CN113995761A - 灵芝酸a在延缓衰老中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明一种灵芝酸A在延缓衰老中的应用，公开了灵芝酸A新的医疗用途，提供了灵芝酸A在制备治疗或预防延缓衰老的药物或功能性产品中的应用，所述灵芝酸A可改善衰老C57BL/6J小鼠的最大步速指数、握力指数、脾脏指数和胸腺指数，改善经D‑gal处理的小鼠巨噬细胞的细胞活性，有效预防小鼠巨噬细胞的衰老，因此本发明所述灵芝酸A能够用于治疗或预防延缓衰老；本发明还提供了灵芝酸A在制备端粒酶活性调控剂的药物或功能性产品中的应用，所述灵芝酸A可维持端粒长度，正向调控端粒酶活性。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物化学及医药技术领域，具体涉及灵芝酸A(ganodericacidA)在制备治疗或预防延缓衰老的药物或功能性产品中的应用。
背景技术
世界迎来“全球老龄化”时代，而我国已进入老龄化社会并处于老龄化不断加深的阶段。60岁以上老年人数量从2010年的1.78亿快速增长到2020年的2.6亿，占总人口比例从2010年13.3％增长至2020年18.7％。预计2030年，全国60岁以上人口将提升至33％以上，老龄化群体扩大带来的社会负担日益加重。衰老与众多年龄相关的疾病密切相关，包括阿尔茨海默病、认知缺损、免疫系统功能下降、II型糖尿病、自体免疫疾病心脏病及多种癌症等。因此，发现具有高效的抗衰老活性成分或药物具有重要意义。
灵芝酸A(Ganoderic acid A，CAS号：81907-62-2)是从灵芝科(Ganodermataceae)中分离出的一种四环三萜类化合物。专利201410197934.9公开了灵芝酸A可用于治疗抑郁症，专利202010976446.3公开了灵芝酸A可激活脑部CD4+T细胞抑制神经炎症，专利201510141041.7公开了灵芝酸A可用于制备治疗或预防丙型肝炎病毒疾病的药物。但至今未见灵芝酸A有延缓衰老作用的相关报道。
灵芝酸A的化学结构式如下：
发明内容
本发明的目的在于提供灵芝酸A的新的医药用途。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供了式(I)所示的灵芝酸A在制备治疗或预防延缓衰老药物或功能性产品中的应用，
式(I)。
本发明通过灵芝酸A对衰老C57BL/6J小鼠的抗衰老作用研究发现，与2个月龄C57BL/6J正常小鼠相比，12个月龄C57BL/6J衰老小鼠的最大步速、握力、脾脏指数和胸腺指数均显著降低，每日经口灌胃给予衰老小鼠25mg/kg灵芝酸A 30天后，衰老C57BL/6J小鼠的最大步速指数、握力指数、脾脏指数和胸腺指数显著提高，衰老C57BL/6J小鼠的肾脏和胸腺中阳性细胞比例显著降低，提示，本发明所述灵芝酸A具有延缓衰老的作用。
本发明通过MTT法和β-半乳糖苷酶染色法测定正常组、模型组、10μM灵芝酸A给药组小鼠巨噬细胞的细胞活性和细胞衰老情况。细胞活性结果显示，与正常组相比，模型组细胞活性显著降低，与模型组相比，10μM灵芝酸A给药组细胞活性显著提高，提示，本发明所述灵芝酸A能够改善经D-gal处理后的小鼠巨噬细胞的活性；细胞衰老情况结果显示，与正常组相比，模型组衰老细胞明显增高，与模型组相比，10μM灵芝酸A给药组衰老细胞明显降低，提示，灵芝酸A可以有效预防RAW264.7细胞的衰老。
具体的，所述灵芝酸A具有降低衰老小鼠血清或衰老小鼠巨噬细胞中IL-4、IL-6、TNF-α的水平。
具体的，所述灵芝酸A具有提高衰老小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px的水平。
本发明通过测定正常组、模型组、25mg/kg灵芝酸A给药组衰老小鼠血清中SASP因子和ROS相关蛋白的表达水平，显示，本发明所述灵芝酸A可显著降低衰老小鼠血清SASP因子(IL-4、IL-6、TNF-α)的水平，提高ROS相关蛋白(SOD、CAT、GSH-Px)的水平。
本发明通过测定正常组、模型组、10μM灵芝酸A给药组衰老小鼠巨噬细胞中SASP因子的分泌和表达，显示，本发明所述灵芝酸A可有效抑制IL-4、IL-6和TNF-α的分泌和表达。
本发明还提供了灵芝酸A在制备端粒酶活性调控剂的药物或功能性产品中的应用。
