CN111983054A - 一种用hplc分离测定依帕列净中间体有关物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，包括如下步骤：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以水为流动相A、乙腈‑甲醇（体积比60:40~40:60）为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～40℃，检测波长为205~230nm，采用紫外检测器对依帕列净中间体的有关物质进行检测。本发明方法通过综合考虑分析柱、流动相、梯度洗脱程序以及流速、柱温对分离检测的综合影响，使得检测结果达到了最优化，具有快速简便、灵敏度高、准确可靠、适用性广的优点，适用于分离测定依帕列净中间体的有关物质，从而有效的控制药品的质量。

Description

一种用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，具体涉及一种用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法。
背景技术
依帕列净(Empagliflozin，商品名Jardiance)，由勃林格殷格翰与礼来公司联合开发的一种新型的抗糖尿病药物，于2014年08月01日经美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市，用于改善2型糖尿病成人患者的血糖控制。依帕列净是一种新的钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂药物，通过抑制肾脏对葡萄糖的重吸收，增加葡萄糖排泄，进而降低糖尿病患者已升高的血糖水平。
(1S)-1,5-脱水-1-C-[4-氯-3-[[4-[[(3S)-四氢-3-呋喃基]氧基]苯基]甲基]苯基]-D-山梨糖醇四乙酸酯为依帕列净中间体，分子式：C31H35ClO11，分子量：619.06，化学结构式如下式(1)：
Figure BDA0002605551260000011
该中间体在制备过程中，因起始原料、合成工艺、降解等多种因素产生多个杂质，其中以杂质Ⅰ、杂质Ⅱ、杂质Ⅲ、杂质Ⅳ、杂质Ⅴ、杂质Ⅵ和杂质Ⅶ在合成工艺中较易产生，作为有关物质项目中主要考察杂质，其限度要求均为不得过0.50wt％。
杂质Ⅰ为副产物，分子式：C31H35ClO11，分子量：619.06，化学结构式如下式(2)：
Figure BDA0002605551260000012
杂质Ⅱ为第2步反应中间体，分子式：C32H37ClO12，分子量：649.08，化学结构式如下式(3)：
Figure BDA0002605551260000021
杂质Ⅲ为副产物，分子式：C23H27ClO7，分子量：450.91，化学结构式如下式(4)：
Figure BDA0002605551260000022
杂质Ⅳ为第1步反应中间体，分子式：C24H29ClO8，分子量：480.94，化学结构式如下式(5)：
Figure BDA0002605551260000023
杂质Ⅴ为起始物料，分子式：C17H16BrClO2，分子量：367.66，化学结构式如下式(6)：
Figure BDA0002605551260000024
杂质Ⅵ为副产物，分子式：C34H32Cl2O4，分子量：575.52，化学结构式如下式(7)：
Figure BDA0002605551260000025
杂质Ⅶ为依帕列净中间体的手性杂质，在反相色谱中与主峰重合，不能分开，需要正相色谱(手性)方法进行控制，杂质Ⅶ的分子式：C31H35ClO11，化学结构式如下式(8)。
Figure BDA0002605551260000031
该中间体的分析检测对反应控制和收率提高有着重要的作用，同时也直接影响着终产品的质量，所以建立一种操作简单、稳定有效的分析检测方法对依帕列净中间体进行分析检测是非常必要的。在现有的技术中，没有适合于快速、简便、精确分析检测依帕列净中间体有关物质的分析方法。因此，对于依帕列净中间体有关物质的测定方法存在进一步的改进和优化需求。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述技术问题，本发明人在进行了大量的深入研究之后，提供了一种用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，具有快速简便、灵敏度高、准确可靠的优点。
本发明采用的技术方案是：
一种用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，包括如下步骤：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以水为流动相A、乙腈-甲醇为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～40℃，流动相B乙腈-甲醇体积比为60:40～40:60；采用紫外检测器对依帕列净中间体的有关物质进行检测，所述紫外检测器的检测波长为205～230nm。
本发明所述的用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，其中，所述梯度洗脱的条件为：
时间，分钟 流动相A，体积％ 流动相B，体积％
0 35～45 55～65
35 5～15 85～95
50 5～15 85～95
51 35～45 55～65
65 35～45 55～65
由此可以提高主峰、杂质Ⅰ、杂质Ⅱ与杂质Ⅲ之间的分离度；若条件改变会降低主峰、杂质Ⅰ、杂质Ⅱ与杂质Ⅲ之间的的分离度。
本发明所述的用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，其中，所述梯度洗脱的条件为：
时间，分钟 流动相A，体积％ 流动相B，体积％
0 40 60
35 10 90
50 10 90
