CN104614468B - 一种用高效液相色谱法分离咪达那新及其有关物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属分析化学领域，本发明公开了一种用液相色谱法分离测定咪达那新及其有关物质的方法，该方法以苯基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以一定比例的缓冲盐溶液‑有机相为流动相，可以定量测定咪达那新及其有关物质的含量，从而有效控制咪达那新的质量。本发明方法专属性强，准确度高，操作简便。

Description

一种用高效液相色谱法分离咪达那新及其有关物质的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及液相色谱分离测定咪达那新及其有关物质的方法。

背景技术

咪达那新是一种新型高效抗胆碱药，具有二苯基丁酰胺结构，用于膀胱过度活动症的治疗。咪达那新的英文名是imidafenacin，化学名为4-（4-甲基-1H-咪唑-1-基）-2,2-二苯丁酰胺（4-(2-methyl-1H-imidazol-1-yl)-2,2-dipheybutanamide），分子式为C₂₀H₂₁N₃O，咪达那新结构式为：

人体内分布着不同亚型的毒蕈碱型受体（M受体），在不同部位发挥着不同的生理作用。在膀胱组织中主要分布着M1、M2和M3受体。膀胱过度活动症（Overactive Bladder,OAB）是一种以尿急症状为特征的症候群，常伴有尿频和液尿症状，可伴或不伴有急迫性尿失禁。逼尿肌不稳定是引发膀胱过度活动症的重要原因之一。咪达那新选择性作用于M3和M1受体，阻断胆碱对逼尿肌的收缩的收缩作用，令逼尿肌松弛，可显著改善膀胱过度活动症所引起的尿急、尿频、尿禁等症状。咪达那新具有抑制膀胱平滑肌收缩和抑制乙酰胆碱游离双重作用，而对脑组织中胆碱受体亲和力较低，中枢和外周不良反应较少；咪达那新对膀胱的选择性也强于唾液腺，具有较大的优势。

在生产咪达那新的工艺生产过程中，有些重要的中间体可能会去除不完全，从而影响药物纯度和质量。本实验中我们主要对生产咪达那新过程中引入的以下有关物质进行了研究。咪达那新需要控制的有关物质有5个，分别是有关物质1 （4-Bromo-2,2-diphenyl-butyronitrile）、有关物质2 （2-Methyl-1H-imidazole）、有关物质3 （4-(2-Methyl-imidazol-1-yl)-2,2-diphenyl-butyronitrile）、有关物质4 （4-(2-Methyl-imidazol-1-yl)-2,2-diphenyl-butyric acid）、有关物质5（4-Hydroxy-2,2-diphenyl-butyronitrile），结构式分别为：

对于咪达那新工艺生产过程中引入的有关物质，在原料药中是需要进行质量控制的，因此，实现咪达那新及其有关物质的分离，在咪达那新原料药质量控制方面具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分析咪达那新纯度以及分离其有关物质的方法，从而实现咪达那新与其有关物质的分离和测定，从而保证咪达那新的纯度，实现其终产品原料药的质量控制。

本发明所述的用液相色谱法分析咪达那新的纯度以及分离其有关物质的方法，是采用苯基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以一定比例的缓冲盐溶液-有机相为流动相。

上述所说的色谱柱以苯基硅烷键合硅胶为填料，选自Ultimate、Kromasil和Apollo等品牌的苯基柱。

上述所说的有机相选自以下化合物：甲醇、乙腈、丙醇、异丙醇，优选乙腈。

上述所说的方法，其流动相缓冲盐溶液-有机相采用梯度洗脱。

上述所说的方法中，缓冲盐溶液选自磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐，优选磷酸盐。

其中缓冲盐溶液的浓度为0.01～0.1mol/L，优选浓度为0.02mol/L。

本发明所述的分离测定方法，可按照以下方法实现：

1) 取咪达那新样品适量，用乙腈或流动相溶解样品，配制成每1mL含咪达那新0.1～1.5mg的样品溶液。

2) 设置流动相流速为0.5～1.5mL/min，流动相流速优选1.0mL/min，检测波长为210～250nm，检测波长优选210nm，柱温箱温度为20～50℃，柱温箱温度优选30℃。

