CN111956871B - 一种丝蛋白/明胶复合材料及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丝蛋白/明胶复合材料，其通过包括下述步骤的方法制备：将桑蚕茧浸入皂盐溶液中脱胶、烘干制成脱胶丝，脱胶丝再经溴化锂溶液溶解、透析脱盐、浓缩制成丝蛋白溶液；将丝蛋白溶液与明胶溶液混合，加入辣根过氧化物酶、过氧化氢溶液及谷氨酰胺转氨酶，混匀后成胶，得到丝蛋白/明胶凝胶；将丝蛋白/明胶凝胶分别置于酒精、硫酸铵溶液中浸泡，得到丝蛋白/明胶交联凝胶，烘干即得。该丝蛋白/明胶复合材料能够用于制备创伤骨科、颌面整形外科中使用的内固定系统，具有较高的工业化生产和临床应用前景。

Description

一种丝蛋白/明胶复合材料及其用途

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，涉及一种丝蛋白/明胶复合材料及其在制备内固定系统中的用途。

背景技术

目前金属材料的内固定系统仍然是骨修复领域的金标准，这类材料具有良好的强度和可塑性，利于加工成型。同时在人体内不易腐蚀，可在体内长时间稳定存在。然而传统金属材料与人体骨组织的弹性模量相差很大，植入后产生应力遮挡效应，影响骨愈合过程或导致骨质疏松，此外还可有异物感和温度过敏等问题。而且其需要在骨愈合后二次手术取出，增加了病人的手术风险和经济负担。随着可降解高分子材料和生物陶瓷材料的长足发展，一些可降解的内固定系统逐渐得到开发并商品化。但现有的高分子骨钉的力学强度普遍比较低，临床使用时常出现断钉情况，同时其降解产物大多为酸性，会对周围组织产生刺激，引发可无菌性炎症；羟基磷灰石等生物活性陶瓷材料的强度低、脆性大，多制成支架用于骨缺损的修复，但不能制造成螺钉内固定系统使用。

为了开发适合于制备内固定系统的可降解高分子生物材料，天然桑蚕茧来源的丝蛋白(或称丝素蛋白)成为了研究热点。丝蛋白作为一种天然生物蛋白材料，具有良好的生物相容性、易于获得、溶胀性好和天然抗菌性等优点。国外已有文献报道应用丝蛋白制成钉-板骨内固定系统，在动物实验中证实其具有良好的生物相容性。但由于纯丝蛋白材料降解速率较慢，且与其他蛋白如胶原、明胶等相比，由于缺少生物活性肽段，因而对细胞生长的生物学功能促进较弱。

明胶是通过热变性、物理变性或化学降解破坏胶原蛋白三螺旋结构而得到的单链大分子，其降解速率较快并易于控制，产物无毒性；且因其含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，故具有良好的促细胞粘附、分化和生长的生物学活性。正是基于丝蛋白和明胶特点两者互补的优势，丝蛋白/明胶复合材料的研究得到了较多的关注。但明胶受热后的可逆构象转变性质及其较差的溶胀性能制约了其实际应用。已有的利用丝蛋白/明胶复合材料制备医用材料的研究多为支架、伤口敷料等。目前应用酶类、化学试剂和物理等交联方式对丝蛋白/明胶复合材料在生理情况下的热稳定性、体内溶胀和力学稳定性的解决方案得仍不理想。基于上述问题，目前国内外尚未见丝蛋白/明胶复合材料制备骨钉等内固定系统的报道。

发明内容

为了探索采用丝蛋白/明胶复合材料制备内固定系统的可行性，发明人尝试了对于现有的丝蛋白/明胶复合材料进行改性的研究，克服两者本身缺陷造成的技术障碍，从而提供了一种全新的丝蛋白/明胶复合材料，使其适合于制备骨钉和骨板等内固定系统。具体而言，本发明包括如下技术方案。

一种丝蛋白/明胶复合材料，其特征在于，通过包括下述步骤的方法制备：

1)将天然桑蚕茧浸入皂盐溶液中脱胶、烘干制成脱胶丝，脱胶丝再经溴化锂溶液溶解、透析脱盐、浓缩制成大约10％wt的再生丝蛋白(RSF)溶液；

2)将步骤1)中所得的丝蛋白溶液与大约30％wt明胶溶液按体积比9：1左右混合，再加入辣根过氧化物酶、过氧化氢溶液及谷氨酰胺转氨酶，混匀后成胶，得到丝蛋白/明胶凝胶。