51 40 60
65 40 60
。
由此得到的分离效果最佳，峰形最好。
本发明所述的用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，其中，流动相B乙腈-甲醇体积比为50:50。由此，分离度和理论板数都较好。
本发明所述的用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，其中，色谱柱长为150mm～250mm，所述填充剂的粒径为1.8～5μm。
本发明所述的用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，其中，所述紫外检测器的检测波长为224nm。
本发明所述的用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，其中，所述依帕列净中间体的有关物质包括杂质Ⅰ、杂质Ⅱ、杂质Ⅲ、杂质Ⅳ、杂质Ⅴ和杂质Ⅵ的一种或多种，具体结构式如下所示：
Figure BDA0002605551260000041
Figure BDA0002605551260000051
本发明所述的用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，其中，色谱柱长为250mm。由此，可以进一步提高提高主峰、杂质Ⅰ、杂质Ⅱ与杂质Ⅲ之间的分离度。
本发明所述的用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，其中，所述填充剂的粒径为5μm。由此，可以进一步提高分离度。
本发明所述的用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，其中，流速为1.0ml/min，柱温为35℃。由此，可以进一步提高分离度。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明所述的用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，通过综合考虑分析柱、流动相、梯度洗脱程序以及流速、柱温对分离检测的综合影响，使得检测结果达到了最优化，可以将依帕列净中间体中的杂质Ⅰ、杂质Ⅱ、杂质Ⅲ、杂质Ⅳ、杂质Ⅴ和杂质Ⅵ在同一色谱条件进行快速高效的分离，并且该检测方法灵敏度高、专属性强、准确性强、快速简便、操作方便，可有效控制药品的质量，适用于分离测定依帕列净中间体的有关物质。
附图说明
图1为本发明中按实施例1条件检测的空白溶液的色谱图；
图2为本发明中按实施例1条件检测的系统适用性溶液的色谱图；
图3为本发明中按实施例1条件检测的供试品溶液的色谱图；
图4为本发明中按实施例1条件检测的定量限溶液的色谱图；
图5为本发明中按实施例1条件检测的检测限溶液的色谱图；
图6为本发明中按实施例2条件检测的空白溶液的色谱图；
图7为本发明中按实施例2条件检测的系统适用性溶液的色谱图；
图8为本发明中按实施例2条件检测的供试品溶液的色谱图；
图9为本发明中按实施例2条件检测的定量限溶液的色谱图；
图10为本发明中按实施例2条件检测的检测限溶液的色谱图；
图11为本发明中按实施例3条件检测的空白溶液的色谱图；
图12为本发明中按实施例3条件检测的系统适用性溶液的色谱图；
图13为本发明中按实施例3条件检测的供试品溶液的色谱图；
图14为本发明中按实施例3条件检测的定量限溶液的色谱图；
图15为本发明中按实施例3条件检测的检测限溶液的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。所用试剂及仪器未注明生产厂商者，均可以通过市购获得常规产品。
本发明实施例中所用的依帕列净中间体及杂质对照品均为发明人自制。
实施例1
色谱条件如下：
色谱柱：Agilent TC-C18250×4.6mm
流动相A：水
流动相B：乙腈：甲醇(体积比60:40)
柱温：35℃
流速：1.0ml/min
检测波长：224nm
进样量：20μL
梯度洗脱程序为：
表1梯度洗脱程序
时间，分钟 流动相A，体积％ 流动相B，体积％
0 40 60
35 10 90
50 10 90
51 40 60
65 40 60
溶液配制：
杂质对照品贮备液：取杂质Ⅰ对照品、杂质Ⅱ对照品、杂质Ⅲ对照品、杂质杂质Ⅳ对照品、杂质Ⅴ对照品、杂质Ⅵ对照品各约12.5mg，精密称定，置同一25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；所述稀释剂为：乙腈-水(50:50)(V/V)。
系统适用性溶液：取依帕列净中间体工作对照品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密加入上述杂质对照品贮备液1ml置上述100ml量瓶中，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：取依帕列净中间体约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
依帕列净中间体对照品贮备液：取依帕列净中间体工作对照品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
定量限溶液：精密量取所述杂质对照品贮备液及所述依帕列净中间体对照品贮备液各1ml至100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml至25ml，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
检测限溶液：精密量取所述定量限溶液5ml置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
测定：分别将空白溶液(即稀释剂)、系统适用性溶液、供试品溶液、定量限溶液和检测限溶液注入高效液相色谱仪进行检测，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(粒径为5μm，柱内径为4.6mm，色谱柱长为250mm)，按表1梯度洗脱程序检测，记录色谱图。
