在本发明中，术语“LC3(Light Chain 3)”或“微管相关蛋白(Microtubule-associated proteins)”或“微管相关蛋白轻链3(Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain3B)”是一种在自噬作用时其量增加的蛋白质，并且它们在自噬作用过程中经历转录后变形的过程。被翻译成pro-LC3后，通过atg4(自噬相关蛋白4，autophagy-related protein 4)切割羧基末端的第22个氨基酸来生成细胞质形式LC3-I，并且在自噬作用期间LC3-I因atg3和atg7参与的泛素样体系，被磷脂酰乙醇胺(PE)脂质化(lipidation)，同时转换成LC3-II，从而LC3与自噬体相连。

在本发明的一个实验例中，在HaCaT细胞中将甜菜碱按浓度处理的结果，确认了随着浓度的增加，LC3-II的量增加，并且确认了依赖于处理时间LC3-II的量增加并且在经过24小时后转换最多。由此确认了，甜菜碱引起的角质形成细胞的自噬作用促进效果可以通过诱导表皮的分化并促进表皮层的更替来改善表皮的屏障功能。

在本发明中，术语“p62”或“sequestosome 1(SQSTM1)”是通过发生自噬作用而分解的蛋白质，具有泛素结合位点，因此可以与泛素化的蛋白质结合，形成泛素化的蛋白质-p62低聚物复合物，从而与结合到自噬小胞体的LC3结合，最后可以使包含p62的自噬小胞体中的蛋白质和细胞器在溶酶体中分解。上述p62是通过自噬作用分解的蛋白质，并且在本发明的一个具体例中，通过甜菜碱的自噬作用的分解过程，通过p62(SQSTM1)蛋白质的减少可以确认基质分解因溶酶体而正常发生。

在本发明中，术语“mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，mammalian target ofrapamycin)”是一种ser/thr激酶，已知对ATP和氨基酸的变化有反应并且起到调节营养成分的利用可能性和细胞生长的均衡的作用。在可以获取充足营养成分的环境中，mTOR通过class I PI3K/Akt信号途径进行磷酸化后，将阳性信号传递至p70S6激酶，并参与eIF4E抑制剂4E-BP1的失活，从而导致特定mRNA群的翻译，并且还抑制自噬作用。

在本发明的一个实验例中，为了找出甜菜碱促进自噬作用的机制，为了查明相关上位信号调节因子，在对HaCaT细胞处理甜菜碱后，测量了AKT-mTOR-S6途径的磷酸化程度。其结果，通过甜菜碱处理在HaCaT细胞中无法看到mTOR信号的显著差异，由此确认了，甜菜碱引起的角质形成细胞内自噬作用的促进独立于mTOR信号而发生。

上述化妆料组合物中包含的选自由羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱组成的组中的一种以上的化合物或其可允许的盐可以促进表皮内组织中的自噬作用，由此可以通过增加表皮的厚度来改善屏障功能并防止老化导致的表皮层的弱化。上述表皮的厚度增加可以混合并用作角化。

本发明的术语“角化(keratinization)”可以意味着通过表皮的分化最后步骤形成角质层。

在本发明的一个实验例中，在人造皮肤模型中确认羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱的按浓度处理引起的LC3-II的生成程度和表皮厚度是否增加的结果，确认了LC3-II的生成程度增加，从而自噬作用增加。另外，对人造皮肤组织进行染色来测量表皮的厚度变化的结果，确认了与对照组相比，通过处理1％甜菜碱，表皮厚度增加19％，通过处理1％羟基肉桂酸，表皮厚度增加42％，通过处理1％乙酸异戊酯，表皮厚度增加37％。由此确认了，羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱可以促进角质形成细胞的自噬作用，并且可以通过诱导表皮的分化并促进表皮层的更替来改善表皮的屏障功能。(参见实验例5和图5a、b、c、d)。