3)将步骤2)中所得的丝蛋白/明胶凝胶置于60-80％乙醇水溶液中浸泡24-36小时，诱导丝蛋白形成较小和均一的β折叠，再浸泡于硫酸铵溶液中8-20小时比如12小时左右，以进一步加强明胶支链的交联，得到丝蛋白/明胶交联凝胶，其为高强度的水凝胶；

4)将步骤3)中所得的丝蛋白/明胶交联凝胶烘干，即得到丝蛋白/明胶复合材料。

上述步骤1)中的皂盐可以是碳酸钠或者碳酸氢钠。

当皂盐可是碳酸钠时，碳酸钠水溶液的浓度为0.2-1％、优选0.3-0.9％、更优选0.4-0.8％、比如大约0.5％。当皂盐是碳酸氢钠时，碳酸氢钠水溶液的浓度为为0.5-1％、优选0.6-0.9％、更优选0.7-0.8％、比如大约0.5％。

上述步骤1)中的溴化锂溶液浓度为0.5-1.2％、优选0.6-1.1％、更优选0.7-1.0％、比如大约0.8-0.9％。

上述步骤1)中，蚕茧与溴化锂溶液的质量比可以是1:10左右。

上述步骤2)中辣根过氧化物酶的用量为600-1500U/mL、优选700-1300U/mL、更优选800-1000U/mL、比如大约900U/mL。过氧化氢溶液浓度可以是30％，用量为0.2-1.0％v/v、优选0.3-0.8％v/v、比如大约0.5％v/v。谷氨酰胺转氨酶的用量为10000-50000U/mL、优选15000-35000U/mL、比如大约20000U/mL。

步骤2)中所述的成胶是在35-40℃、比如37℃下成胶。

上述步骤3)中所用的乙醇水溶液可以是70％酒精；所用的硫酸铵溶液浓度为10-20％、优选12-18％、更优选大约15％。

上述步骤4)是将丝蛋白/明胶交联凝胶置于恒温干燥箱37℃风干。

应理解，本文中在表述数值特征时，术语“大约”或者“左右”是指所表示的本数可以有±10％、±9％、±8％、±7％、±6％或±5％的误差范围或浮动范围。

经过上述步骤的处理，生物大分子丝蛋白和明胶的分子结构、分子大小和蛋白质分子的空间构象都发生了改变，形成了全新分子组成/结构的混合物，使其物理性质、化学性质和生理活性都发生了变化。

这种改性的丝蛋白/明胶复合材料适合用于制备内固定系统。

因此本发明的第二个方面提供了一种用于创伤骨科、颌面整形外科的内固定系统，其使用上述的丝蛋白/明胶复合材料制成。

上述的内固定系统包括骨钉和骨板。该骨钉是一种具有生物活性的高强度可吸收螺钉，主要用于创伤骨科、颌面整形外科中非承重部位骨折的钢板螺钉内固定，比如锁骨骨折，下颌骨骨折的内固定等。

在一种实施方式中，上述骨钉的螺钉拔出力(pull out strength)是适当的，例如对于螺杆直径2mm左右、螺杆长度5mm左右的骨钉，在干燥状态下为46.93±10.14N(牛顿)，在湿润状态下为26.07±3.04N(牛顿)。

优选地，上述骨钉具有适当的双剪强度(double shear strength)，例如对于螺杆直径2mm左右、螺杆长度5mm左右的骨钉，在干燥状态下258.7±23.89N(牛顿)，在湿润状态下191.40±11.47N(牛顿)。

上述由骨钉和骨板组成的内固定系统可以通过下述方法加工得到：将丝蛋白/明胶复合材料塑型成柱状或块状母胚，用车床加工，得到骨钉和骨板。

在一种实施方式中，上述加工例如是将丝蛋白/明胶复合材料塑型成柱状或块状母胚后，采用多轴数控加工车床加工制成骨钉和骨板。

加工后的骨钉和骨板可进一步用环氧乙烷气体消毒，无菌包装。

实验证明，本发明的丝蛋白/明胶复合材料制成的内固定系统力学强度高，不容易发生断钉，在植入患者体内后不影响骨愈合过程或导致骨质疏松，患者不会有异物感和温度过敏等问题，可被人体逐渐吸收降解，并且其降解产物不会对周围组织产生刺激而引发可无菌性炎症，因此能够有效促进细胞生长和组织康复，具有工业化生产和临床应用前景。

