CN106706768A - 一种分离测定恩格列净及其有关物质的方法 - Google Patents

一种分离测定恩格列净及其有关物质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分离测定恩格列净及其有关物质的方法，该方法采用高效液相色谱法，以辛烷基硅烷键合硅胶填料或苯基硅烷键合硅胶填料为色谱柱，以磷酸溶液与甲醇、乙腈组成流动相，进行梯度洗脱。该方法可以将恩格列净及其有关物质很好分离，检测的重现性好、灵敏度高、专属性强、操作简便，有助于控制恩格列净的质量和用药安全。

Description

一种分离测定恩格列净及其有关物质的方法
技术领域
本发明属于药物分析方法领域，具体涉及一种采用高效液相色谱法分离测定降糖药恩格列净及其有关物质的方法。
背景技术
恩格列净为一种选择性钠-葡萄糖协同转运蛋白(SGLT)抑制剂，用于治疗成人II型糖尿病。恩格列净通过对钠-葡萄糖协同转运蛋白选择性抑制作用，限制了大部分葡萄糖在体内的重吸收，促使葡糖大量从尿中排出达到控制血糖水平的目的。
恩格列净的化学结构式如下：
其化学名为： (1S)-1,5-脱水-1-C-[4-氯-3-[[4-[[(3S)-四氢-3-呋喃基]氧基]苯基]甲基]苯基]-D-葡萄糖醇。
恩格列净为全合成化学药，反应过程中可能产生的副产物或残留的中间体会影响其纯度和质量；在其储存过程中，可能会因为温度、光照等环境因素导致降解产物产生，也会影响其纯度和质量。这些残留的中间体、副反应产物、降解产物就是通常药物质量控制中所说的有关物质。
目前，有关恩格列净及其组合物的有关物质测定方法未见报道，为保证恩格列净原料药及其药物组合物的质量可控，以确保其有效性和安全性，亟需一种有效的检测方法，能够有效分离测定恩格列净及其有关物质。本发明人经过大量的科学试验和测试条件的筛选，发现一种快速分离测定恩格列净及其有关物质的方法，该方法可以有效控制了恩格列净的工艺杂质和降解产物，保证了恩格列净原料药及其药物组合物的质量可控，从而完成了本发明。
本发明人发现，已上市的恩格列净片剂，其中含有的乳糖、微晶纤维素等药用辅料在本发明的方法中不会干扰测定恩格列净及其有关物质的测定。因此，本发明同样适用于恩格列净的药物组合物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离测定恩格列净及其有关物质的方法，该方法能将恩格列净与其有关物质有效分离，准确检测恩格列净原料药和其药物组合物中的有关物质，从而控制恩格列净的质量，确保恩格列净药品的有效性和安全性。
为实现本发明的目的，提供如下实施方案。
在实施方案中，本发明是一种分离测定恩格列净及其有关物质的方法，该方法包括采用高效液相色谱法，以辛烷基硅烷键合硅胶填料柱或苯基硅烷键合硅胶填料柱为色谱柱，以磷酸溶液或磷酸盐缓冲液为水相与以甲醇乙腈组成的有机相混合作为流动相，进行梯度洗脱，以紫外检测器进行检测。
在上述实施方案中，本发明的方法，所述磷酸溶液或磷酸盐缓冲液的pH值为2～6，优选为3.5，其中，所述磷酸盐缓冲液所用磷酸盐选自磷酸二氢钠、磷酸二氢钾和磷酸二氢铵，优选磷酸盐为磷酸二氢钠，用磷酸溶液调节pH值，水相中磷酸盐浓度为0～0.005mol/L，优选0.002 mol/L。
在上述实施方案中，本发明的方法，所述有机相为甲醇与乙腈的混合溶液，其中，甲醇-乙腈的体积比为50:50。
在上述实施方案中，本发明的方法，水相与有机相的洗脱初始体积比为65∶35～45∶55，优选55∶45，水相与有机相的洗脱终止体积比为35∶65～15∶85，优选25∶75。
在上述实施方案中，本发明的方法，紫外检测波长为200～250nm，优选为224nm。
在上述实施方案中，本发明的方法，进一步包括以下步骤：
（1）取恩格列净原料药或其药物组合物，加流动相使恩格列净完全溶解并稀释定容，配制成每1ml溶液中含恩格列净0.4～0.8mg，优选0.8mg,滤过，作为供试品溶液；
（2）以辛烷基硅烷键合硅胶填料柱或苯基硅烷键合硅胶填料柱为色谱柱，流速为0.8～1.2ml/min，优选1.0 ml/min，柱温为20～30℃，优选25℃，波长为200～250nm，优选为224 nm；
（3）取供试品溶液10～30μl，优选20μl，注入高效液相色谱仪；
（4）将水相pH2～6的磷酸溶液或磷酸盐缓冲液与有机相甲醇、乙腈以65∶35～45∶55为初始体积比洗脱至主峰出来后，逐渐增大有机相比例，至水相与有机相的体积比达到 35∶65～15∶85并保持不少于10分钟，完成恩格列净有关物质的测定；
（5）采用不加校正因子的主成分对照品法以峰面积计算恩格列净的纯度及有关物质中各单一杂质含量及有关物质总量。
在上述实施方案中，本发明的方法，步骤（4）中优选的水相为pH3.5的磷酸溶液；优选的水相与有机相初始体积比为55∶45，洗脱至主峰出来后，逐渐增大有机相比例，优选的水相与有机相最终体积比达到25∶75并保持10分钟，完成恩格列净有关物质的测定。