在用于实现上述目的的本发明的另一方面，提供一种皮肤屏障功能异常的改善方法，其包括将上述化妆料组合物涂抹于个体的皮肤的步骤。上述化妆料组合物、皮肤屏障功能、皮肤屏障功能异常和改善如上所述。

在本发明中，术语“个体”是指包括哺乳动物(包括老鼠、家畜、人等)在内的所有动物，但不限于此。另外，在本发明中，术语“涂抹”是指通过任何适当的方法使本发明的上述组合物与个体的皮肤接触，并且包括所有旨在通过其将该组合物吸收至皮肤内部的行为，但不限于此。

在用于实现上述目的的本发明的另一方面，提供一种皮肤屏障功能异常的预防或治疗用药学组合物，其包含选自由羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱组成的组中的一种以上的化合物或其药学上可允许的盐作为有效成分。上述药学组合物可以包括选自由羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱组成的组中的两种以上的组合，但不限于此。上述羟基肉桂酸、乙酸异戊酯、甜菜碱、皮肤屏障功能和皮肤屏障功能异常如上所述。

在本发明中，术语“预防”是指所有通过将上述药学组合物投入至个体或涂抹于个体的皮肤来抑制或延迟皮肤屏障功能异常的行为。

在本发明中，术语“治疗”是指所有通过将上述药学组合物投入至个体或涂抹于个体的皮肤而使皮肤屏障功能异常症状好转或有利变化的行为。

上述药学组合物可以治疗或预防符合皮肤屏障功能异常的由外部刺激(例如紫外线、微尘等)引起的炎症反应、老化导致的表皮层的弱化等。另外，可以预防或治疗由上述皮肤屏障功能异常诱发的皮肤疾病。

上述皮肤疾病是一种影响皮肤系统的疾病，上述皮肤系统包括人体的全部表面，并且可以意味着包括皮肤、毛、手脚指甲和相关的肌肉和分泌腺。

作为一个具体例，上述皮肤疾病可以是特应性皮炎(atopic dermatitis)、皮肤干燥症(xeroderma)、牛皮癣(psoriasis)、鱼鳞癣(ichthyosis)、接触性皮炎、扁平苔藓(lichen planus)、糠疹(pityriasis)、湿疹、鱼鳞癣(ichthyosis)、痤疮等，但不限于此。

在本发明中，术语“药学组合物”包含选自由羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱组成的组中的一种以上的化合物或其药学上可允许的盐作为有效成分，并且还可以包含药学组合物的制备中通常使用的适当的载体、赋形剂和稀释剂。

具体而言，根据各自通常的方法，上述药学组合物可以剂型化为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳状液、糖浆、气溶胶等的口服型剂型、外用剂、灭菌注射溶液等的形式而使用，作为组合物中可以包含的载体、赋形剂和稀释剂，可以列举乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等，但不限于此。这些可以单独使用或两种以上混合使用。

当将本发明的上述药学组合物制剂化时，可以使用通常使用的填充剂、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等的稀释剂或赋形剂来制备。

用于口服的固体制剂中可以包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这些固体制剂可以通过混合一种以上的赋形剂，例如淀粉、碳酸钙(calcium carbonate)、蔗糖、乳糖或明胶等来制备。另外，除了简单的赋形剂之外，还可以使用诸如硬脂酸镁、滑石等的润滑剂。用于口服的液体制剂可以包括悬浮剂、内容液剂、乳剂、糖浆剂等，除了作为通常使用的简单稀释剂的水和液体石蜡之外，还可以包括各种赋形剂，例如湿润剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。

用于非口服的制剂中可以包括无菌水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂、外用剂等。作为上述非水性溶剂、悬浮剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、诸如橄榄油的植物油、诸如油酸乙酯的可注射的酯等。

