CN111995720A - 一种单分散超顺磁性羧基硅磁珠及其制备方法 - Google Patents

一种单分散超顺磁性羧基硅磁珠及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种单分散超顺磁性羧基硅磁珠及其制备方法，属于磁性材料制备技术领域。该制备方法包括:将Fe3O4纳米团簇分散于醇溶液中，再加入氨水和TEOS，搅拌4‑6h，得到直径为100～240nm的Fe3O4@SiO2复合物；再将Fe3O4@SiO2复合物分散于醇溶液中，加入丙烯酸类化合物和丙烯酰胺，随后在氮气保护下与引发剂和交联剂混合，于65～80℃下反应8～12小时，得到Fe3O4@SiO2‑COOH复合粒子。该制备方法简单，可控性强，制得的磁珠具有均一粒径、分散性好、超顺磁性，且能与蛋白质特异性结合，可进一步用于蛋白质等生物大分子的分离。

Description

一种单分散超顺磁性羧基硅磁珠及其制备方法
技术领域
本发明涉及磁性材料制备技术领域，具体涉及一种单分散超顺磁性羧基硅磁珠及其制备方法。
背景技术
磁珠是指具有细小粒径的超顺磁微球。功能化纳米磁珠首先具有超强的顺磁性，在磁场中能够迅速聚集，离开磁场后又能够均匀分散。其次，具有合适的且均一的粒径，保证了足够强的磁响应性和良好的分散性。再次，具有丰富的表面活性基团，以便可以和生化物质偶联，并在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。一般地，功能化纳米磁珠应用于生物、医学及食品领域需要满足几个条件：①具有高磁响应性；②悬浮稳定性要好；③粒径小且均一；④能够与蛋白、核酸等生物大分子特异性结合，生物相容性好。
目前报道的功能化纳米磁珠材料使用二氧化硅包裹且表面连接官能团的有很多，但不能同时做到超顺磁性、稳定分散于介质中和特异性的吸附蛋白，使其应用受到极大的限制。现有羧基化磁珠制备中，基本选用聚乙二醇(分子量从1000～20000)作为分散剂，利用溶剂热所制备四氧化三铁的球形不规则，以此做进一步的羧基磁珠乳液分散性较差。鉴于此，本申请提供一种单分散超顺磁性的磁珠材料，以改善上述缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种单分散超顺磁性羧基硅磁珠及其制备方法，该制备方法简单，可控性强，制得的磁珠具有均一粒径、分散性好、超顺磁性，且能与蛋白质特异性结合，可进一步用于蛋白质等生物大分子的分离。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种单分散超顺磁性羧基硅磁珠的制备方法，其包括:
将Fe3O4纳米团簇分散于醇溶液中，再加入氨水和正硅酸四乙酯，搅拌4-6h，得到直径为100～240nm的Fe3O4@SiO2复合物，其中所述Fe3O4纳米团簇与所述正硅酸四乙酯的质量比为1:1.4～4.7；
再将所述Fe3O4@SiO2复合物分散于醇溶液中，加入丙烯酸类化合物和丙烯酰胺，随后在氮气保护下与引发剂和交联剂混合，于65～80℃下反应8～12小时，得到Fe3O4@SiO2-COOH复合粒子。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述丙烯酸类化合物与所述丙烯酰胺的摩尔比为1:0.8～1.2。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述丙烯酸类化合物包括丙烯酸、甲基丙烯酸。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述引发剂为过硫酸钾或过硫酸铵，所述引发剂的用量是所述丙烯酸类化合物和所述丙烯酰胺总质量的1～5wt％。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺，所述交联剂的用量是所述丙烯酸类化合物和所述丙烯酰胺总质量的0.5～2.5wt％。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述醇溶液为乙醇与水的混合溶液，其中乙醇与水的体积比为2～4:1。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述Fe3O4纳米团簇是通过下述方法制备的：