附图说明

图1是本发明制备丝蛋白/明胶复合材料并加工成可吸收螺钉的工艺流程示意图。

图2是本发明制备的丝蛋白/明胶复合螺钉的照片。

图3是本发明制备的丝蛋白/明胶复合螺钉进行体外拔出力力学测试的柱形图。其中“RSF”是再生丝蛋白、“RSF/G”是丝蛋白/明胶复合材料、“PLGA”是聚乳酸-羟基乙酸共聚物。

图4是本发明制备的丝蛋白/明胶复合螺钉进行体外剪切力力学测试的柱形图。其中“RSF”是再生丝蛋白、“RSF/G”丝蛋白/明胶复合材料、“PLGA”是聚乳酸-羟基乙酸共聚物。

具体实施方式

本发明提供的丝蛋白/明胶复合材料的原料都是天然生物材料。丝蛋白作为一种天然生物蛋白材料，具有良好的生物相容性、易于获得、溶胀性较好和天然抗菌性等特点。但由于纯丝蛋白材料降解速率较慢，且与其他蛋白例如胶原、明胶等相比，由于缺少生物活性肽段，其对细胞的生物学功能促进较弱。而单纯的明胶则易受热变性和吸水膨胀。本发明利用丝蛋白富含酪氨酸、明胶富含酪氨酸、谷氨酰胺和赖氨酸的特点，应用辣根过氧化物酶和双氧水使其中的酪氨酸氧化形成双酪氨酸交联、应用微生物谷氨酰转胺酶通过酰基转移反应，使明胶形成谷氨酰胺-赖氨酸异肽键并加用酒精溶剂诱导丝蛋白形成β折叠和硫酸铵溶液加强明胶支链修饰，多策略联合加强了丝蛋白明胶复合材料的稳定性和力学性能并赋予其良好的生物学功能。

本发明提供的丝蛋白/明胶复合材料是一种医用生物高分子材料，可以被容易地加工成可吸收骨钉(或称可降解螺钉)。在临床手术中使用时，配合传统骨科内固定植入器械，如骨钻、攻丝、测深器等，即可进行内固定植入术。

为描述方便起见，本文中有时将“丝蛋白/明胶复合螺钉”称为“可吸收复合螺钉”、“可吸收骨钉”、“可吸收螺钉”、“螺钉”或“骨钉”，它们表示相同的含义。类似地，“桑蚕茧”与“蚕茧”表示相同的含义。

为了评估将丝蛋白/明胶复合材料加工成可吸收螺钉的可行性，实施例中采用了聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid，简称PLGA)和再生丝蛋白(RSF)作为对比材料。PLGA是由两种单体-乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。再生丝蛋白又称再生丝素蛋白，是一种天然高分子材料，来源广泛且价格便宜，具有良好的生物相容性、降解性以及低炎症反应等优点。相比其他同类天然高分子，RSF的生物相容性更加优异，对骨折愈合的促进作用更显著。然而，虽然RSF支架材料在骨组织工程中表现出良好的应用前景，但将其应用于临床治疗仍存在一定的缺陷，如支架力学性能不够理想、骨诱导能力不强等。为使RSF适合于骨组织工程的需要，通常在其中添加无机增强填料，构建复合材料。

研究表明，本发明的丝蛋白/明胶复合材料的双剪强度(double shear strength)无论是在干燥状态下、还是在湿润状态下都高于PLGA和再生丝蛋白(RSF)，即机械性能更佳。

本发明采用丝蛋白/明胶复合材料制备的骨钉的拔出力(pull out strength)无论是在干燥状态下、还是在湿润状态下与PLGA和再生丝蛋白(RSF)都无明显差异，这可以满足手术操作比如锁骨骨折、下颌骨骨折的内固定临床手术操作的力学要求。

本发明具有如下几方面的优点：

1.本发明所使用的原料丝蛋白和明胶产量丰富、价格低廉且均为美国食品药品监督管理局认证的医用产品原材料，具有良好的生物相容性、生物学功能和生物降解性。

2.本发明所使用的辣根过氧化酶、过氧化氢、谷氨酰胺转氨酶均已实现商业化大规模生产。其中谷氨酰胺酶为微生物来源制得，较原有的哺乳动物来源，稳定性更均一且产量丰富。低浓度的辣根过氧化酶和过氧化氢无任何毒性，生物相容性好，已有实验和文献证明辣根过氧化物酶和谷氨酰胺转氨酶交联的丝蛋白和明胶水凝胶无细胞和动物毒性。