在上述实施方案中，本发明的方法，所述梯度洗脱包括：0min至第18～24min时，流动相中水相与有机相的体积比为60∶40～50∶50；第18～24min至第48～54min时，水相与有机相的体积比匀速变化至30∶70～15∶85；第48～54min至第58～64min时水相与有机相的体积比保持比例不变。
在上述实施方案中，本发明的方法，优选的梯度洗脱包括：0min至第19.5min时，流动相中水相与有机相的体积比为55∶45；第19.5min至第50min时，水相与有机相的体积比匀速变化到25∶75；第50min至第60min时水相与有机相的体积保持比例25∶75不变。
在一具体实施方案中，本发明所说的用高效液相色谱分离测定恩格列净及其有关物质的方法，包括以下步骤：
（1）取恩格列净原料药或制剂，精密称定，加流动相适量使恩格列净溶解，再用流动相稀释制成每1ml中含恩格列净0.4～0.8mg的溶液，必要时滤过，作为供试品溶液；另精密称取恩格列净对照品适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中含0.6～1.2μg的溶液，作为对照品溶液；
（2）取供试品溶液和对照品溶液各10～30μl，注入高效液相色谱仪，进行梯度洗脱，色谱条件如下：选择以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂或苯基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以磷酸溶液(取纯化水，用磷酸调pH值至2～6)或磷酸盐缓冲液(如0.002mol/L磷酸二氢钠溶液，用磷酸调pH值至2～6)作为流动相水相,以甲醇和乙腈混合溶液作为流动相有机相，进行梯度洗脱，柱温为：20～30℃；流速为0.8～1.2ml/min检测波长为200～250nm，梯度洗脱条件如下：0min至第18～24min时，流动相中水相与有机相的体积比为60∶40～50∶50；第18～24min至第48～54min时，水相与有机相的体积比匀速变化至30∶70～20∶80；第48～54min至第58～64min时水相与有机相的体积比保持比例不变，此时已完成有关物质测定，记录色谱图；
（3）为了连续进样，可以设置一段平衡色谱系统的过程，即第58～64min至第58.5～64.5min时, 水相与有机相的体积比匀速变化至初始比例，再保持10min完成平衡。
上述本发明所说的用高效液相色谱分离测定恩格列净及其有关物质的方法，优选的，包括以下步骤：
（1）取恩格列净原料药或制剂，精密称定，加流动相适量使溶解，再用流动相稀释制成每1ml中含恩格列净0.8mg的溶液，必要时滤过，作为供试品溶液；另精密称取恩格列净对照品适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中含1.2μg的溶液，作为对照品溶液。
（2）以辛烷基硅烷键合硅胶填充柱（ZORBAX Rx-C8，4.6×250mm，5µm）或者苯基硅烷键合硅胶填充柱（Generall-M PH，4.6×250mm，5µm）为色谱柱；以磷酸溶液(取纯化水，用磷酸调pH值至3.5)作为流动相的水相，以甲醇-乙腈（50:50）作为流动相的有机相，进行梯度洗脱；柱温为25℃；流速为1.0ml/min检测波长为224nm，梯度洗脱条件如下：0min至第19.5min时，流动相中水相与有机相的体积比为55∶45；第19.5min至第50min时，水相与有机相的体积比匀速变化到25∶75；第50min至第60min时水相与有机相的体积保持比例25∶75不变，记录色谱图。
上述本发明的方法，所述“0min至第18～24min”表示：从0min开始，到第18～24min中任意时刻为止（将此时刻记为时刻A）；“第18～24min至第48～54min时，水相与有机相的体积比匀速变化至30∶70～20∶80”表示：从选择的第18～24min中的时刻A开始，到第48～54min中的任意时刻为止（将此时刻记为时刻B），在时刻B，经过梯度变化，动相中水相与有机相的体积比变为30∶70～20∶80范围内的任意比例。关于梯度时间的表述以此类推。
上述本发明的方法，按不加校正因子的主成分对照品法以峰面积计算恩格列净中各单一杂质含量及有关物质总量。
本发明的方法，有益效果或优势在于：
①专属性强，杂质之间不会相互干扰，方法不但能够提供恩格列净有关物质总量的检测方法，还提供了单个杂质的检测结果；
②灵敏度高，本发明中恩格列净的最低检测浓度为0.017μg/ml，表明其能够保证检出微量的杂质；
③实用性强，在检测完有关物质之后设计有平衡色谱系统过程，可以避免大量连续进样带来的基线噪音大、梯度系统峰多等不利影响，保证了检测结果能够良好重现；
④耐用性好，选用本发明中提到的不同类型色谱柱，或者将色谱条件中流动相pH值、流动相比例、流速、柱温、波长等参数在本发明所述范围内波动，不会对检测结果产生显著影响。
