CN111956602A - 一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏的制备方法 - Google Patents
一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏，该曲尼司特脂质体乳膏包括脂质体、乳膏基质，脂质体包封有曲尼司特原料药，且脂质体包括磷脂、胆固醇，乳膏基质包括油相成分、水相成分、乳化剂；该曲尼司特脂质体乳膏通过以下步骤制备得到：脂质体的制备；乳膏基质的制备；曲尼司特脂质体乳膏的制备。本发明制备的脂质体中胆固醇和磷脂的比例降低，但所得到的脂质体粒度小而均匀，有利于药物透过角质层并滞留于皮肤部位，且具有较高的曲尼司特原料药的包封率；本发明的曲尼司特脂质体乳膏对瘢痕组织中TGF‑β1、IL‑6的抑制作用更强，具有更好的抑制瘢痕增生作用；且外用剂型，避免了口服给药肝肾毒性，提高病人依从性。
Description
技术领域
本发明涉及医药科技技术领域，具体涉及一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏的制备方法。
背景技术
增生性瘫痕(Hypertrophic scars，HS)是一种渐进性、病理性并难以逆转的皮肤疾病，好发于损伤深度仅及真皮的创伤，偶尔亦见于较深的创伤和手术切口，由大量微细血管生成、成纤维细胞增殖、胶原过度沉积导致真皮过度纤维化引起。增生性瘢痕突出皮面，形状不规则，高低不平，潮红充血，质地实韧。有灼痛和瘙痒感，于环境温度增高，情绪激动，或进食辛辣刺激性食物时症状加剧。增生往往延续几月或几年后才逐渐发生退行性变化，表现为突起高度减低，颜色转暗，充血消退，变软。有些最终可以平复，痛痒症状也大为减轻或消失。目前国内外治疗瘢痕多采用局部药物封闭，皮肤移植，手术切除植皮，晶体磨疤术，气囊扩张术，抗体注射，放射治疗，压迫疗法，激素疗法，硅酮类等疗法。在临床上都不是很成熟，疗效有待观察。而且有的所需时间长，痛苦大，容易反复，出现不良后果等，许多都不尽如人意。
曲尼司特最早作为一种过敏介质阻滞剂，抑制过敏原及其他刺激引起的肥大细胞脱颗粒和过敏介质的释放反应。具有稳定肥大细胞和嗜碱粒细胞的细胞膜作用，阻止其脱颗粒。从而抑制组胺和5-羟色胺过敏性反应物质的释放，对于IgE抗体引起的大白鼠皮肤过敏反应和实验性哮喘有显著抑制作用，是一种针对过敏性疾病发生机制的病因治疗性药物。20世纪90年代，研究发现曲尼司特具有抗纤维化作用，其口服胶囊剂型在临床上被应用于治疗瘢痕疙瘩和增生性瘢痕，已在日本和中国上市。曲尼司特具有抗纤维化活性，体内外药理作用机制研究明确。曲尼司特通过调节瘢痕纤维化组织中TGF-β1、bFGF、IL-6等细胞因子的水平抑制成纤维细胞的过度增殖和活化，从而抑制组织胶原蛋白的过度合成，起到抑制损伤组织的纤维化增生的作用。
目前已上市的曲尼司特类药物以口服剂型为主，此类剂型为全身给药，瘢痕局部组织血药浓度不足，起效缓慢，需要长时间服用，治疗用药疗程长，并伴随一定的肝肾毒性风险，常时间的口服用药需要进行检测肝功能，不利于病人使用的依从性。
脂质体具有降低药物毒性、靶向定位、粒径小、与生物膜具有很好的相容性等特性，将药物制备成脂质体，增加了药物的稳定性及在器官中的滞留量，使药物疗效更显著。乳膏剂系指药物溶解或分散于乳状液型基质中形成的均匀的半固体外用制剂。乳膏剂由于基质不同，可分为水包油型乳膏剂和油包水型乳膏剂。脂质体乳膏将脂质体与乳膏基质混合，从而增加脂质体的稳定性，提高脂质体作为外用剂型的适用性，并且能够提供包裹药物的缓释和控释。脂质体作为常见纳米给药载体，脂质体皮肤给药具有独特的优势，可促进瘫痕异质化表皮的药物渗透能力，增强药物真皮滞留性能，水性给药环境满足伤口愈合对O2的需求。
目前对于曲尼司特的研究多集中药理学机制及口服剂型临床应用方面，外用剂型未见或少见相关报道。如中国专利CN97192132(发明名称：含有曲尼司特的外用制剂及其制备方法)，公开了一种采用水性基质的含有曲尼司特的外用制剂；中国专利CN201510098502.7(发明名称：一种曲尼司特凝胶和软膏剂的处方及制备方法)，公开了一种通过简单的助溶剂、促渗透剂等的简单组合的一种曲尼司特软膏剂。以上公开的研究中，对于曲尼司特抑制增生性瘢痕的作用并无很好的针对效果。
有鉴于此，有必要提供一种治疗增生性瘢痕的曲尼司特脂质体乳膏制剂，其既能够抑制血管过度增生及胶原纤维过快沉积，又不影响正常皮肤组织和细胞的代谢和活性；避免使用抗瘢痕增生药物引起的并发症等副作用，从而既能抑制新生血管、组织纤维过度增殖又降低甚至消除全身毒副反应。