本发明的上述药学组合物优选地可以制备成诸如外用软膏、露等的半固体制剂，但不限于此。

本发明的上述药学组合物的药学有效量和有效投入量可以根据上述药学组合物的制剂化方法、投入方式、投入时间和/或投入途径等而实现多样化，并且可以根据各种因子和医药领域中熟知的类似因子(包括通过上述药学组合物的投入要实现的反应的种类和程度、成为给药对象的个体的种类、年龄、体重、一般健康状态、疾病的症状或程度、性别、饮食、排泄、对该个体同时或异时一起使用的药物其他组合物的成分等)而实现多样化，本领域普通技术人员可以容易地确定并处方用于所需治疗的有效投入量。

对于本发明的上述药学组合物的投入，每天可以投入一次，并且可以分数次投入。因此，上述投入量无论从哪方面均不限制本发明的范围。

本发明的上述药学组合物的投入途径和投入方式各自可独立，并且该方式没有特别限制，并且可以遵循任何投入途径和投入方式，只要上述药学组合物可以到达期望的相应部位即可。上述药学组合物可以用口服或非口服方式投入，优选地可以用非口服方式投入。

作为上述非口服的方法，可以使用例如静脉内投入、腹腔内投入、肌肉内投入、经皮投入或皮下投入等，并且还可以使用将上述组合物涂抹或喷洒、吸入疾病部位的方法，但不限于此。

本发明的上述药学组合物可以更优选地用非口服中的经皮投入，更优选地通过将上述药学组合物涂抹于个体的皮肤的方式实现的局部投入(topical application)方式来给药。

在用于实现上述目的的本发明的另一方面，提供一种皮肤屏障功能异常的预防或治疗方法，其包括将上述药学组合物投入至除人以外的个体或涂抹于除人以外的个体的皮肤的步骤。上述药学组合物、皮肤屏障功能、皮肤屏障功能异常、预防和治疗如上所述。上述个体和涂抹如上所述。

在用于实现上述目的的本发明的另一方面，提供一种皮肤屏障功能异常的预防或改善用医药外品组合物，其包含选自由羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱组成的组中的一种以上的化合物或其药学上可允许的盐作为有效成分。上述医药外品组合物可以包括选自由羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱组成的组中的两种以上的组合，但不限于此。上述医药外品组合物、皮肤屏障功能、皮肤屏障功能异常、预防和改善如上所述。

在本发明中，“医药外品组合物”包含选自由羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱组成的组中的一种以上的化合物或其药学上可允许的盐作为有效成分，并且必要时，还可以包含药学上可允许的载体、赋形剂或稀释剂。上述药学上可允许的载体、赋形剂或稀释剂没有限制，只要其不损害本发明的效果即可，可以包含例如填充剂、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。

本发明的上述医药外品组合物可以例示消毒清洁剂、淋浴泡沫、软膏液、湿巾、涂层剂等，优选地可以制备成诸如外用软膏、露等的半固体制剂，但不限于此。上述医药外品的制剂化方法、容量、使用方法、构成成分等可以从技术领域已知的常规技术中适当选择。

实施方式

在下文中，将通过实施例和实验例更详细地说明本发明的构成和效果。这些实施例和实验例仅用于例示本发明，本发明的范围不受实施例和实验例的限制。

实施例1：试剂和仪器

将甜菜碱(Sigma,USA)溶解于DMSO中并用于实验。实验中使用的溶酶体活性的选择性抑制剂巴氟洛霉素A1(b1793)购自Sigma-Aldrich(USA)公司，一抗(primaryantibody)AKT(9272S)、p-AKT(ser473)(9271S)、p-S6(ser240/244)(2215)、S6(2217)从Cell Signalling Technology(USA)购买并使用，p62 SQSTM1(D-3)(sc-28359)、α-Tubulin(sc-8035)从Santa Cruz Biotechnology购买并使用。