3.本发明应用辣根过氧化物酶/双氧水诱导丝蛋白自身和丝蛋白-明胶间的交联、应用谷氨酰胺转氨酶对明胶侧枝进行修饰，并将所得到的水凝胶依次浸泡于70％酒精溶液和15％硫酸铵溶液中进一步诱导小型且均一的丝蛋白β折叠的形成、加强明胶支链的修饰使得该复合材料在具备高强度和抗压性能的同时，获得了模拟体内和动物体内的稳定性。

4.本发明在已有的丝蛋白材料基础上，具备了加入明胶而改善的促细胞粘附、生长、分化的生物学功能。

5.本发明的制备方法简单高效，全程无废无污染，重复性好，具有工业化生产的潜在价值。

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的实施例中，如果对于实验操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温。

(10-30℃)。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指重量百分含量。

本文中涉及到的“溶液”除特别说明外，皆指水溶液。

实施例1丝蛋白/明胶复合材料的制备

参见图1，丝蛋白/明胶复合材料的制备包括如下工序：

1、将天然桑蚕茧用浓度为0.5％的碳酸钠水溶液进行脱胶、烘干制成脱胶丝；再按蚕茧：溴化锂溶液的质量比1:10用浓度为0.8％的溴化锂溶液溶解、透析脱盐、浓缩制成10％wt的再生丝蛋白溶液。

2、将步骤1中所得的丝蛋白溶液9mL和30％wt明胶溶液1mL混合，再加入900U/mL的辣根过氧化物酶和0.5％v/v过氧化氢溶液(浓度30％)及20000U/mL的谷氨酰胺转氨酶，混匀后37℃水浴下成胶。

3、将步骤2中所得丝蛋白/明胶凝胶置于70％酒精中浸泡24-36小时，再浸泡于15％硫酸铵溶液中12小时，得到丝蛋白/明胶交联凝胶。

4、将步骤3中所得的得到丝蛋白/明胶交联凝胶经超纯水清洗、去掉残留溶剂后，置于恒温干燥箱37℃风干，即得到丝蛋白/明胶复合材料。

实施例2骨钉和骨板的加工

将实施例1中得到的丝蛋白/明胶复合材料加工成柱状或块状母胚，再采用多轴数控加工车床加工制成骨钉和骨板，得到由可降解丝蛋白/明胶复合骨钉和骨板组成的内固定系统。图2示出了骨钉照片，其为丝蛋白/明胶复合螺钉。该骨钉的尺寸为：螺杆直径2mm，螺杆长度5mm，尾帽直径3.6mm。

作为对比，分别以再生丝蛋白(RSF)材料和PLGA为原料采用多轴数控加工车床加工制成相同尺寸的螺钉。

实施例3螺钉体外拔出力力学测试

对于实施例2得到的丝蛋白/明胶复合螺钉(RSF/G)、再生丝蛋白螺钉(RSF)和PLGA螺钉，按照下述方法分别测试在干燥状态、和湿润状态下的拔出力。

根据美国材料与试验学会(American Society for Testing and Materials，ASTM)标准F1839，使用Instron 5966(Instron,美国)万能力学仪，定制的螺钉尾帽不锈钢夹持器和人造骨块(Sawbones，美国)对RSF/G，RSFRSF/G和PLGA螺钉的拔出力强度进行了测试。人造骨块预先嵌入骨水泥中，固定在Instron 5966测试框架的底部，并用钻头(直径1.7mm)钻孔。将RSF/G和RSF螺钉拧入人造骨块中，然后用夹持器夹住螺钉尾帽后连接Instron力学仪。使用力学仪将螺钉逐渐从人造骨块中拉出，以5.0mm/min的恒定速度直到螺钉拔出或者断裂(ASTM标准F2502-11)。当螺钉被拉出或断裂时，记录最大应力(单位：N)。在干燥和湿润状态下分别进行拔出力学测试，湿润状态是通过在37℃的PBS溶液中浸泡72小时以上来制备湿润状态下的螺钉。

结果如图3所示。实验表明，在干燥状态下，RSF/G螺钉、RSF螺钉和PLGA螺钉的拔出力分别为46N、60N和49N；在湿润状态下，RSF/G螺钉、RSF螺钉和PLGA螺钉的拔出力分别为26N、30N和50N。由此可见，RSF/G螺钉的拔出力无论是在干燥状态下、还是在湿润状态下稍低于RSF螺钉和PLGA螺钉，但是统计学并无明显差异。