将FeCl3·6H2O溶解到乙二醇中，加热至50～80℃时加入聚丙烯酸和无水醋酸钠，于200～260℃反应12～16小时，洗涤。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述乙二醇与Fe3+的摩尔比例范围为175～185：1。
另一方面，本发明提供一种单分散超顺磁性羧基硅磁珠，其通过上述制备方法制得。
本发明的效果如下：
本发明利用Fe3O4纳米粒子的超顺磁性，在其表面均匀包裹一层二氧化硅，形成直径为100～240nm的Fe3O4@SiO2复合物，再以丙烯酸类化合物或丙烯酰胺为单体，以过硫酸钾(过硫酸铵)、N,N-亚甲基双丙烯酰胺为引发剂和交联剂进行羧基的连接，以提高磁珠材料的分散性和蛋白吸附率，得到Fe3O4@SiO2-COOH复合粒子。这种复合粒子粒径小且均匀，并具有超顺磁性、分散性好，磁珠经过活化后，牛血清蛋白吸附率高，链霉亲和素偶联本发明的羧基磁珠后，再连特定抗体后，磁珠的特异性结合率高。
附图说明
图1为实施例1中Fe3O4纳米团簇的透射电镜示意图；
图2为实施例1中Fe3O4@SiO2透射电镜示意图；
图3为实施例1中Fe3O4@SiO2-COOH复合粒子的透射电镜示意图；
图4为实施例2中Fe3O4@SiO2透射电镜示意图；以及
图5大肠杆菌质粒DNA提取的凝胶电泳示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的制备方法以及所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。
实施例1
本实施例提供一种单分散超顺磁羧基硅磁珠，其制备方法包括：
(1)Fe3O4纳米团簇的制备：称取1.08gFeCl3·6H2O至三口烧瓶中，加入40ml乙二醇充分溶解，加热至60℃时，在500r/min的搅拌速率下同时加入0.108g聚丙烯酸(PAA)和9gNaAc，搅拌使固体完全溶解。将反应液转移至反应釜中，200℃反应12小时。反应完成后，用磁力架进行辅助磁性分离，用去离子水水和乙醇交替清洗多次，去除反应残余组分及副产物，置于干燥箱内干燥，收集得到单分散超顺磁性Fe3O4纳米团簇，其投射电镜照片如图1所示。
(2)Fe3O4@SiO2的制备：称取0.1g步骤(1)得到的Fe3O4纳米团簇、60ml乙醇和20ml去离子水于三口烧瓶中，超声震荡30min。在450r/min的搅拌速率下,向混合体系中加入2.5ml氨水(25％)，搅拌30min后，加入150μl正硅酸四乙酯(TEOS)，继续搅拌4小时。反应完成后，用磁力架进行辅助磁性分离，用去离子水水和乙醇交替清洗至中性，去除反应残余组分及副产物，置于干燥箱内干燥，收集得到Fe3O4@SiO2核-壳结构的产物，其透射电镜照片如图2所示，由图中可以看出SiO2层的厚度为10～20nm。