空白溶液(即稀释剂)、系统适用性溶液、供试品溶液、定量限溶液和检测限溶液的色谱图分别如图1、2、3、4和5所示，可知，图1表明空白不干扰杂质检查；图2表明各杂质及依帕列净中间体之间分离度良好，具体依帕列净中间体系统适用性图谱数据见表2，其中，杂质Ⅲ是一对非对应异构体杂质，在反向色谱中表现为双峰，故21.556min和22.263min均是杂质Ⅲ的保留时间；图3表明自制的依帕列净中间体样品中未检出杂质Ⅲ、杂质Ⅳ、杂质Ⅴ和杂质Ⅵ，检出的杂质Ⅰ、杂质Ⅱ均在0.5wt％以下；检出的其它单个杂质均在0.5wt％以下；图4表明依帕列净中间体及杂质Ⅰ、杂质Ⅱ、杂质Ⅲ、杂质Ⅳ、杂质Ⅴ和杂质Ⅵ的定量限分别为0.04wt％、0.04wt％、0.04wt％、0.04wt％、0.04wt％、0.04wt％和0.04wt％；图5表明依帕列净中间体及杂质Ⅰ、杂质Ⅱ、杂质Ⅲ、杂质Ⅳ、杂质Ⅴ和杂质Ⅵ的检测限分别为0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％和0.02wt％，低于各杂质的限度0.50wt％；本法的检测灵敏度高。
表2实施例1中依帕列净系统适用性图谱数据表
Figure BDA0002605551260000081
实施例2
色谱条件如下：
色谱柱：Agilent TC-C18250×4.6mm
流动相A：水
流动相B：乙腈：甲醇(体积比40:60)
柱温：35℃
流速：1.0ml/min
检测波长：224nm
进样量：20μl
梯度洗脱程序为：
表3梯度洗脱程序
时间，分钟 流动相A，体积％ 流动相B，体积％
0 40 60
35 10 90
50 10 90
51 40 60
65 40 60
溶液配制：
杂质对照品贮备液：取杂质Ⅰ对照品、杂质Ⅱ对照品、杂质Ⅲ对照品、杂质杂质Ⅳ对照品、杂质Ⅴ对照品、杂质Ⅵ对照品各约12.5mg，精密称定，置同一25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；所述稀释剂为：乙腈-水(50:50)(V/V)。
系统适用性溶液：取依帕列净中间体工作对照品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密加入上述杂质对照品贮备液1ml置上述100ml量瓶中，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：取依帕列净中间体约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
依帕列净中间体对照品贮备液：取依帕列净中间体工作对照品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
定量限溶液：精密量取所述杂质对照品贮备液及所述依帕列净中间体对照品贮备液各1ml至100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml至25ml，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
检测限溶液：精密量取所述定量限溶液5ml置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
测定：分别将空白溶液(即稀释剂)、系统适用性溶液、供试品溶液、定量限溶液和检测限溶液注入高效液相色谱仪进行检测，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(粒径为5μm，柱内径为4.6mm，色谱柱长为250mm)，按表3梯度洗脱程序检测，记录色谱图。
空白溶液(即稀释剂)、系统适用性溶液、供试品溶液、定量限溶液和检测限溶液的色谱图分别如图6、7、8、9和10所示，可知，图6表明空白不干扰杂质检查；图7表明各杂质及依帕列净中间体之间分离度良好，具体依帕列净中间体系统适用性图谱数据见表4，其中，杂质Ⅲ是一对非对应异构体杂质，在反向色谱中表现为双峰，故24.965min和25.920min均是杂质Ⅲ的保留时间；图8表明自制的依帕列净中间体样品中未检出杂质Ⅲ、杂质Ⅳ、杂质Ⅴ和杂质Ⅵ，检出的杂质Ⅰ、杂质Ⅱ均在0.5wt％以下；检出的其它单个杂质均在0.5wt％以下；图9表明依帕列净中间体及杂质Ⅰ、杂质Ⅱ、杂质Ⅲ、杂质Ⅳ、杂质Ⅴ和杂质Ⅵ的定量限分别为0.04wt％、0.04wt％、0.04wt％、0.04wt％、0.04wt％、0.04wt％和0.04wt％；图10表明依帕列净中间体及杂质Ⅰ、杂质Ⅱ、杂质Ⅲ、杂质Ⅳ、杂质Ⅴ和杂质Ⅵ的检测限分别为0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％和0.02wt％，低于各杂质的限度0.50wt％；本法的检测灵敏度高。
表4实施例2中依帕列净系统适用性图谱数据表
Figure BDA0002605551260000101
实施例3
色谱条件如下：
色谱柱：Agilent TC-C18250×4.6mm
流动相A：水
流动相B：乙腈：甲醇(体积比50:50)
柱温：35℃
流速：1.0ml/min
检测波长：224nm
进样量：20μl
梯度洗脱程序为：
表5梯度洗脱程序
时间，分钟 流动相A，体积％ 流动相B，体积％
0 40 60
35 10 90
50 10 90
51 40 60
65 40 60
溶液配制：
杂质对照品贮备液：取杂质Ⅰ对照品、杂质Ⅱ对照品、杂质Ⅲ对照品、杂质杂质Ⅳ对照品、杂质Ⅴ对照品、杂质Ⅵ对照品各约12.5mg，精密称定，置同一25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；所述稀释剂为：乙腈-水(50:50)(V/V)。