具体的，所述灵芝酸A具有正向调控端粒酶活性的功能。
本发明通过实时荧光定量PCR测定正常组、模型组、25mg/kg灵芝酸A给药组C57BL/6J小鼠各脏器中端粒酶活性，显示，与正常组相比，模型组C57BL/6J小鼠各脏器中端粒酶活性在大脑、肾脏、心脏、胸腺、肝脏中明显降低，与模型组相比，25mg/kg灵芝酸A给药组C57BL/6J小鼠各脏器中端粒酶活性在大脑、肝脏、心脏、胸腺中具有不同程度的提高，提示，本发明所述灵芝酸A具有正向调控衰老C57BL/6J小鼠端粒酶活性的功能。
本发明通过实时荧光定量PCR测定正常组、模型组、10μM灵芝酸A给药组小鼠巨噬细胞端粒酶活性，显示，与正常组相比，模型组小鼠巨噬细胞端粒酶活性明显降低，与模型组相比，10μM灵芝酸A给药组小鼠巨噬细胞端粒酶活性明显提高，提示，本发明所述灵芝酸A具有正向调控衰老小鼠巨噬细胞中端粒酶活性的功能。
具体的，灵芝酸A具有维持端粒长度的功能。
本发明通过实时荧光定量PCR测定正常组、模型组、25mg/kg灵芝酸A给药组C57BL/6J小鼠各脏器中端粒长度的变化，显示，与正常组相比，模型组C57BL/6J小鼠各脏器中端粒长度在大脑、肝脏、肾脏、心脏、胸腺中明显缩短，与模型组相比，25mg/kg灵芝酸A给药组C57BL/6J小鼠各脏器中端粒长度在大脑、肾脏、心脏、胸腺中具有不同程度的延长，提示，本发明所述灵芝酸A具有维持衰老C57BL/6J小鼠端粒长度的功能。
具体的，灵芝酸A具有维持端粒酶Tert的RNA表达量的功能。
本发明通过测定正常组、模型组、10μM灵芝酸A给药组衰老小鼠巨噬细胞中端粒酶Tert的RNA表达量，显示，与正常组相比，模型组小鼠巨噬细胞中端粒酶Tert的RNA表达显著降低，与模型组相比，10μM灵芝酸A给药组小鼠巨噬细胞中端粒酶Tert的RNA均表达量上升，提示，本发明所述灵芝酸A可显著提高衰老小鼠巨噬细胞中端粒酶Tert的转录水平。
具体的，所述药物的剂型包括片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊、口服液、乳液或注射液。
具体的，所述功能性产品的剂型包括茶剂、冲剂、丸剂、膏剂、饮料、糖浆、饼干类、糖果类或糕点类。
具体的，所述药物或功能性产品还包括药学上可接受的辅料。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明发掘了四环三萜类化合物灵芝酸A的新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域；
(2)经检测，四环三萜类化合物灵芝酸A药理作用强，预示着很好的药用前景；
(3)经检测，四环三萜类化合物灵芝酸A具有显著的抗衰老作用，可用于制备治疗或预防延缓衰老的药物或功能性产品，本发明为寻找延缓衰老的药物或功能性产品提供了新的来源。
附图说明
图1为实施例1中C57BL/6J小鼠最大步速指数分布；
图2为实施例1中C57BL/6J小鼠握力指数分布；
图3为实施例1中C57BL/6J小鼠脾脏指数；
图4为实施例1中C57BL/6J小鼠胸腺指数；
图5为实施例1中C57BL/6J小鼠大脑、肾脏等脏器衰老检测图；
图6为实施例2中灵芝酸A对衰老C57BL/6J小鼠SASP因子的影响；
图7为实施例2中灵芝酸A对衰老C57BL/6J小鼠ROS相关蛋白的影响；
图8为实施例2中灵芝酸A对衰老C57BL/6J小鼠的大脑、肾脏、心脏、胸腺端粒长度的影响；
图9为实施例2中灵芝酸A对衰老C57BL/6J小鼠的大脑、肾脏、心脏、胸腺端粒酶活性的影响；
图10为实施例3中10μM浓度的灵芝酸A对D-gal处理后的小鼠巨噬细胞活性的影响；
图11为实施例3中10μM浓度灵芝酸A预处理后对衰老细胞比例的影响；
图12为实施例3中10μM浓度灵芝酸A对小鼠巨噬细胞SASP相关蛋白表达的影响；
图13为实施例3中10μM浓度灵芝酸A对小鼠巨噬细胞端粒酶转录水平的影响；
图14为实施例3中10μM浓度灵芝酸A对小鼠巨噬细胞端粒酶活性的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：本发明公开的具体实施方式中，所有实验动物的使用及福利相关内容和程序均遵从实验动物使用和管理的相关法律法规的相关规定。
实验动物与试剂名称及供应商见表1。
表1实验动物与试剂名称及供应商
实验仪器名称与供应商详见表2。