(3)Fe3O4@SiO2-COOH复合粒子的制备：称取0.12g步骤(2)的包覆产物、25ml乙醇和10ml水于100毫升三口烧瓶中，400r/min的搅拌速率下搅拌15min后，分别加入0.0860g甲基丙烯酸和0.0711g丙烯酰胺，搅拌混匀。在氮气保护下，加入0.00157g引发剂过硫酸钾和0.00079g交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺，70℃反应8小时。反应完成后，用磁力架进行辅助磁性分离，用去离子水水和乙醇交替清洗多次，去除反应残余组分及副产物，收集得到Fe3O4@SiO2-COOH复合粒子，其透射电镜照片如图3所示，由图中可以看出该复合粒子的粒径为200～300nm，且Fe3O4@SiO2内核表面被包裹。
将该复合粒子分散于蒸馏水中，得到单分散超顺磁羧基硅磁珠乳液，72小时不分层，由此说明该Fe3O4@SiO2-COOH复合粒子的分散性好。
实施例2
本实施例提供一种单分散超顺磁羧基硅磁珠，其制备方法包括：
(1)Fe3O4纳米团簇的制备：称取1.08gFeCl3·6H2O至三口烧瓶中，加入40ml二乙二醇充分溶解，加热至60℃时，在500r/min的搅拌速率下同时加入0.108gPAA和9gNaAc，搅拌使固体完全溶解。将反应液转移至反应釜中，250℃反应12小时。反应完成后，用磁力架进行辅助磁性分离，用去离子水水和乙醇交替清洗多次，去除反应残余组分及副产物，置于干燥箱内干燥，收集得到单分散超顺磁性Fe3O4纳米团簇。
(2)Fe3O4@SiO2的制备：称取0.1g步骤(1)得到的Fe3O4纳米团簇、60ml乙醇和20ml去离子水于三口烧瓶中，超声震荡30min。在450r/min的搅拌速率下,向混合体系中加入5ml氨水(25％)，搅拌30min后，加入200μlTEOS，继续搅拌4小时。反应完成后，用磁力架进行辅助磁性分离，用去离子水水和乙醇交替清洗至中性，去除反应残余组分及副产物，置于干燥箱内干燥，收集得到Fe3O4@SiO2核-壳结构的产物，其透射电镜照片如图4所示，由图中可以看出SiO2层的厚度约为50nm。
(3)Fe3O4@SiO2-COOH复合粒子的制备：称取0.12g步骤(2)的包覆产物、25ml乙醇和10ml水于100毫升三口烧瓶中，400r/min的搅拌速率下搅拌15min后，分别加入0.0860g甲基丙烯酸和0.0711g丙烯酰胺，搅拌混匀。在氮气保护下，加入0.00314g引发剂过硫酸钾和0.00157g交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺，70℃反应8小时。反应完成后，用磁力架进行辅助磁性分离，用去离子水水和乙醇交替清洗多次，去除反应残余组分及副产物，收集得到Fe3O4@SiO2-COOH复合粒子。将粒子分散于蒸馏水中，得到单分散超顺磁羧基硅磁珠乳液，72小时不分层。
实施例3
本实施例提供一种单分散超顺磁羧基硅磁珠，其制备方法包括：
(1)Fe3O4纳米团簇的制备：称取1.08gFeCl3·6H2O至三口烧瓶中，加入40ml乙二醇充分溶解，加热至60℃时，在500r/min的搅拌速率下同时加入0.108gPAA和9gNaAc，搅拌使固体完全溶解。将反应液转移至反应釜中，200℃反应12小时。反应完成后，用磁力架进行辅助磁性分离，用去离子水水和乙醇交替清洗多次，去除反应残余组分及副产物，置于干燥箱内干燥，收集得到单分散超顺磁性Fe3O4纳米团簇。
(2)Fe3O4@SiO2的制备：称取0.1g步骤(1)得到的Fe3O4纳米团簇、60ml乙醇和20ml去离子水于三口烧瓶中，超声震荡30min。在500r/min的搅拌速率下,向混合体系中加入7.5ml氨水(25％)，搅拌30min后，加入250μlTEOS，继续搅拌4小时。反应完成后，用磁力架进行辅助磁性分离，用去离子水水和乙醇交替清洗至中性，去除反应残余组分及副产物，置于干燥箱内干燥，收集得到Fe3O4@SiO2核-壳结构的产物。