总之，本发明的分离测定恩格列净及其有关物质的方法，可以实现恩格列净与其有关物质的有效分离和分析，恩格列净峰及杂质峰峰形对称、理论板数高，各杂质刚好能够完全分离；采用合适的梯度洗脱能够保证较小的基线噪音，也能使与恩格列净极性差异较大的杂质全部洗脱，同时还避免了分析用时过长。因此，本发明的方法拥有较好的专属性、灵敏度和准确度等优点。
附图说明
图1：溶剂空白的高效液相色谱图；
图2：恩格列净原料药供试品溶液的高效液相色谱图；
图3：恩格列净原料药粗品供试品溶液的高效液相色谱图；
图4：不含恩格列净仅含辅料成分的组合物供试品溶液的高效液相色谱图；
图5：含恩格列净的药物组合物供试品溶液的高效液相色谱图；
图6：恩格列净原料药酸降解供试品溶液的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
仪器与条件
高效液相色谱仪：Agilent 1260；
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（ZORBAX Rx-C8，4.6×250mm，5µm）；
流动相A：磷酸溶液，取纯化水，用磷酸调节pH值为3.5，流动相B：甲醇-乙腈（50∶50V/V）；
按梯度洗脱表1洗脱（60min后为冲柱平衡系统阶段）
时间（min） 流动相A(%) 流动相B(%)
0 55 45
19.5 55 45
50 25 75
60 25 75
60.5 55 45
70 55 45
进样体积：20μl；
流速：1ml/min；
柱温：25℃；
检测波长：224nm。
实验步骤
取恩格列净原料药约20mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取溶剂（流动相）和供试品溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，见图1、图2。结果表明溶剂不干扰恩格列净及其有关物质的检测，恩格列净与其杂质能良好分离，方法专属性好。
实施例2
仪器与条件
高效液相色谱仪：Agilent 1260；
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（ZORBAX Rx-C8，4.6×250mm，5µm）；
流动相A：磷酸溶液，取纯化水，用磷酸调节pH值为3.5，流动相B：甲醇-乙腈（50∶50）；
按梯度洗脱表（见表2）洗脱（60min后为冲柱平衡系统阶段）。
表2
时间（min） 流动相A(%) 流动相B(%)
0 55 45
19.5 55 45
50 25 75
60 25 75
60.5 55 45
70 55 45
进样体积：20μl；
流速：1ml/min；
柱温：25℃。
实验步骤
取恩格列净原料药粗品约20mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取供试品溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，分别以224nm和210nm作为检测波长，记录色谱图，见图3。测试结果表明检测波长在224nm和210nm时，恩格列净粗品中带入的合成中间体、副反应产物都能被检测到，恩格列净与其杂质能良好分离，方法专属性好。
实施例3
仪器与条件
高效液相色谱仪：Agilent 1260；
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（ZORBAX Rx-C8，4.6×250mm，5µm）；
一组流动相A：磷酸溶液，取纯化水，用磷酸调节pH值为2.0，另一组流动相A：磷酸溶液，取纯化水，用磷酸调节pH值为6.0，流动相B：甲醇-乙腈（50∶50）；两组流动相A分别与流动相B组合按梯度洗脱表（见表3）各洗脱一次（60min后为冲柱平衡系统阶段）。
表3
时间（min） 流动相A(%) 流动相B(%)
0 55 45
19.5 55 45
50 25 75
60 25 75
60.5 55 45
70 55 45
进样体积：20μl；
流速：1ml/min；
柱温：25℃；
波长：224nm。
实验步骤
取恩格列净原料药粗品约20mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取供试品溶液，以pH值2.0流动相A、pH值6.0流动相A分别与流动相B组合，在上述色谱条件下分别进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果表明pH值2.0和6.0流动相与pH值3.5的检测的结果基本一致，本方法流动相的pH值适用范围广。
实施例4
仪器与条件
高效液相色谱仪：Agilent 1260；
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（ZORBAX Rx-C8，4.6×250mm，5µm）；