3) 取1)的样品溶液10～50μL，注入液相色谱仪，完成咪达那新与其杂质的分离测定。其中：

高效液相色谱仪的型号，无特别要求，本发明采用的色谱仪为岛津：LC-20AT，CBM-20A，SIL-20AC，SPD-M20A，CTO-10ASvp

色谱柱：Phenyl（Ultimate，250mm×4.6mm，5µm）

流动相A：0.02mol/L磷酸氢二钾缓冲溶液（pH 7.0）；

B：乙腈

采用梯度洗脱：

T（min）	0	5	55	56	65
						B（%）	30	30	75	30	30

流速：1.0mL/min

检测波长：210nm

柱温：30℃

进样体积：10μL

本发明采用Phenyl（Ultimate，250mm×4.6mm，5µm），能够有效的分离咪达那新及其有关物质。本发明解决了咪达那新及其有关物质的分离测定问题，从而确保了咪达那新原料药的质量可控。

附图说明

图1为实施例1时溶剂HPLC图；

图2为实施例1时咪达那新及其有关物质HPLC图；

图3为实施例1时咪达那新HPLC图；

图4为实施例2时咪达那新及其有关物质HPLC图；

图5为实施例2时咪达那新HPLC图；

图6为实施例3时咪达那新及其有关物质HPLC图；

图7为实施例3时咪达那新HPLC图。

具体实施方式：

以下通过实例形式，对本发明涉及的咪达那新的含量测定及其有关物质检测方法作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

仪器与条件

高效液相色谱仪：岛津：LC-20AT，CBM-20A，SIL-20AC，SPD-M20A，CTO-10ASvp；

色谱柱：C₁₈（ES，250×4.6mm，5μm）

流动相A：0.02mol/L磷酸氢二钾（pH 7.0）

B：乙腈

采用浓度梯度洗脱：

T(min)	0	25	40	50	60	75	76	85
									B%	30	30	60	60	70	70	30	30

流速：1.0mL/min

检测波长：210nm

柱温：30℃

进样体积：10μL

实验步骤：

取咪达那新及其有关物质适量，分别用乙腈溶解样品，配制成含咪达那新及其有关物质约0.5mg/mL的样品溶液；另取乙腈适量作为空白溶剂。按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图1~3，图1为溶剂色谱图；图2中保留时间21.712min的色谱峰为咪达那新，其余色谱峰为咪达那新各有关物质的色谱峰；图3中保留时间21.887min的色谱峰为咪达那新。

实施例2

仪器与条件

高效液相色谱仪：岛津：LC-20AT，CBM-20A，SIL-20AC，SPD-M20A，CTO-10ASvp；

色谱柱：C₁₈（ES，250×4.6mm，5μm）

流动相A：0.02mol/L磷酸氢二钾（pH 7.0）

B：乙腈

采用浓度梯度洗脱：

T(min)	0	5	55	65	75
						B%	30	30	75	30	30

流速：1.0mL/min

检测波长：210nm

柱温：30℃

进样体积：10μL

实验步骤：

取咪达那新及其有关物质适量，分别用乙腈溶解样品，配制成含咪达那新及其有关物质约0.5mg/mL的样品溶液；另取乙腈适量作为空白溶剂。按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图4~5，图4中保留时间17.333min的色谱峰为咪达那新，其余色谱峰为咪达那新各有关物质的色谱峰；图5中保留时间17.391min的色谱峰为咪达那新。

实施例3

仪器与条件

色谱柱：Phenyl（Ultimate，250×4.6mm，5μm）

流动相A：0.02mol/L磷酸氢二钾（pH 7.0）

B：乙腈

采用浓度梯度洗脱：

T（min）	0	5	55	56	65
						B（%）	30	30	75	30	30

检测波长：210nm

柱温：30℃

进样体积：10μL

实验步骤：

取咪达那新及其有关物质适量，分别用乙腈溶解样品，配制成含咪达那新及其有关物质约0.5mg/mL的样品溶液；另取乙腈适量作为空白溶剂。按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图6~7，图6中保留时间20.805min的色谱峰为咪达那新，其余色谱峰为咪达那新各有关物质的色谱峰；图7中保留时间20.410min的色谱峰为咪达那新。

对有关物质检测方法的以下项目进行了验证：

1、系统适用性实验

在上述确定的色谱条件下，再分别用咪达那新有关物质1 （4-Bromo-2,2-diphenyl-butyronitrile）、有关物质2 （2-Methyl-1H-imidazole）、有关物质3 （4-(2-Methyl-imidazol-1-yl)-2,2-diphenyl-butyronitrile）、有关物质4 （4-(2-Methyl-imidazol-1-yl)-2,2-diphenyl-butyric acid）、有关物质5（4-Hydroxy-2,2-diphenyl-butyronitrile）的混合物来分析此色谱条件是否符合要求。由图6可见此条件下各个有关物质与主峰之间分离度符合要求，峰纯度和单点阀值均符合要求。