(3)Fe3O4@SiO2-COOH复合粒子的制备：称取0.12g步骤(2)的包覆产物、25ml乙醇和10ml水于100毫升三口烧瓶中，400r/min的搅拌速率下搅拌15min后，分别加入0.0860g甲基丙烯酸和0.0711g丙烯酰胺，搅拌混匀。在氮气保护下，加入0.00471g引发剂过硫酸钾和0.00236g交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺，70℃反应8小时。反应完成后，用磁力架进行辅助磁性分离，用去离子水水和乙醇交替清洗多次，去除反应残余组分及副产物，收集得到Fe3O4@SiO2-COOH复合粒子。将粒子分散于蒸馏水中，得到单分散超顺磁羧基硅磁珠乳液，72小时不分层。
实施例4
本实施例提供一种单分散超顺磁羧基硅磁珠，其制备方法包括：
(1)Fe3O4纳米团簇的制备：称取1.08gFeCl3·6H2O至三口烧瓶中，加入40ml二乙二醇充分溶解，加热至60℃时，在500r/min的搅拌速率下同时加入0.108gPAA和9gNaAc，搅拌使固体完全溶解。将反应液转移至反应釜中，250℃反应12小时。反应完成后，用磁力架进行辅助磁性分离，用去离子水水和乙醇交替清洗多次，去除反应残余组分及副产物，置于干燥箱内干燥，收集得到单分散超顺磁性Fe3O4纳米团簇。
(2)Fe3O4@SiO2的制备：称取0.1g步骤(1)得到的Fe3O4纳米团簇、60ml乙醇和20ml去离子水于三口烧瓶中，超声震荡30min。在560r/min的搅拌速率下,向混合体系中加入10ml氨水(25％)，搅拌30min后，加入300μlTEOS，继续搅拌4小时。反应完成后，用磁力架进行辅助磁性分离，用去离子水水和乙醇交替清洗至中性，去除反应残余组分及副产物，置于干燥箱内干燥，收集得到Fe3O4@SiO2核-壳结构的产物。
(3)Fe3O4@SiO2-COOH复合粒子的制备：称取0.12g步骤(2)的包覆产物、25ml乙醇和10ml水于100毫升三口烧瓶中，400r/min的搅拌速率下搅拌15min后，分别加入0.0860g甲基丙烯酸和0.0711g丙烯酰胺，搅拌混匀。在氮气保护下，加入0.00628g引发剂过硫酸钾和0.00314g交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺，70℃反应8小时。反应完成后，用磁力架进行辅助磁性分离，用去离子水水和乙醇交替清洗多次，去除反应残余组分及副产物，收集得到Fe3O4@SiO2-COOH复合粒子。将粒子分散于蒸馏水中，得到单分散超顺磁羧基硅磁珠乳液，72小时不分层。
实施例5
本实施例提供一种单分散超顺磁羧基硅磁珠，其制备方法包括：
(1)Fe3O4纳米团簇的制备：称取1.08gFeCl3·6H2O至三口烧瓶中，加入40ml乙二醇充分溶解，加热至60℃时，在500r/min的搅拌速率下同时加入0.108gPAA和9gNaAc，搅拌使固体完全溶解。将反应液转移至反应釜中，200℃反应14小时。反应完成后，用磁力架进行辅助磁性分离，用去离子水水和乙醇交替清洗多次，去除反应残余组分及副产物，置于干燥箱内干燥，收集得到单分散超顺磁性Fe3O4纳米团簇。
(2)Fe3O4@SiO2的制备：称取0.1g步骤(1)得到的Fe3O4纳米团簇、60ml乙醇和20ml去离子水于三口烧瓶中，超声震荡30min。在500r/min的搅拌速率下,向混合体系中加入5ml氨水(25％)，搅拌30min后，加入200μlTEOS，继续搅拌4小时。反应完成后，用磁力架进行辅助磁性分离，用去离子水水和乙醇交替清洗至中性，去除反应残余组分及副产物，置于干燥箱内干燥，收集得到Fe3O4@SiO2核-壳结构的产物。