流动相A：磷酸盐溶液，0.002mol/L NaH2PO4溶液，用磷酸调节pH值为3.5，流动相B：甲醇-乙腈（50∶50）；
按梯度洗脱表（见表4）洗脱（60min后为冲柱平衡系统阶段）
表4
时间（min） 流动相A(%) 流动相B(%)
0 55 45
19.5 55 45
50 25 75
60 25 75
60.5 55 45
70 55 45
进样体积：20μl；
流速：1ml/min；
柱温：25℃；
波长：224nm。
实验步骤
取恩格列净原料药粗品约20mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加流动相溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取供试品溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果表明磷酸盐溶液作流动相的检测效果与磷酸溶液作流动相时基本一致。
实施例5
仪器与条件
高效液相色谱仪：Agilent 1260；
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（ZORBAX Rx-C8，4.6×250mm，5µm）；
流动相A：磷酸溶液，取纯化水，用磷酸调节pH值为3.5，流动相B：甲醇-乙腈（50∶50）；
按梯度洗脱表（见表5）洗脱（60min后为冲柱平衡系统阶段）。
表5
时间（min） 流动相A(%) 流动相B(%)
0 57 43
19.5 57 43
50 27 73
60 27 73
60.5 57 43
70 57 43
进样体积：20μl；
流速：1ml/min；
柱温：25℃；
波长：224nm。
实验步骤
取恩格列净原料药粗品约20mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取供试品溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果表明适度减小流动相中有机相的初始比例，不会影响本方法的检测结果。
实施例6
仪器与条件
高效液相色谱仪：Agilent 1260；
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（ZORBAX Rx-C8，4.6×250mm，5µm）；
流动相A：磷酸溶液，取纯化水，用磷酸调节pH值为3.5，流动相B：甲醇-乙腈（50∶50）；
按梯度洗脱表（见表6）洗脱（60min后为冲柱平衡系统阶段）。
表6
时间（min） 流动相A(%) 流动相B(%)
0 53 47
19.5 53 47
50 23 77
60 23 77
60.5 53 47
70 53 47
进样体积：20μl；
流速：1ml/min；
柱温：25℃；
波长：224nm。
实验步骤
取恩格列净原料药约20mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取供试品溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果表明适度增加流动相中有机相的初始比例和终止比例，不会影响本方法的检测结果。
实施例7
仪器与条件
高效液相色谱仪：Agilent 1260；
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（Generall-M PH，4.6×250mm，5µm）；
流动相A：磷酸溶液，取纯化水，用磷酸调节pH值为3.5，流动相B：甲醇-乙腈（50∶50）；
按梯度洗脱表（见表7）洗脱（60min后为冲柱平衡系统阶段）。
表7
时间（min） 流动相A(%) 流动相B(%)
0 55 45
19.5 55 45
50 25 75
60 25 75
60.5 55 45
70 55 45
进样体积：20μl；
流速：1ml/min；
柱温：25℃；
波长：224nm。
实验步骤
取恩格列净原料药约20mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取供试品溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果表明采用苯基硅烷键合硅胶填充柱的检测效果与采用辛烷基硅烷键合硅胶填充柱时基本一致。
实施例8
仪器与条件
高效液相色谱仪：Agilent 1260；
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（ZORBAX Rx-C8，4.6×250mm，5µm）；
流动相A：磷酸溶液，取纯化水，用磷酸调节pH值为3.5，流动相B：甲醇-乙腈（50∶50）；