2、专属性

取本品适量，分别于各苛性条件下进行破坏，考察破坏产物与主成分峰的分离情况。

酸破坏：取本品适量（约含咪达那新5mg），精密称定，置10mL量瓶中，加1mol/L盐酸溶液1ml，80℃放置5h，加1mol/L氢氧化钠溶液中和至中性，加溶剂超声使溶解，定容至刻度，摇匀。

碱破坏：取本品适量（约含咪达那新5mg），精密称定，置10mL量瓶中，加1mol/L氢氧化钠溶液1ml，80℃放置5h，用1mol/L盐酸溶液中和至中性，加溶剂超声使溶解，定容至刻度，摇匀。

氧化破坏：取本品适量（约含咪达那新5mg），精密称定，置10mL量瓶中，加10%双氧水1ml，室温避光放置放置2h，加溶剂超声使溶解，定容至刻度，摇匀。

高温破坏：取本品适量（约含咪达那新5mg），精密称定，置坩埚中，在105℃烘箱中放置4天，转移置10mL量瓶中，加溶剂超声使溶解，定容至刻度，摇匀。

光照破坏：取本品适量（约含咪达那新5mg），精密称定，置10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。在4500±500LUX光照强度下放置10天。

取各破坏条件下的样品，照有关物质的液相条件进样，记录色谱，结果可见，本品于各破坏条件下生成的杂质均能与主成分峰分离良好。本品在各破坏条件下所生成的杂质均不大，且降解的杂质峰均在检测波长210nm附近有较大吸收。

3、进样重复性试验

将咪达那新与其各有关物质的混合物，按上述色谱条件，重复进样5次，考察测定方法的重复性。由结果可知，该方法重复性良好

。

4、溶液稳定性

取本品有关物质测定的供试液，分别于0、4、8、10、12小时进样，考察本品含量测定时溶液的稳定性，由结果可见，本溶液于12小时内稳定

。

5、耐用性

由于本品的色谱条件为梯度洗脱，并规定了相应的色谱柱型号、柱温、流速、pH值等，故我们将这些条件作相应的微调，考察方法的耐用性。结果发现，该方法对不同的色谱柱、柱温、流速、pH值等耐用性良好。在不同品牌色谱柱、不同柱温、流速、pH值等条件下，咪达那新及其有关物质保留时间无显著变化，且均能达到有效分离。

Claims (4)

1.一种液相色谱分离测定咪达那新及其有关物质的方法，其特征在于：方法分离测定的咪达那新有关物质主要有：

4-Bromo-2,2-diphenyl-butyronitrile，有关物质1

2-Methyl-1<i>H</i>-imidazole，有关物质2

4-(2-Methyl-imidazol-1-yl)-2,2-diphenyl-butyronitrile，有关物质3

4-(2-Methyl-imidazol-1-yl)-2,2-diphenyl-butyric acid，有关物质4

4-Hydroxy-2,2-diphenyl-butyronitrile，有关物质5

采用如下色谱条件完成咪达那新及其有关物质的测定：

色谱柱填料为苯基硅烷键合硅胶；流动相：A：0.02mol/L磷酸氢二钾缓冲溶液，pH7.0；B：乙腈；洗脱梯度为

T(min) 0 5 55 56 65 B% 30 30 75 30 30

。

2.根据权利要求1所述的分离测定方法，色谱柱选自Ultimate、Kromasil和Apollo品牌。

3.根据权利要求1所述的分离测定方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

1）取咪达那新样品适量，分别用甲醇或乙腈溶解样品，配制成每1mL含咪达那新及其有关物质0.1~1.5mg的样品溶液；

2）设置流动相流速为0.5~1.5mL/min，检测波长为205~250nm，色谱柱柱温箱温度为20~40℃；

3）取1）的样品溶液10~50μL，注入液相色谱仪，完成咪达那新及其有关物质的分离测定。

4.根据权利要求3所述的分离分析方法，步骤2）所说的流动相流速优选1.0mL/min，检测波长优选210nm，色谱柱柱温箱温度优选30℃。

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