表2实验仪器名称与供应商
实施例1：灵芝酸A的抗衰老作用
实验分组与给药：将实验动物分为正常组(2月龄C57BL/6J小鼠，10只，每日经口灌胃给予蒸馏水0.2ml/10g)、模型组(12月龄C57BL/6J小鼠，10只，每日经口灌胃给予蒸馏水0.2ml/10g)、25mg/kg灵芝酸A给药组(12月龄C57BL/6J小鼠，10只，每日经口灌胃给予灵芝酸A 0.2ml/10g)，实验周期为30天。
统计学方法：实验结果以均数±标准差表示，采用SPSS 19.0软件进行统计分析，运用T检验比较两组间差异，#P﹥0.05表示差异不显著，*p<0.05表示差异显著，5％显著性水平；**P<0.01表示差异显著，1％显著性水平；***P<0.001表示差异显著，0.1％显著性水平。
最大步速指数检测：使用小鼠转棒仪分别检测正常组、模型组和25mg/kg灵芝酸A给药组每只C57BL/6J小鼠的最大步速指数分布，测试分为练习阶段和测试阶段：(1)练习阶段：每只小鼠在25rpm转速下测试，每天测试2次，连续3天；(2)测试阶段：第4天，对每只小鼠依次测试，小鼠转棒仪自动记录下5次读数，取中间3次计算每只小鼠的平均值作为其在棒时间，评估其运动平衡与协调能力。
实验结果：见图1，与正常组相比，模型组C57BL/6J小鼠的最大步速显著降低；与模型组相比，25mg/kg灵芝酸A给药组C57BL/6J小鼠的最大步速显著提高，提示，本发明所述灵芝酸A可以改善衰老C57BL/6J小鼠的最大步速指数。
握力检测：使用小鼠抓力仪分别检测正常组、模型组和25mg/kg灵芝酸A给药组每只C57BL/6J小鼠的四肢握力指数分布，测试分为练习阶段和测试阶段：(1)练习阶段：将小鼠放到抓力板上，水平匀速向后拉其尾部，记录抓力值，每天测试2次，连续测试3天；(2)测试阶段：第4天，对每只小鼠依次测试，连续测试5次，每次间隔15秒，相应记录每次的抓力值，取中间3次计算平均值，即为每只小鼠的抓力值。
实验结果：见图2，与正常组相比，模型组C57BL/6J小鼠的握力显著降低；与模型组相比，25mg/kg灵芝酸A给药组C57BL/6J小鼠的握力显著提高，提示，本发明所述灵芝酸A可以改善衰老C57BL/6J小鼠的握力指数。
脾脏/胸腺指数检测：取正常组、模型组和25mg/kg灵芝酸A给药组每只C57BL/6J小鼠的胸腺和脾脏，用滤纸吸干残血，称重(mg)，分别除以小鼠体重(g)，再乘以10，即得到胸腺指数和脾脏指数。
实验结果：见图3-4，与正常组相比，模型组C57BL/6J小鼠的脾脏指数和胸腺指数均降低；与模型组相比，25mg/kg灵芝酸A给药组C57BL/6J小鼠的脾脏指数和胸腺指数明显上升。
组织SA-β-gal染色，具体步骤：
S1.组织固定：取正常组、模型组和25mg/kg灵芝酸A给药组每只C57BL/6J小鼠的大脑、肾脏、心脏、胸腺、肝脏、脾脏，分别用新鲜组织固定液固定24h以上，将组织从固定液取出，用手术刀将目的部位组织修平整；
S2.OCT包埋：将步骤S1中得到的组织放置于包埋台上，组织周围滴加OCT包埋剂，包埋台放置于冰冻切片机的速冻台上速冻包埋；
S3.切片：待步骤S2中OCT包埋剂变白变硬后，将包埋台固定于切片机上，先粗切，待组织面修切平整后即可开始切片，切片厚度8-10μm，将切出的组织片放置于载玻片上，于-20℃保存备用；
S4.取步骤S3中的冰冻切片组织，加入β-半乳糖苷酶染色固定液至充分盖住切片组织，室温固定20分钟；
S5.用PBS浸泡洗涤步骤S4中的切片组织3次，每次5分钟；
S6.吸除步骤S5中的PBS，加入染色工作液至淹没整个切片组织(染色工作液的配方见表3)，用parafilm封口膜或保鲜膜封住，37℃孵育过夜；
S7.将步骤S6中的组织切片于倒置显微镜下观察。
表3染色工作液配方
| 试剂 | 体积(μL) |
| β-半乳糖苷酶染色液A | 10 |
| β-半乳糖苷酶染色液B | 10 |
| β-半乳糖苷酶染色液C | 930 |
| X-Gal溶液 | 50 |
实验结果：如图5，与正常组相比，模型组C57BL/6J小鼠的肾脏和脾脏明显衰老，与模型组相比，25mg/kg灵芝酸A给药组C57BL/6J小鼠的肾脏和脾脏中阳性细胞比例低于模型组。
本发明所述灵芝酸A可以改善衰老C57BL/6J小鼠的最大步速指数、握力指数、脾脏指数和胸腺指数，降低衰老C57BL/6J小鼠肾脏和脾脏中阳性细胞的比例，提示，本发明所述灵芝酸A具有延缓衰老的作用。