实施例2：表皮细胞培养

本实验中使用的源于人皮肤的角质形成细胞(NHEK-Neo,Neonatal Normal HumanEpidermal Keratinocytes)购自Lonza(192907,USA)，并在向KGM-Gold medium(Lonza,USA)中添加10％胎牛血清(FBS)、青霉素50U/mL、链霉素50μg/mL的培养液条件下培养。人角质形成细胞系HaCaT(Human keratinocyte cell line)在包含10％胎牛血清(FBS)、青霉素50U/mL、链霉素50μg/mL和0.01mM CaCl2的培养基中，在37℃、5％、CO₂的条件下培养。当细胞在培养用烧瓶中填满70～80％时，进行传代培养。

实施例3：GFP-LC3载体的引入和LC3点(puncta)定量

使用基因转移试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen,USA)将结合有GFP(greenfluorescence protein)的微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达载体(Cell Biolabs,USA)引入HaCaT细胞中，并在包含10％FBS的条件下培养12小时，然后将源于天然物的单个化合物库中的预测促进自噬作用的候选化合物分别按浓度处理于培养基中，然后用荧光显微镜(Fluorescence microscopy)(Leica Microsystems,USA)进行评价。为了将自噬作用的诱导定量化，使用荧光显微镜对形成点状自噬体(punctae＝5)的100个GFP阳性细胞进行计数。

实施例4：Western Blotting分析法

将HaCaT细胞以8x 105个细胞浓度接种于60mm平板中，然后第二天分别处理羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱，然后用5Υ裂解缓冲液溶出细胞以获得蛋白质。离心分离去除细胞碎片，并使用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce,USA)进行定量。使用4-15％SDS-PAGE gel(Bio-Rad,USA)将细胞提取蛋白质分离，并转移到硝酸纤维素膜(Life Technologies,NewZealand)。将膜用含有3％BSA的TBST缓冲液封闭1小时，然后在包含一抗的缓冲液中在4℃下反应1天。将膜用TBST洗涤，然后与结合有过氧化物酶的二抗反应，然后使用增强化学发光(Amersham,UK)显色，并用Fusion FX 5image system(Vilber Lourmat,France)确认免疫反应带。

实施例5：3D人造皮肤组织培养

将重建人表皮模型(Neoderm-E,Tego Science,Korea)转移到6-孔平板中，并在2mL的生长培养基(Tego Science,Korea)中稳定24小时，然后将按浓度包含羟基肉桂酸、乙酸异戊酯或甜菜碱的霜剂型涂抹于人造皮肤上。培养24小时后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤涂抹于人造皮肤上的羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱霜，然后用包含蛋白酶抑制剂混合物(ThermoFisher Scientific,USA)的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 7.4,150mMNaCl,1％NP-40)进行声波处理以破坏组织。对于组织提取蛋白质，通过进行蛋白质印迹分析来分析组织中角质形成细胞的自噬作用活性度，并且在人造皮肤上涂抹羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱1％霜，并在1周后进行H&E染色以确认表皮厚度是否增加。

实施例6：统计分析

通过独立方差分析来评价实验结果差异的统计显著性，并且通过独立T检验来计算概率值。当p值小于0.05时，判断为具有统计学意义。

实验例1：筛选角质形成细胞内自噬作用活性化材料

为了通过激活因老化或外部刺激而减少的自噬作用促进表皮分化来改善屏障功能，从源于天然物的单个化合物库中检索促进角质形成细胞的自噬作用活性的化合物。具体而言，与上述实施例3的方法相同，对引入GFP-LC3载体的HaCaT细胞处理预测可促进自噬作用的候选化合物后，比较在各细胞中诱导自噬作用时GFP结合至转换为膜结合形式的LC3而细胞质内GFP-LC3的点(puncta)状小胞体增加的细胞数目。其结果，当用羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱处理时，确认了GFP-LC3的点状小胞体增加的细胞比例分别为20.8％、16.4％、25％。(确认了与未处理组相比，在用甜菜碱处理时，GFP-LC3的点状小胞体增加的细胞数增加了18.75％左右。)由此确认了，羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱可用作用于激活角质形成细胞内自噬作用的化合物材料。