按梯度洗脱表（见表8）洗脱（60min后为冲柱平衡系统阶段）。
表8
时间（min） 流动相A(%) 流动相B(%)
0 55 45
19.5 55 45
50 25 75
60 25 75
60.5 55 45
70 55 45
进样体积：20μl；
流速：1ml/min；
柱温：25℃；
波长：224nm。
实验步骤
取恩格列净药物组合物适量，含恩格列净20mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加流动相适量，超声10分钟，使恩格列净完全溶解，再稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取等量的不含恩格列净只含辅料的组合物，精密称定，置25ml容量瓶中，加溶剂流动相超声10分钟，再稀释至刻度，摇匀，作为空白溶液。取空白溶液和供试品溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，见图5、图6。结果表明辅料组合物不干扰恩格列净及其有关物质的检测，方法专属性好。
实施例9
仪器与条件
高效液相色谱仪：Agilent 1260；
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（ZORBAX Rx-C8，4.6×250mm，5µm）；
流动相A：磷酸溶液，取纯化水，用磷酸调节pH值为3.5，流动相B：甲醇-乙腈（50∶50）；
按梯度洗脱表（见表9）洗脱（60min后为冲柱平衡系统阶段）。
表9
时间（min） 流动相A(%) 流动相B(%)
0 55 45
19.5 55 45
50 25 75
60 25 75
60.5 55 45
70 55 45
进样体积：20μl；
流速：1ml/min；
柱温：25℃；
波长：224nm。
实验步骤
取恩格列净原料药约20mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加入1mol/L盐酸溶液3ml和甲醇-乙腈（50∶50）3ml，室温静置24h，用氢氧化钠溶液中和并放冷，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为酸降解供试品溶液。
取恩格列净原料药约20mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加入1mol/L氢氧化钠溶液3ml和甲醇-乙腈（50∶50）3ml，室温静置24h，用盐酸溶液中和并放冷，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为碱降解供试品溶液。
取恩格列净原料药约20mg，精密称定，置25ml容量瓶中，于105℃加热30h，放冷，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为热降解供试品溶液。
取恩格列净原料药约20mg，精密称定，置25ml白玻容量瓶中，于4500Lx±500Lx，25℃条件照射48h，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为光降解供试品溶液。
取恩格列净原料药约20mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加10%H2O2溶液3ml和乙腈3ml，室温静置24h，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为氧降解供试品溶液。
取各供试品溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果表明在部分条件下（酸、碱、热、氧）恩格列净较易降解，降解产生的一系列有关物质都能被分离检测到，恩格列净与其杂质能良好分离，方法专属性好。
实施例10
仪器与条件
高效液相色谱仪：Agilent 1260；
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（ZORBAX Rx-C8，4.6×250mm，5µm）；
流动相A：磷酸溶液，取纯化水，用磷酸调节pH值为3.5，流动相B：甲醇-乙腈（50∶50）；
按梯度洗脱表（见表10）洗脱（60min后为冲柱平衡系统阶段）。
表10
时间（min） 流动相A(%) 流动相B(%)
0 55 45
19.5 55 45
50 25 75
60 25 75
60.5 55 45
70 55 45
进样体积：20μl；
流速：1ml/min；
柱温：25℃；
波长：224nm。
实验步骤