系统适用性溶液：取依帕列净中间体工作对照品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，精密加入上述杂质对照品贮备液1ml置上述100ml量瓶中，再加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：取依帕列净中间体约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
依帕列净中间体对照品贮备液：取依帕列净中间体工作对照品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
定量限溶液：精密量取所述杂质对照品贮备液及所述依帕列净中间体对照品贮备液各1ml至100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml至25ml，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
检测限溶液：精密量取所述定量限溶液5ml置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
测定：分别将空白溶液(即稀释剂)、系统适用性溶液、供试品溶液、定量限溶液和检测限溶液注入高效液相色谱仪进行检测，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(粒径为5μm，柱内径为4.6mm，色谱柱长为250mm)，按表5梯度洗脱程序检测，记录色谱图。
空白溶液(即稀释剂)、系统适用性溶液、供试品溶液、定量限溶液和检测限溶液的色谱图分别如图11、12、13、14和15所示，可知，图11表明空白不干扰杂质检查；图12表明各杂质及依帕列净中间体之间分离度良好，具体依帕列净中间体系统适用性图谱数据见表6，其中，杂质Ⅲ是一对非对应异构体杂质，在反向色谱中表现为双峰，故22.671min和23.487min均是杂质Ⅲ的保留时间；图13表明自制的依帕列净中间体样品中未检出杂质Ⅲ、杂质Ⅳ、杂质Ⅴ和杂质Ⅵ，检出的杂质Ⅰ、杂质Ⅱ均在0.5wt％以下；检出的其它单个杂质均在0.5wt％以下；图14表明依帕列净中间体及杂质Ⅰ、杂质Ⅱ、杂质Ⅲ、杂质Ⅳ、杂质Ⅴ和杂质Ⅵ的定量限分别为0.04wt％、0.04wt％、0.04wt％、0.04wt％、0.04wt％、0.04wt％和0.04wt％；图15表明依帕列净中间体及杂质Ⅰ、杂质Ⅱ、杂质Ⅲ、杂质Ⅳ、杂质Ⅴ和杂质Ⅵ的检测限分别为0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％、0.02wt％和0.02wt％，低于各杂质的限度0.50wt％；本法的检测灵敏度高。
表6实施例3中依帕列净系统适用性图谱数据表
Figure BDA0002605551260000121
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，其特征在于：包括如下步骤：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以水为流动相A、乙腈-甲醇为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～40℃，流动相B乙腈-甲醇体积比为60:40～40:60；采用紫外检测器对依帕列净中间体的有关物质进行检测，所述紫外检测器的检测波长为205～230nm。
2.根据权利要求1所述的用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，其特征在于：所述梯度洗脱的条件为：
时间，分钟 流动相A，体积％ 流动相B，体积％ 0 35～45 55～65 35 5～15 85～95 50 5～15 85～95 51 35～45 55～65 65 35～45 55～65
。
3.根据权利要求1所述的用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，其特征在于：所述梯度洗脱的条件为：
时间，分钟 流动相A，体积％ 流动相B，体积％ 0 40 60 35 10 90 50 10 90 51 40 60 65 40 60
。
4.根据权利要求1所述的用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，其特征在于：流动相B乙腈-甲醇体积比为50:50。
5.根据权利要求1所述的用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，其特征在于：色谱柱长为150mm～250mm，所述填充剂的粒径为1.8～5μm。
6.根据权利要求1所述的用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，其特征在于：所述紫外检测器的检测波长为224nm。
7.根据权利要求1所述的用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，其特征在于：所述依帕列净中间体的有关物质包括杂质Ⅰ、杂质Ⅱ、杂质Ⅲ、杂质Ⅳ、杂质Ⅴ和杂质Ⅵ的一种或多种，具体结构式如下所示：
Figure FDA0002605551250000021
8.根据权利要求1所述的用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，其特征在于：色谱柱长为250mm。
9.根据权利要求1所述的用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，其特征在于：所述填充剂的粒径为5μm。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的用HPLC分离测定依帕列净中间体有关物质的方法，其特征在于：流速为1.0ml/min，柱温为35℃。
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