(3)Fe3O4@SiO2-COOH复合粒子的制备：称取0.12g步骤(2)的包覆产物、25ml乙醇和10ml水于100毫升三口烧瓶中，400r/min的搅拌速率下搅拌15min后，分别加入0.0860g甲基丙烯酸和0.0711g丙烯酰胺，搅拌混匀。在氮气保护下，加入0.00785g引发剂过硫酸钾和0.00393g交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺，70℃反应8小时。反应完成后，用磁力架进行辅助磁性分离，用去离子水水和乙醇交替清洗多次，去除反应残余组分及副产物，收集得到Fe3O4@SiO2-COOH复合粒子。将粒子分散于蒸馏水中，得到单分散超顺磁羧基硅磁珠乳液，72小时不分层。
实施例6
本实施例提供一种单分散超顺磁羧基硅磁珠，其制备方法包括：
(1)Fe3O4纳米团簇的制备：称取1.08gFeCl3·6H2O至三口烧瓶中，加入40ml二乙二醇充分溶解，加热至60℃时，在500r/min的搅拌速率下同时加入0.108gPAA和9gNaAc，搅拌使固体完全溶解。将反应液转移至反应釜中，250℃反应12小时。反应完成后，用磁力架进行辅助磁性分离，用去离子水水和乙醇交替清洗多次，去除反应残余组分及副产物，置于干燥箱内干燥，收集得到单分散超顺磁性Fe3O4纳米团簇。
(2)Fe3O4@SiO2的制备：称取0.1g步骤(1)得到的Fe3O4纳米团簇、60ml乙醇和20ml去离子水于三口烧瓶中，超声震荡30min。在500r/min的搅拌速率下,向混合体系中加入10ml氨水(25％)，搅拌30min后，加入300μlTEOS，继续搅拌4小时。反应完成后，用磁力架进行辅助磁性分离，用去离子水水和乙醇交替清洗至中性，去除反应残余组分及副产物，置于干燥箱内干燥，收集得到Fe3O4@SiO2核-壳结构的产物。
(3)Fe3O4@SiO2-COOH复合粒子的制备：称取0.12g步骤(2)的包覆产物、25ml乙醇和10ml水于100毫升三口烧瓶中，400r/min的搅拌速率下搅拌15min后，分别加入0.0860g甲基丙烯酸和0.0711g丙烯酰胺，搅拌混匀。在氮气保护下，加入0.00785g引发剂过硫酸钾和0.00393g交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺，70℃反应8小时。反应完成后，用磁力架进行辅助磁性分离，用去离子水水和乙醇交替清洗多次，去除反应残余组分及副产物，收集得到Fe3O4@SiO2-COOH复合粒子。将粒子分散于蒸馏水中，得到单分散超顺磁羧基硅磁珠乳液，72小时不分层。
活化磁珠的方法：取10μl混合均匀的磁珠置于1.5mL离心管中，用25mM100μl的MES(2-吗啉乙磺酸)溶液清洗三次。用25mMMES溶液现配50mg/ml的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液各100μl。向清洗后的磁珠中先后加入50μl的新鲜配制的EDC和NHS溶液并混匀，室温低速旋转30分钟。旋转结束后将装有磁珠的离心管放置在强力磁铁上静置分钟，移去上清液。活化后的磁珠用100μlMES溶液清洗三次。
对本发明实施例1提供的Fe3O4@SiO2-COOH复合粒子进行性能测试，并与美国赛默飞公司的羧基磁珠做对比，结果如表1所示：
表1.单分散超顺磁性羧基硅磁珠乳液的性能
本申请 赛默飞公司
磁饱和强度 37～50emu/g 30～50emu/g
磁响应时间 小于20秒 大于20秒
BSA偶联量 5～7mg/g 5mg/g
分离效率(PC3-EpCAM) 50～54％ 16.88％
MAG回收率(PC3-EpCAM) 60～68％ 55％
分离效率(Raji-CD45) 10～15％ 6.15％
MAG回收率(Raji-CD45) 60～63％ 64.84％
表1中，PC3细胞系：是从人前列腺癌骨转移肿瘤中分离出来的，分化程度低，为雄激素非依赖性前列腺癌细胞。Raji为淋巴瘤细胞。EpCAM(上皮细胞黏附分子)和CD45(白细胞共同标记抗体)是分别在PC3细胞系和Raji细胞上连接的抗体。