实验例2：确认甜菜碱对角质形成细胞的细胞毒性和角质形成细胞内自噬作用促进功效

确认了甜菜碱对角质形成细胞是否具有细胞毒性，并且通过上述实施例4的蛋白质印迹分析法确认了上述实验例1的结果，进入自噬体(autophagosome)的双重膜之间时转换的LC3-II的生成程度。其结果，当对HaCaT细胞处理10、50、100μg/mL甜菜碱时，在任何浓度下均未出现细胞毒性(图2A)。随后，当将甜菜碱以与上述实验相同的浓度处理时，确认了随着浓度的增加，LC3-II的量增加(图2B)。另外，当处理50μg/mL的甜菜碱并观察按时间LC3-II转换量时，确认了6小时之前未见明显增加，但从12小时开始增加，并且在经过24小时后转换最多。

由此确认了，甜菜碱引起的角质形成细胞的自噬作用促进效果依赖于甜菜碱的处理浓度和时间而增加，并且可以通过诱导表皮的分化并促进表皮层的更替来改善表皮的屏障功能。

实验例3：确认甜菜碱是否促进自噬体合成

自噬体在细胞内的增加可能主要有两种原因：1)激活与自噬体生成相关的各种信号传递过程，或2)自噬体最终与溶酶体融合，使得小胞体中的蛋白质被分解而再利用，但可能因由于溶酶体功能缺陷而引起的分解过程的问题而累积。

因此，为了查明甜菜碱处理引起的自噬体的增加以何种机制发生，当将已知为溶酶体活性抑制剂的巴氟洛霉素A1(Baf.A1)与甜菜碱一起处理时，通过蛋白质印迹分析法确认了LC3-II的生成程度。其结果，观察到与单独处理甜菜碱相比，当将巴氟洛霉素A1和甜菜碱一起处理时，LC3-II的量进一步增加，从而确认了通过甜菜碱形成的自噬体通过溶酶体进行正常分解过程(图3)。另外，通过确认已知通过自噬作用而分解的p62/SQSTM1(p62)蛋白质的量也因甜菜碱的处理而减少，从而确认了由溶酶体引起的基质分解正常进行。

由此确认了，甜菜碱引起的自噬作用的促进不是由于自噬体的分解停滞，而是由于激活了与自噬体生成相关的各种信号传递过程。

实验例4：确认独立于mTOR途径自噬作用活性化机制

在以前的研究中已经报道，由于甜菜碱-同型半胱氨酸甲基转移酶(betaine-homocysteine methyltransferase，BHMT)，同型半胱氨酸的量依赖于甜菜碱而减少，并且一项研究已经报道，同型半胱氨酸可促进自噬作用抑制酶mTORC1的活性。因此，为了找出甜菜碱促进自噬作用的机制，进行了查明相关上位信号调节因子的实验。具体而言，为了观察甜菜碱处理是否调节mTORC1的活性，对HaCaT细胞系处理甜菜碱后，通过蛋白质印迹分析法确认AKT-mTOR-S6途径的磷酸化程度。

其结果，通过甜菜碱处理在HaCaT细胞中无法看到mTOR信号的显著差异，由此确认了，甜菜碱引起的角质形成细胞内自噬作用的促进独立于mTOR信号而发生(图4)。

实验例5：确认3D人造皮肤模型中的表皮内分化促进效果和表皮厚度增加效果

为了确认甜菜碱、羟基肉桂酸和乙酸异戊酯的自噬作用促进功效是否促进表皮内分化，如上述实施例5那样使用了3D人造皮肤模型(skin model)。将1％、3％、5％甜菜碱，0.1％、0.5％、1％羟基肉桂酸，0.1％、0.5％、1％乙酸异戊酯制成霜剂型并涂抹在角质上，然后在24小时后通过蛋白质印迹分析法测量LC3-II的生成程度以确认表皮内自噬作用是否得到促进。