实施例2：灵芝酸A延缓小鼠衰老作用的作用机制
实验分组与给药：具体方法同实施例1。
统计学方法：具体方法同实施例1。
SASP因子检测：分别采用IL-4(SEA077Mu)ELISA试剂盒、IL-6(SEA079Mu)ELISA试剂盒、TNF-α(SCA133Mu)ELISA试剂盒检测正常组、模型组和25mg/kg灵芝酸A给药组C57BL/6J小鼠血清中白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、胰岛素样生长因子-α(TNF-α)的蛋白质表达量。
实验结果：见图6，与模型组相比，25mg/kg灵芝酸A给药组可有效抑制IL-4、IL-6和TNF-α的表达。
ROS相关蛋白检测：分别采用超氧化物歧化酶(SOD/S0109)检测试剂盒、过氧化氢酶(CAT/S0051)检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px/S0058)检测试剂盒检测正常组、模型组和25mg/kg灵芝酸A给药组C57BL/6J小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的蛋白质表达量。
实验结果：见图7，与正常组相比，模型组C57BL/6J小鼠血清中SOD、CAT及GSH-Px水显著降低；与模型组相比，25mg/kg灵芝酸A给药组C57BL/6J小鼠血清中SOD、CAT及GSH-Px显著提升水平。
端粒长度检测
实验方法：S1.基因组DNA的提取
本实施例中基因组DNA的提取采用索莱宝生物有限公司的DNA提取试剂盒，具体操作步骤为：
(1)样品的处理：分别取正常组、模型组和25mg/kg灵芝酸A给药组小鼠的大脑、肾脏、心脏、胸腺、肝脏、脾脏组织于离心管中，用匀浆器匀浆，12000rpm离心1min收集细胞，除去上清，加200ul溶液A，振荡至完全混匀；
(2)向悬浮液中加入20ul的RNase A(10mg/ml)，55℃放置15min；
(3)加入20ul的蛋白酶K(10mg/ml)，充分颠倒混匀，55℃水浴消化，直至样品消化完全为止；
(4)加入200ul体积溶液B，充分颠倒混匀；
(5)加入200ul无水乙醇，充分混匀，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；
(6)向吸附柱中加入600ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；
(7)重复步骤(6)1次；
(8)12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温放置20min；
(9)将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加150ul经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心2min；
(10)将离心所得洗脱液再加入吸附柱中，12000rpm离心2min，即得正常组、模型组和25mg/kg灵芝酸A给药组C57BL/6J小鼠的大脑、肾脏、心脏、胸腺、肝脏、脾脏等脏器组织DNA样品。
S2.端粒长度的测定
(1)标准曲线绘制
分别将步骤S1中所得正常组、模型组和25mg/kg灵芝酸A给药组C57BL/6J小鼠的大脑、肾脏、心脏、胸腺、肝脏、脾脏等脏器组织DNA样品等浓度梯度稀释成100ng/μl、50ng/μl、25ng/μl、12.5ng/μl、6.25ng/μl，利用实时荧光定量PCR分别测定不同浓度样品端粒(Tel)基因、内参(36B4)基因PCR扩增的Ct值，并绘制标准曲线，端粒(Tel)基因、内参(36B4)基因的引物序列详见表4。
(2)荧光定量PCR测定
分别取步骤S1中所得正常组、模型组和25mg/kg灵芝酸A给药组C57BL/6J小鼠的大脑、肾脏、心脏、胸腺、肝脏、脾脏等脏器组织DNA样品，用TE缓冲液稀释至10ng/μl，利用实时荧光定量PCR分别测定正常组、模型组和25mg/kg灵芝酸A给药组C57BL/6J小鼠的大脑、肾脏、心脏、胸腺、肝脏、脾脏等脏器组织DNA样品的端粒(Tel)基因、内参(36B4)基因PCR扩增的Ct值，并计算相对端粒长度，即2-ΔΔCt(其中，ΔΔCt＝ΔCt实验组-ΔCt对照组，ΔCt＝Ct目的基因-Ct内参基因)。