由表1可知，相较于美国赛默飞公司提供的羧基磁珠，本申请提供的Fe3O4@SiO2-COOH复合粒子的磁响应时间变短，对于PC3-EpCAM和Raji-CD45的分离效率和回收率均有所提升，尤其是对于PC3-EpCAM的分离效率提升效果更为显著。由此说明，本申请制备的Fe3O4@SiO2-COOH复合粒子的性能优异。
以本发明实施例1和实施例4制备的Fe3O4@SiO2-COOH为固相载体，以聚乙二醇(8000)/NaCl为结合液，对大肠杆菌裂解液的质粒DNA进行了提取，并与国产PuriMag试剂盒进行对比，实验结果如表2和图5所示，可以得出本发明的硅羧基磁珠的性能优于PuriMag的产品。
表2磁珠提取大肠杆菌质粒DNA的结果
序号 样品 DNA吸附量(μg/mL) A260/A280
1 实施例1 180 1.68
2 实施例1 179 1.57
3 实施例4 177 1.67
4 实施例4 183 1.67
盒1 PuriMag试剂盒1 107 1.63
盒2 PuriMag试剂盒1 73 1.69
综上，本发明提供的这种单分散超顺磁性羧基硅磁珠，制备方法简单，可控性强，制得的磁珠具有均一粒径、分散性好、超顺磁性，且能与蛋白质特异性结合，且相比于美国赛默飞公司的羧基磁珠以及国产PuriMag试剂盒，性能均有较大程度的提升，可进一步用于蛋白质等生物大分子的分离。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种单分散超顺磁性羧基硅磁珠的制备方法，其特征在于，其包括:
将Fe3O4纳米团簇分散于醇溶液中，再加入氨水和正硅酸四乙酯，搅拌4-6h，得到直径为100～240nm的Fe3O4@SiO2复合物，其中所述Fe3O4纳米团簇与所述正硅酸四乙酯的质量比为1:1.4～4.7；
再将所述Fe3O4@SiO2复合物分散于醇溶液中，加入丙烯酸类化合物和丙烯酰胺，随后在氮气保护下与引发剂和交联剂混合，于65～80℃下反应8～12小时，得到Fe3O4@SiO2-COOH复合粒子。
2.根据权利要求1所述的单分散超顺磁性羧基硅磁珠的制备方法，其特征在于，所述丙烯酸类化合物与所述丙烯酰胺的摩尔比为1:0.8～1.2。
3.根据权利要求1所述的单分散超顺磁性羧基硅磁珠的制备方法，其特征在于，所述丙烯酸类化合物包括丙烯酸、甲基丙烯酸。
4.根据权利要求1所述的单分散超顺磁性羧基硅磁珠的制备方法，其特征在于，所述引发剂为过硫酸钾或过硫酸铵，所述引发剂的用量是所述丙烯酸类化合物和所述丙烯酰胺总质量的1～5wt％。
5.根据权利要求1所述的单分散超顺磁性羧基硅磁珠的制备方法，其特征在于，所述交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺，所述交联剂的用量是所述丙烯酸类化合物和所述丙烯酰胺总质量的0.5～2.5wt％。
6.根据权利要求1所述的单分散超顺磁性羧基硅磁珠的制备方法，其特征在于，所述醇溶液为乙醇与水的混合溶液，其中乙醇与水的体积比为2～4:1。
7.根据权利要求1所述的单分散超顺磁性羧基硅磁珠的制备方法，其特征在于，所述Fe3O4纳米团簇是通过下述方法制备的：
将FeCl3·6H2O溶解到乙二醇中，加热至50～80℃时加入聚丙烯酸和无水醋酸钠，于200～260℃反应12～16小时，洗涤。
8.根据权利要求7所述的单分散超顺磁性羧基硅磁珠的制备方法，其特征在于，所述乙二醇与Fe3+的摩尔比例范围为175～185：1。
9.一种单分散超顺磁性羧基硅磁珠，其特征在于，其通过如权利要求1～8任一项所述的制备方法制得。
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