取恩格列净原料药粗品约20mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取供试品溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，另将流动相比例、流速、柱温等色谱仪参数在一定范围内变动，进行单因素考察，具体色谱条件见表12、结果见表13。结果表明色谱参数在一定范围内变动时，恩格列净有关物质的检出结果基本稳定，恩格列净主峰理论板数仍高，恩格列净与其杂质分离度均高于1.5，方法耐用性好。
表12、恩格列净有关物质测定耐用性考察色谱条件
考察因素 A B C D E F G
流动相pH值 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5
水相-有机相初始比例 55∶45 53∶47 57∶43 55∶45 55∶45 55∶45 55∶45
水相-有机相终止比例a 25∶75 23∶77 27∶73 25∶75 25∶75 25∶75 25∶75
流速（ml/min） 1.0 1.0 1.0 0.9 1.1 1.0 1.0
柱温（℃） 25 25 25 25 25 20 30
波长（nm） 210 210 210 210 210 210 210
a：水相-有机相终止比例指保证杂质全部洗脱时的比例，不涉及冲柱和平衡系统时的比例。
表13、不同色谱条件下恩格列净有关物质测定结果
考察因素 A B C D E F G
总有关物质（%） 1.17 1.19 1.20 1.14 1.17 1.15 1.18
最大单个杂质（%） 0.18 0.19 0.18 0.18 0.18 0.19 0.18
主峰与相邻杂质分离度 3.81 4.14 3.46 3.84 3.58 3.80 3.73
主峰理论板数b 13395 13783 12407 13681 12240 12594 13499
b：主峰指恩格列净峰
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种用高效液相色谱法分离测定恩格列净及其有关物质的方法，包括以辛烷基硅烷键合硅胶填料柱或苯基硅烷键合硅胶填料柱为色谱柱，流动相由有机相和水相组成，所述有机相为甲醇和乙腈混合溶液,水相为磷酸溶液或磷酸盐缓冲液，所述磷酸溶液或磷酸盐缓冲液的pH值为2～6，进行梯度洗脱，以紫外检测器进行检测，其中，所述梯度洗脱包括水相与有机相的洗脱初始体积比为65∶35～45∶55，水相与有机相的洗脱终止体积比为35∶65～15∶85。
2.根据权利要求1所述的方法，所述磷酸溶液或磷酸盐缓冲液的pH值为3.5。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述磷酸盐选自磷酸二氢钠、磷酸二氢钾和磷酸二氢铵。
4.根据权利要求1或2所述的方法，水相中磷酸盐浓度为：0～0.005mol/L。
5.根据权利要求1所述的方法，有机相中，甲醇与乙腈的体积比为50：50。
6.根据权利要求1所述的方法，所述梯度洗脱包括：0min至第18～24min时，流动相中水相与有机相的体积比为60∶40～50∶50；第18～24min至第48～54min时，水相与有机相的体积比匀速变化至30∶70～20∶80；第48～54min至第58～64min时水相与有机相的体积比保持比例不变。
7.根据权利要求7所述的方法，所述梯度洗脱包括：0min至第19.5min时，流动相中水相与有机相的体积比为55∶45；第19.5min至第50min时，水相与有机相的体积比匀速变化到25∶75；第50min至第60min时水相与有机相的体积保持比例25∶75不变。
8.根据权利要求1所述的方法，进一步包括以下步骤：
（1）取恩格列净原料药或其药物组合物，加流动相使恩格列净完全溶解并稀释定容，配制成每1ml溶液中含恩格列净0.4～0.8mg，滤过，作为供试品溶液；
（2）以辛烷基硅烷键合硅胶填料柱或苯基硅烷键合硅胶填料柱为色谱柱，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为20～30℃，波长为200～250nm；
（3）取供试品溶液10～30μl，注入高效液相色谱仪；
（4）将水相pH2～6的磷酸溶液或磷酸盐缓冲液与有机相甲醇、乙腈等以65∶35～45∶55为初始体积比洗脱至主峰出来后，逐渐增大有机相比例，至水相与有机相的体积比达到 35∶65～15∶85并保持不少于10分钟，完成恩格列净有关物质的测定；
（5）采用不加校正因子的主成分对照品法以峰面积计算恩格列净的纯度及有关物质中各单一杂质含量及有关物质总量。
9.根据权利要求9所述的方法，步骤（1）中，每1ml溶液中含恩格列净0.8mg，或步骤（2）中流速为1.0ml/min，柱温为25℃，波长为224nm，或步骤（3）中，取供试品溶液20μl，或步骤（4）中水相为pH3.5的磷酸溶液或磷酸盐缓冲液，水相与有机相的初始体积比为55∶45，洗脱至主峰出来后，逐渐增大有机相比例，至水相与有机相的体积比达到25∶75。
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