CN111991402A - 灵芝酸a在制备激活脑部cd4+t细胞抑制神经炎症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了灵芝酸A在制备激活脑部CD4+T细胞抑制神经炎症药物中的应用。本发明通过实验发现，灵芝酸A显著上调小鼠脑部CD4+T含量，降低L‑1β、IL‑6、TNF‑α、NF‑κB等水平，下调Aβ_1‑42、p‑Tau、APOE、IBA‑1和GFAP等蛋白的表达，提示灵芝酸A具有激活脑部CD4+T细胞抑制神经炎症的作用。经细胞和动物急性毒性实验证实，灵芝酸A安全剂量范围较大，可在制备激活脑部CD4+T细胞抑制神经炎症的药物中应用。

Description

灵芝酸A在制备激活脑部CD4+T细胞抑制神经炎症药物中的 应用

技术领域：

本发明属于生物医药领域，具体涉及灵灵芝酸A在制备激活脑部CD4+T细胞抑制神经炎症药物中的应用。

背景技术：

神经炎症发生在中枢神经系统(CNS)中，是感染、损伤、自身免疫过程或毒性的结果。小胶质细胞，作为中枢神经系统中特定驻留的巨噬细胞，在神经炎症的发生和消退中起关键作用，然而，他们对神经元的影响是复杂的，小胶质细胞的表型可塑性可直接受脑微环境区域影响，因此，用于描述其他巨噬细胞活性的M1/M2二分法标记不足以反映小胶质细胞群体的真正异质性，众所周知，在神经退行性疾病中，小胶质细胞可能表现出与M1和M2型态中发现的基因的表达相关的“疾病相关的小胶质细胞特征”。因此，尽管小胶质细胞对神经元损伤的初始反应很重要，但通常会导致这些疾病的神经元丢失。

与其他器官系统相似，局部炎症是脑衰老的一个常见特征。胶质细胞，特别是小胶质细胞，通常在衰老的脑中表现出一种激活状态，其特征是获得变形虫样形态，产生促炎性细胞因子，包括白细胞介素1b(IL-1b)、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。补体级联是一种“攻击”和破坏细胞膜的蛋白-蛋白相互作用的连续反应，它也可能在衰老的脑中被激活，并与AD和缺血性中风的发病机制有关。补体级联的遗传或药理学抑制作用可改善正常衰老期间以及AD和中风小鼠模型中发生的突触丢失和神经元死亡。另外，活化的小胶质细胞表达一种诱导型NO合酶，并产生大量可引起神经元氧化损伤的NO。此外，因免疫细胞对入侵病原体的反应而闻名的Toll样受体(TLR)越来越多地与年龄相关的脑部疾病的神经炎症有关。在与年龄相关的神经退行性疾病模型中，实验激活小胶质细胞TLR4受体会加剧神经元变性，而药理学抑制小胶质细胞激活则具有神经保护作用。先天免疫反应的异常激活可能与脑衰老的其他特征有关。在脑衰老和神经退行性疾病中，免疫细胞的异常激活导致突触变性和功能损伤，但如果调控得当，同样的途径也可以在神经可塑性和神经元应激抵抗中发挥重要作用。例如，(1)TNF-α在海马突触可塑性和学习记忆中起重要作用；(2)补体蛋白在健康的发育中和成年脑中介导自适应突触重塑；(3)TLRs在神经元中表达，它们在调节发育和成人神经可塑性中起作用；(4)在癫痫发作，TBI和AD模型中，TNF-α受体缺陷型小鼠的海马神经元发生功能障碍和变性的可能性增加；(5)TLR2和4调节食量，副交感神经系统和体重。星形胶质细胞也可能有助于对年龄相关的神经元应激的适应性反应。它们产生神经营养因子，从突触中去除谷氨酸，并增强神经元生物能。在衰老过程中，星形胶质细胞的这些功能可能会受到损害，从而加剧病理性神经炎症过程。

2020年7月22日，来自欧洲的Adrian Liston研究组在Cell上发表题为MicrogliaRequire CD4 T Cells to Complete the Fetal-to-Adult Transition的文章，发现健康的大脑中中大约存在2000个左右CD4+T细胞，其中150个左右为调节性T细胞，这部分细胞在小胶质细胞的发育成熟过程中起到关键性作用。因此，调节CD4+T细胞的发育，可以调控小胶质细胞的成熟发育。