表4端粒(Tel)基因、内参(36B4)基因引物序列
实验结果：见图8，与正常组相比，模型组C57BL/6J小鼠各脏器中端粒长度在大脑、肝脏、肾脏、心脏、胸腺中明显缩短；与模型组相比，25mg/kg灵芝酸A给药组C57BL/6J小鼠各脏器中端粒长度在大脑、肾脏、心脏、胸腺具有不同程度的延长。
端粒酶活性检测，具体步骤为：
S1.分别取正常组、模型组和25mg/kg灵芝酸A给药组C57BL/6J小鼠的大脑、肾脏、心脏、胸腺、肝脏、脾脏等新鲜组织约50mg于EP管中，用无菌眼科剪剪碎，再用组织匀浆器研磨；
S2.加入400μL的1×CHAPS裂解液、50μL PMSF(1mM)、50μL DTT(10mM)和0.5μL RNA酶抑制剂(RNain，10U/mL)，涡旋振荡10s，于冰上充分裂解30分钟；
S3.将步骤S2中所得裂解液于4℃、16000g离心40min，吸取上清移至无酶EP管中，即得细胞抽提液；
S4.取步骤S3中所得细胞抽提液进行TRAP反应，反应体系见表5；
S5.取步骤S4中所得PCR产物进行实时定量PCR测定，反应体系见表6、反应步骤见表7。
表5端粒酶延伸步骤反应体系
| 试剂 | 体积 |
| dNTP(2.5mM) | 2.5μL |
| 10×TRAP缓冲液 | 2.5μL |
| TSNT(0.1pM) | 1μL |
| 细胞抽提液 | 1μL |
| TS(10mM) | 1μL |
| RNain(10U/mL) | 0.25μL |
| 无酶水 | 16.75μL |
表6实时定量PCR扩增步骤反应体系
| 试剂 | 体积 |
| PCR产物 | 5μL |
| SYBR | 10μL |
| TS(10mM) | 1μL |
| ACX/NT(10mM) | 1μL |
| 无酶水 | 3μL |
表7实时定量PCR扩增步骤
实验结果：见图9，与正常组相比，模型组C57BL/6J小鼠各脏器中的端粒酶活性在大脑、肾脏、心脏、胸腺、肝脏中明显降低；与模型组相比，25mg/kg灵芝酸A给药组C57BL/6J小鼠各脏器中大脑、肾脏、心脏、胸腺中端粒酶活性具有不同程度的提高。
本发明所述灵芝酸A可通过降低衰老小鼠血清SASP因子(IL-4、IL-6、TNF-α)的水平、提高ROS相关蛋白(SOD、CAT、GSH-Px)的水平、延长端粒长度、提高端粒酶活性，延缓衰老。
实施例3：灵芝酸A对衰老小鼠巨噬细胞的影响
建模、分组与给药，具体步骤如下：
S1：称量2.25g的D-半乳糖(D-gal)粉剂，使其完全溶解于50ml双蒸水中，制成45mg/ml母液，并用0.22微米过滤器过滤，然后密封保存；
S2：将小鼠巨噬细胞(RAW264.7)在含10％(v/v)胎牛血清(FBS)和青霉素(100U/ml)的DMEM培养基中，在37℃、CO2浓度为5％的培养箱中培养，96孔板种版24小时后，等细胞覆盖培养皿大约80％后对细胞进行实验分组处理；
S3：将步骤S2培养所得细胞分为正常组、模型组、10μM灵芝酸A给药组，其中，正常组，用不含D-半乳糖的DMEM培养基孵育24h、48h及72h；模型组，首先用D-gal(10mg/ml)孵育48小时，然后正常孵育24h、48h及72h；25mg/kg灵芝酸A给药组，首先用10μM灵芝酸A预处理24h，再用D-gal(10mg/ml)诱导孵育48小时后，正常孵育24h、48h及72h。
统计学方法：具体方法同实施例1。
细胞活性检测：实验方法：采用MTT细胞增殖检测试剂盒(C0009)分别检测24h、48h和72h下正常组、模型组、10μM灵芝酸A给药组细胞活力的变化。
实验结果：见图10，与正常组相比，模型组细胞活性显著降低；与模型组相比，10μM灵芝酸A给药组细胞活性显著提高，提示，本发明所述灵芝酸A能够改善经D-gal处理后的小鼠巨噬细胞的活性。
细胞衰老情况检测：采用β-半乳糖苷酶染色试剂盒(C0602)分别检测正常组、模型组和10μM灵芝酸A给药组RAW264.7细胞的衰老情况。
实验结果：见图11，与正常组相比，模型组衰老细胞明显增高；与模型组相比，10μM灵芝酸A给药组衰老细胞明显降低，提示，灵芝酸A可以有效预防RAW264.7细胞的衰老。