实验结果，通过处理1％甜菜碱、1％羟基肉桂酸、1％乙酸异戊酯增加了自噬作用(参见图5a、图5b、图5c)。接下来，将1％甜菜碱、1％羟基肉桂酸、1％乙酸异戊酯霜涂抹于人造皮肤，然后对人造皮肤组织Fontana-Masson进行染色后测量表皮的厚度变化。其结果，从下表1和图5d可以看出，与对照组相比，通过处理1％甜菜碱，表皮厚度增加19％，通过处理1％羟基肉桂酸，表皮厚度增加42％，通过处理1％乙酸异戊酯，表皮厚度增加37％。

[表1]

由此确认了，甜菜碱、羟基肉桂酸和乙酸异戊酯可以促进角质形成细胞的自噬作用，并且可以通过诱导表皮的分化并促进表皮层的更替来改善表皮的屏障功能。

基于以上说明，本发明所属技术领域的技术人员可以理解在没有变更本发明的技术思想或者必要的特征的情况下本发明还可以以其他具体方式实施。对此，应当理解，以上说明的实施例在所有的方面均为示例性的而非限制性的。本发明的范围应被解释为包括后述的权利要求书的意思以及范围和从其等同概念导出的所有的变更或者变形的方式，而不仅仅包括上述的详细说明。

Claims

1.一种皮肤屏障功能异常的改善用化妆料组合物，其包含选自由羟基肉桂酸(hydroxycinnamic acid)、乙酸异戊酯(isoamyl acetate)和甜菜碱(betaine)组成的组中的一种以上的化合物或其可允许的盐作为有效成分。

2.根据权利要求1所述的化妆料组合物，其中，上述皮肤屏障功能异常是选自由皮肤表皮层的弱化、皮肤炎症和皮肤干燥症组成的组中的任何一种以上。

3.根据权利要求1所述的化妆料组合物，其中，基于上述化妆料组合物的总重量，上述羟基肉桂酸、乙酸异戊酯或甜菜碱的含量为0.0001重量％至10重量％。

4.根据权利要求1所述的化妆料组合物，其中，上述组合物具有选自由溶液、外用软膏、霜、泡沫、营养化妆水、柔肤水、面膜、柔软水、妆前底乳、精华、液体清洗料、入浴剂、防晒霜、防晒油、悬浮液、乳浊液、膏、凝胶、露、粉末、皂、含有表面活性剂的清洗剂、油、粉末粉底、乳浊液粉底、蜡粉底、贴剂和喷雾组成的组中的剂型。

5.根据权利要求1所述的化妆料组合物，其中，上述皮肤屏障功能异常的改善通过促进角质形成细胞的自噬作用来实现。

6.根据权利要求5所述的化妆料组合物，其特征在于，上述自噬作用独立于mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，mammalin target of rapamycin)途径。

7.根据权利要求1所述的化妆料组合物，其特征在于，上述化妆料组合物增加LC3(轻链3，light Chain 3)的量。

8.根据权利要求1所述的化妆料组合物，其中，上述皮肤屏障功能异常的改善通过增加皮肤的表皮层厚度来实现。

9.一种皮肤屏障功能异常的预防或治疗用药学组合物，其包含选自由羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱组成的组中的一种以上的化合物或其药学上可允许的盐作为有效成分。

10.根据权利要求9所述的药学组合物，其中，基于上述药学组合物的总重量，上述羟基肉桂酸、乙酸异戊酯或甜菜碱的含量为0.0001重量％至10重量％。

11.一种皮肤屏障功能异常的预防或改善用医药外品组合物，其包含选自由羟基肉桂酸、乙酸异戊酯和甜菜碱组成的组中的一种以上的化合物或其药学上可允许的盐作为有效成分。

12.一种皮肤屏障功能异常的改善方法，包括将权利要求1至8中任一项所述的化妆料组合物涂抹于个体的皮肤的步骤。

13.一种皮肤屏障功能异常的预防或治疗方法，包括将权利要求9或10所述的药学组合物投入至除人以外的个体或涂抹于除人以外的个体的皮肤的步骤。