实施例4螺钉体外剪切力力学测试

对于实施例2得到的丝蛋白/明胶复合螺钉(RSF/G)、再生丝蛋白螺钉(RSF)和PLGA螺钉，按照下述方法分别测试在干燥状态和湿润状态下的双剪强度。

双剪切测试是通过定制夹具和Instron 5966(Instron,USA)万能力学仪来完成。夹具由三块不锈钢板组成，分别具有对准的2毫米孔和2.5毫米孔，分别用于干燥和湿润状态下的剪切测试。制作2毫米的RSF/G，RSF，和PLGA螺钉。固定装置安装在Instron 5966(美国Instron)测试架上，固定装置的底部保持静止，而固定装置的顶部以5.0mm/min的速度拉伸，直到螺钉断裂，记录最大应力(以N为单位)。在干燥和湿润状态下分别进行剪切力学测试，湿润状态是通过在37℃的PBS溶液中浸泡72小时以上来制备湿润状态下的螺钉。

结果如图4所示。实验表明，在干燥状态下，RSF/G螺钉、RSF螺钉和PLGA螺钉的双剪强度分别为259N、222N和162N；在湿润状态下，RSF/G螺钉、RSF螺钉和PLGA螺钉的双剪强度分别为191N、186N和163N。由此可见，RSF/G螺钉的双剪强度无论是在干燥状态下、还是在湿润状态下都高于RSF螺钉和PLGA螺钉。

以上实验结果表明，本发明的丝蛋白/明胶复合螺钉的剪切力机械强度高于RSF螺钉和PLGA螺钉，拔出力则与RSF螺钉和PLGA螺钉大体相当，具有较好的临床应用前景。

Claims (10)

1.一种用于创伤骨科、颌面整形外科的内固定系统，包括骨钉和骨板，其特征在于，使用丝蛋白/明胶复合材料制成，所述骨钉的螺钉拔出力对于螺杆直径2mm、螺杆长度5mm的骨钉，在干燥状态下为46.93±10.14N，在湿润状态下为26.07±3.04N，

所述丝蛋白/明胶复合材料通过包括下述步骤的方法制备：

1)将桑蚕茧浸入皂盐溶液中脱胶、烘干制成脱胶丝，脱胶丝再经溴化锂溶液溶解、透析脱盐、浓缩制成10％wt的再生丝蛋白溶液，所述皂盐是碳酸钠或者碳酸氢钠；

2)将步骤1)中所得的丝蛋白溶液与30％wt明胶溶液按体积比9：1混合，再加入辣根过氧化物酶、过氧化氢溶液及谷氨酰胺转氨酶，混匀后成胶，得到丝蛋白/明胶凝胶；

3)将步骤2)中所得的丝蛋白/明胶凝胶置于60-80％乙醇水溶液中浸泡24-36小时，再浸泡于硫酸铵溶液中8-20小时，得到丝蛋白/明胶交联凝胶；

4)将步骤3)中所得的丝蛋白/明胶交联凝胶烘干，即得到丝蛋白/明胶复合材料。

2.如权利要求1所述的内固定系统，其特征在于，碳酸钠水溶液的浓度为0.2-1％；或者碳酸氢钠水溶液的浓度为0.5-1％。

3.如权利要求1所述的内固定系统，其特征在于，所述溴化锂溶液浓度为0.5-1.2％，所述蚕茧与溴化锂溶液的质量比是1:10。

4.如权利要求1所述的内固定系统，其特征在于，步骤2)中辣根过氧化物酶的用量为600-1500U/mL；浓度30％的过氧化氢溶液的用量为0.2-1.0％v/v；谷氨酰胺转氨酶的用量为10000-50000U/mL。

5.如权利要求1所述的内固定系统，其特征在于，步骤3)中所用的乙醇水溶液是70％酒精；所用的硫酸铵溶液浓度为10-20％。

6.如权利要求1所述的内固定系统，其特征在于，步骤4)是将丝蛋白/明胶交联凝胶置于恒温干燥箱37℃风干。

7.如权利要求1所述的内固定系统，其特征在于，所述骨钉的双剪强度对于螺杆直径2mm、螺杆长度5mm的骨钉，在干燥状态下为258.7±23.89N，在湿润状态下为191.40±11.47N。

8.如权利要求1所述的内固定系统，其特征在于，通过下述方法加工得到：将丝蛋白/明胶复合材料塑型成柱状或块状母胚，用车床加工，得到骨钉和骨板。

9.如权利要求1所述的内固定系统，其特征在于，所述骨钉用于创伤骨科、颌面整形外科中非承重部位骨折的钢板螺钉内固定。

10.如权利要求9所述的内固定系统，其特征在于，所述骨钉用于锁骨骨折、下颌骨骨折的内固定。

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