SASP相关蛋白检测：分别采用IL-4(SEA077Mu)ELISA试剂盒、IL-6(SEA079Mu)ELISA试剂盒、TNF-α(SCA133Mu)ELISA试剂盒检测正常组、模型组和10μM灵芝酸A给药组RAW264.7细胞中白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、胰岛素样生长因子-α(TNF-α)的蛋白质表达量。
实验结果：见图12，与模型组相比，灵芝酸A给药组可有效抑制IL-4和TNF-α的表达。
端粒酶RNA检测，具体步骤为：
S1.采用RNA提取试剂盒分别提取正常组、模型组和10μM灵芝酸A给药组RAW264.7细胞中的总RNA，然后用Nanodrop仪检测总RNA含量，所得OD260/OD280＝1.9；
S2.采用RT-PCR试剂盒进行逆转录的过程，RT-PCR反应体系见表8，反应条件为：37℃、15min，85℃、5s，4℃、1h；
S3.采用SYBR Grenn染料法进行荧光定量PCR测定，荧光定量PCR引物序列见表9、反应体系见表10，将荧光定量PCR反应体系放置于PCR仪中，反应条件见表11，各基因的相对表达量通过CT值计算，计算公式为：相对表达量＝2-ΔΔCt，其中，ΔΔCt＝CT灵芝酸A给药组目的基因-CTGAPDH)-(CT正常组目的基因－CTGAPDH)。
表8PT-PCR反应体系
| 试剂 | 体积 |
| 5×PrimeScript Buffer | 4μL |
| PrimeScript RT Enzyme mix 1 | 1μL |
| Oligo dT Primer | 1μL |
| Random 6mers | 4μL |
| RNA | 2μL |
| Rnase Free H<sub>2</sub>O | 8μL |
表9荧光定量PCR引物序列
图10荧光定量PCR反应体系
| 试剂 | 体积 |
| cDNA | 1μL |
| 上游引物(F) | 1μL |
| 下游引物(R) | 1μL |
| SYBR Green | 10μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 7μL |
图11荧光定量PCR反应条件
实验结果：见图13，与正常组相比，模型组RAW264.7细胞中端粒酶Tert的RNA表达显著降低，POT1a、POT1b、RTEL1、TRF2、TPP1的RNA表达均没有显著性变化；与模型组相比，10μM灵芝酸A给药组RAW264.7细胞中端粒酶Tert的RNA均表达量上升，提示，本发明所述灵芝酸A可显著提高衰老小鼠巨噬细胞中端粒酶Tert的转录水平。
端粒酶活性检测
实验方法：采用端粒重复扩增法(TRAP-PCR)检测，具体操作步骤为：
S1.分别用胰酶消化正常组、模型组和10μM灵芝酸A给药组细胞，并收集1×106个，4℃预冷PBS洗两次；
S2.分别加入400μL的1×CHAPS裂解液、50μL PMSF(1mM)、50μL DTT(10mM)和0.5μLRNA酶抑制剂(RNain)(10U/mL)，4℃颠倒混匀裂解40min；
S3.将步骤S2中所得裂解液于4℃、16000g离心40min，吸取上清移至无酶EP管中，即得细胞抽提液；
S4.取步骤S3中所得细胞抽提液进行TRAP反应，反应体系见表12；
S5.取步骤S4中所得PCR产物进行实时荧光定量PCR测定，反应体系见表13、反应步骤见表14。
表12 TRAP反应的反应体系
| 试剂 | 体积 |
| dNTP(2.5mM) | 2.5μL |
| 10×TRAP缓冲液 | 2.5μL |
| TSNT(0.1pM) | 1μL |
| 细胞抽提液 | 1μL |
| TS(10mM) | 1μL |
| RNain(10U/mL) | 0.25μL |
| 无酶水 | 16.75μL |
表13实时荧光定量PCR反应体系
| 试剂 | 体积 |
| PCR产物 | 5μL |
| SYBR | 10μL |
| TS(10mM) | 1μL |
| ACX/NT(10mM) | 1μL |
| 无酶水 | 3μL |
表14实时荧光定量PCR反应条件
实验结果：见图14，与正常组相比，模型组RAW264.7细胞端粒酶活性明显降低；与模型组相比，10μM灵芝酸A给药组RAW264.7细胞端粒酶活性明显提高，提示，本发明所述灵芝酸A可提高衰老小鼠巨噬细胞中端粒酶活性。