灵芝Ganoderma lucidum(Curtis:Fr)Karsten是一种大型药用真菌，属于真菌界(Fungi)、担子菌门(Basidiomycota)、伞菌亚门(Agaricomycotina)、伞菌纲(Agaricomycetes)、多孔菌目(polyporales)，灵芝科(Ganodermataceae)、灵芝属(Ganoderma。包括赤芝G.lucidum(Levss.exFr.).和紫芝G.sinense.的干燥子实体。始载于《神农本草经》，分为赤芝(丹芝)、黑芝(玄芝)、青芝(龙芝)、白芝(玉芝)、黄芝(金芝)和紫芝(木芝)，列为上品药材，具有补中益气、滋阴强壮、扶正固本、延年益寿等功效。现代药理临床研究证明，灵芝具有多种生物活性及药理作用，如抗肿瘤、护肝、抗衰老、降血糖、调节免疫、改善造血机能、镇痛、镇静、降血压、强心、调节内分泌、抗疲劳、抑菌的作用。灵芝中的含有多糖、三萜、核苷、生物碱、氨基酸多肽、微量元素等多种成分是其药效物质基础，其中三萜和多糖是灵芝最主要的两大活性成分。

目前各种灵芝中分离到的三萜类化合物已达100多种对于我国在灵芝的开发目标及人们需求上来讲，灵芝的药剂与保健品在科学技术、产品质量及生产设备上远远还不能达到标准，要进一步的深化研究和开发灵芝产品。要利用现代的工艺技术，先进的设备对灵芝的种植、加工、成品质量进行严格化、标准化把关，促进灵芝产业不断向前发展。

目前国内外对灵芝的研究主要集中在灵芝多糖、三萜抗肿瘤和提高免疫等方面，但对灵芝酸A在激活脑部CD4+T细胞抑制神经炎症中的应用研究还较少。

灵芝酸A，CAS号：81907-62-2，其结构如式I所示：

发明内容：

本发明的目的是提供灵芝酸A在制备激活脑部CD4+T细胞抑制神经炎症药物中的应用。

本发明通过实验发现，灵芝酸A显著上调小鼠脑部CD4+T含量，降低L-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB等水平，下调Aβ_1-42、p-Tau、APOE、IBA-1和GFAP等蛋白的表达，提示灵芝酸A具有激活脑部CD4+T细胞抑制神经炎症的作用。

因此，本发明提供了灵芝酸A在制备激活脑部CD4+T细胞抑制神经炎症药物中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种激活脑部CD4+T细胞抑制神经炎症药物，其含有灵芝酸A作为活性成分和药学上可接受的载体。

所述的药物，其剂型可以为片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂或口服液等，其制备方法采用常规的方法制备即可。

本发明通过实验发现，灵芝酸A显著上调小鼠脑部CD4+T含量，降低L-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB等水平，下调Aβ_1-42、p-Tau、APOE、IBA-1和GFAP等蛋白的表达，提示灵芝酸A具有激活脑部CD4+T细胞抑制神经炎症的作用。经细胞和动物急性毒性实验证实，灵芝酸A安全剂量范围较大，可在制备激活脑部CD4+T细胞抑制神经炎症的药物中应用。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：灵芝酸A对LPS致BV2细胞损伤模型的保护作用

按照细胞培养法，用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基加青霉素100units/ml、链霉素100ug/ml，置37℃，5％CO₂的培养箱内培养，每隔24h换1次培养液，48h传代1次。取对数生长期BV2细胞，种植于12孔板内，12h后加入含2μg/ml LPS的培养基1ml，孵育4h，后再直接加入含有灵芝酸A的培养基1ml处理24h后，每个处理三个重复，采用MTT法检测细胞生存率，Western boltiong法测定细胞中L-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB等的水平，结果见表1和表2。

表1灵芝酸A对LPS致BV2细胞损伤模型的保护作用

注：#p<0.05与正常组比较，*p<0.05，**p<0.01与模型组比较

由表1可以看出，BV2细胞经LPS和灵芝酸A处理后，细胞存活率显著上升，说明灵芝酸A能够逆转由LPS导致的BV2细胞存活率降低的状况，而LPS能够用于制备细胞炎症损伤模型。

表2灵芝酸A对LPS致BV2细胞损伤模型中炎症水平的影响情况

注：#p<0.05与正常组比较，*p<0.05，**p<0.01与模型组比较

由表2可知，LPS显著激活了BV2细胞中L-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB等炎症因子水平；而经灵芝酸A处理之后，L-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB等水平显著降低，均接近于正常值，提示灵芝酸A可显著降低由LPS激活的促炎因子。

实施例2：灵芝酸A(简写GA)激活APP/PS1双转基因小鼠脑部CD4+T细胞的实验研究

以SPF级2月龄APP/PS1进行试验，实验设置：正常对照组、模型组、治疗组(GA25mg/kg体重、GA 50mg/kg体重)，每组8只老鼠。正常对照组、模型组分别以2mL/d生理盐水灌胃，其余各治疗组(GA 25mg/kg体重、GA 50mg/kg体重)按各自剂量灌胃给予灵芝酸A治疗(灌胃量2mL/d)，各组持续给药6个月。6个月后，行为学评估之后，采用Western boltiong实验检测脑组织中L-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB、Aβ_1-42、p-Tau、APOE、IBA-1和GFAP等蛋白的表达情况。