由本实施例可知，(1)本发明所述灵芝酸A可显著改善经D-gal处理的RAW264.7细胞活性，有效预防RAW264.7衰老；(2)本发明所述灵芝酸A可有效抑制IL-4和TNF-α的分泌和表达，提高端粒酶Tert的RNA表达量，提高端粒酶活性，预防衰老。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种式（I）所示的灵芝酸A在制备治疗或预防延缓衰老的药物或功能性产品中的应用，
（I）。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述灵芝酸A具有降低衰老小鼠血清或衰老小鼠巨噬细胞中IL-4、IL-6、TNF-α的水平。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述灵芝酸A具有提高衰老小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px的水平。
4.一种式（I）所示的灵芝酸A在制备端粒酶活性调控剂的药物或功能性产品中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述灵芝酸A具有正向调控端粒酶活性的作用。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述灵芝酸A具有维持端粒长度的作用。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述灵芝酸A具有维持端粒酶Tert的RNA表达量的作用。
8.如权利要求1或4所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊、口服液、乳液或注射液。
9.如权利要求1或4所述的应用，其特征在于，所述功能性产品的剂型包括茶剂、冲剂、丸剂、膏剂、饮料、糖浆、饼干类、糖果类或糕点类。
10.如权利要求1或4所述的应用，其特征在于，所述药物或功能性产品还包括药学上可接受的辅料。
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| CN202111141675.4A CN113995761A (zh) | 2021-09-28 | 2021-09-28 | 灵芝酸a在延缓衰老中的应用 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115252759A (zh) * | 2022-08-24 | 2022-11-01 | 四川大学华西第二医院 | 酸奶衍生多肽在制备延缓端粒缩短药物及抗衰老药物中的应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003030811A2 (fr) * | 2001-10-11 | 2003-04-17 | Yves Saint Laurent Parfums | Utilisation d'acides ganoderiques en tant qu'agents cosmetiques |
| CN111991402A (zh) * | 2020-09-15 | 2020-11-27 | 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） | 灵芝酸a在制备激活脑部cd4+t细胞抑制神经炎症药物中的应用 |
| CN112043715A (zh) * | 2020-09-15 | 2020-12-08 | 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） | 灵芝酸a在制备改善gaba能神经元系统功能异常的药物中的应用 |
| CN112263584A (zh) * | 2020-10-30 | 2021-01-26 | 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） | 灵芝酸a及其衍生物或灵芝总三萜在制备治疗眼部疾病药物中的应用 |
-
2021
- 2021-09-28 CN CN202111141675.4A patent/CN113995761A/zh active Pending
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