表3灵芝酸A对APP/PS1模型小鼠脑部CD4+T、小胶质和星形胶质细胞的影响情况

注：#p<0.05与正常组比较，*p<0.05，**p<0.01与模型组比较

表4灵芝酸A对APP/PS1模型小鼠脑组织中Aβ_1-42、p-Tau、APOE、TREM2等蛋白的表达影响情况

注：#p<0.05与正常组比较，*p<0.05，**p<0.01与模型组比较

由表3可知，与模型组(APP/PS1)比较，灵芝酸A给药组能改变CD4+T细胞、小胶质细胞(IBA-1)和星形胶质(GFAP)等的表达水平；同时显著降低L-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB等促炎因子。

由表4可知，与模型组比较，灵芝酸A给药处理后，脑组织中Aβ_1-42、p-Tau、APOE和TREM2等蛋白的表达量明显减少，提示灵芝酸A能够改善APP/PS1小鼠脑组织中炎症水平，显著减少病理性蛋白Aβ_1-42和p-Tau等的累积。

因此，由上述可以看出，灵芝酸A能激活脑CD4+T细胞，改善因痴呆疾病导致的神经炎症。

实施例3：灵芝酸A(简写GA)激活SAMP8快速老化小鼠脑部CD4+T细胞的实验研究

以SPF级2月龄SAMP8小鼠为研究对象。实验设置：正常对照组、模型组、治疗组(GA25mg/kg体重、GA 50mg/kg体重)，每组8只小鼠。对照组和模型组分别以2mL/d生理盐水灌胃，其余各治疗组(GA 25mg/kg、GA 50mg/kg)按各自剂量灌胃给予灵芝酸A治疗，各组持续给药6个月。6个月后，行为学评估之后，采用Western boltiong实验检测脑组织中L-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB、IBA-1和GFAP等蛋白的表达情况。

表5灵芝酸A对SAMP8快速老化小鼠脑部CD4+T、小胶质和星形胶质细胞的影响情况

注：#p<0.05与正常组比较，*p<0.05，**p<0.01与模型组比较

试验结果如表5所示，从表5可以看出，与模型组(SAMP8)比较，灵芝酸A给药组能激活CD4+T细胞，抑制小胶质细胞(IBA-1)和星形胶质(GFAP)等的表达水平；同时显著降低L-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB等促炎因子。以上提示灵芝酸A能激活脑CD4+T细胞，改善因快速衰老导致的神经炎症。

实施例4：灵芝酸A(简写GA)改善正常衰老小鼠脑部CD4+T细胞的实验研究

以8月龄SPF级C57小鼠为研究对象。实验设置：8月龄对照组、模型组、治疗组(GA25mg/kg体重、GA 50mg/kg体重)，每组8只老鼠。

对照组、模型组以2mL/d生理盐水灌胃，其余各治疗组(GA 25mg/kg、GA 50mg/kg)按各自剂量灌胃给予灵芝酸A治疗，各组持续给药12个月。12个月后，采用Westernboltiong实验检测脑组织中L-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB、IBA-1和GFAP等蛋白的表达情况。

表6灵芝酸A对正常老年小鼠脑部CD4+T、小胶质和星形胶质细胞的影响情况

注：#p<0.05与正常组比较，*p<0.05，**p<0.01与模型组比较

试验结果如表6所示，从表6可以看出，与8月龄年轻组比较，衰老模型组(20月龄)显示出低度炎症；而与衰老模型组(20月龄)比较，灵芝酸A给药组能上调CD4+T细胞，抑制小胶质细胞(IBA-1)和星形胶质(GFAP)等的激活；同时显著降低L-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB等促炎因子。以上提示灵芝酸A能激活脑CD4+T细胞，改善衰老导致的神经炎症。

实施例5：安全性评价

毒性试验，按照《中药、天然药物安评技术指导原则》，灵芝酸A给药量范围为5mg/kg-300mg/kg。最大给药量300mg/kg灌胃给予昆明小鼠，连续观察14天，未有动物死亡。表明灵芝酸A的安全剂量范围较大，用药安全。

实施例6：含有灵芝酸A的片剂的制备

按质量份数计，有效成分：灵芝酸A 65份；辅料：糊精20份、羟基淀粉钠5份、硬脂酸镁5份、二氧化硅5份。制备工艺：将灵芝酸A、糊精、羟基淀粉钠、硬脂酸镁、二氧化硅混合均匀、压片、分装入瓶即可。

Claims (4)

1.灵芝酸A在制备激活脑部CD4+T细胞抑制神经炎症药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物，其剂型为片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂或口服液。

3.一种激活脑部CD4+T细胞抑制神经炎症药物，其特征在于，其含有灵芝酸A作为活性成分和药学上可接受的载体。

4.根据权利要求3所述的激活脑部CD4+T细胞抑制神经炎症药物，其特征在于，所述的药物，其剂型为片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂或口服液。