发明内容
为了部分解决上述技术问题，本发明提供了一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏的制备方法，具体技术方案如下：一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏，上述曲尼司特脂质体乳膏包括脂质体、乳膏基质，上述脂质体包封有曲尼司特原料药，且上述脂质体包括磷脂、胆固醇，胆固醇和磷脂的质量份数比为1:3-6，曲尼司特原料药的重量份数和磷脂、胆固醇的总重量份数比为1:10-60；上述脂质体和乳膏基质的重量份数比为1:3-20；上述乳膏基质包括油相成分、水相成分、乳化剂，上述各成分按重量百分比计，油相成分40-60％、乳化剂1-15％、余量为水相成分；该曲尼司特脂质体乳膏通过以下步骤制备得到：(1)脂质体的制备：分别称取磷脂、胆固醇及曲尼司特，加入低沸点溶媒，搅拌使各成分溶解并均匀混合，得到澄清透明溶液；将所得溶液在减压条件下通过旋转蒸发仪使溶剂挥发，使其在容器壁上形成一层均匀薄膜，然后加入pH＝7.4的磷酸盐缓冲液水化得混悬液；将所得混悬液在冰浴条件下超声30min后，经0.8μm微孔滤膜过滤，即制得脂质体溶液；(2)乳膏基质的制备：将油相成分、水相成分、乳化剂混合加热到70-80℃并高速搅拌乳化完全后即得乳膏基质；(3)曲尼司特脂质体乳膏的制备；将步骤(1)中的得到的脂质体溶液加入到步骤(2)70-80℃的乳膏基质中，边加入边搅拌，混合均匀后冷却，得到曲尼司特脂质体乳膏。
上述胆固醇和磷脂的质量份数比为1:5，上述曲尼司特原料药的重量份数和磷脂、胆固醇的总重量份数比为1:50。
其中，步骤(1)脂质体的制备过程也可以通过以下方法得到：分别称取磷脂、胆固醇，加入低沸点溶媒，搅拌使各成分溶解并均匀混合，得到澄清透明溶液；将所得溶液在减压条件下通过旋转蒸发仪使溶剂挥发，使脂质材料在容器壁上形成一层均匀薄膜，然后加入含有曲尼司特的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液水化得混悬液，所得混悬液在冰浴条件下超声30min后，经0.8μm微孔滤膜过滤，即制得脂质体溶液。
上述磷脂为卵磷脂、脑磷脂、肌醇磷脂、丝氨酸磷脂、核苷酸磷脂、甘油磷脂中的一种或多种复配。
上述油相成分包括凡士林、羊毛脂、固体石蜡、液体石蜡、蜂蜡、鲸蜡、硬脂酸、高级醇、植物油中的一种或几种；上述水相成分为蒸馏水、去离子水、纯水及超纯水其中的一种；上述乳化剂为皂类乳化剂。
上述皂类乳化剂为硬脂酸钠。
上述高级醇为碳原子个数为16-22的一元醇；上述植物油为花生油、大豆油、麻油及氢化植物油中的一种。
上述步骤(1)中的低沸点溶媒包括二氯甲烷、甲醇、四氢呋喃、丙酮、乙醚中的一种或多种复配。
上述步骤(1)中的低沸点溶媒为体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂。
上述步骤(1)中的低沸点溶媒为丙酮溶剂。
上述步骤(1)中旋转蒸发仪的使用温度为50℃，转速为30rpm。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1、本发明以生物相容性较好的磷脂和胆固醇等材料包封曲尼司特，与乳膏基质制备成乳膏剂型，能有效的改善曲尼司特的包封性和透皮吸收，增加曲尼司特在真皮层中的滞留量，更好的发挥曲尼司特抑制增生性瘢痕的作用；
2、本发明制备的脂质体中胆固醇和磷脂的比例降低，但所得到的脂质体粒度小而均匀，平均粒径小于600nm,有利于药物透过角质层并滞留于皮肤部位，且具有较高的曲尼司特原料药的包封率；
3、本发明离体皮肤渗透性实验的实验结果表明，与曲尼司特乳膏相比，曲尼司特脂质体乳膏的透皮量较大，说明将曲尼司特制成脂质体后可促进皮肤对药物的吸收；与曲尼司特乳膏相比，曲尼司特脂质体乳膏在同样时间内透皮吸收量更大；
4、本发明的曲尼司特脂质体乳膏对瘢痕组织中TGF-β1、IL-6的抑制作用更强；
5、本发明曲尼司特脂质体乳膏属于外用剂型，不存在依懒性、细胞毒性等不良反应。局部给用药，渗透瘢痕组织局部起效，对于瘢痕靶组织药物浓度更高，纤维化组织更充分吸收，可以降低全身不良反应风险，避免了口服给药肝肾毒性，提高病人依从性。
附图说明
图1为本发明的曲尼司特脂质体乳膏和曲尼司特乳膏离体皮肤渗透性试验结果的曲尼司特的累积透过量-时间曲线；
图2为本发明的曲尼司特脂质体乳膏和曲尼司特乳膏的曲尼司特经皮给药血药浓度-时间曲线；
图3本发明曲尼司特脂质体乳膏对兔耳瘢痕厚度影响示意图；
图4本发明曲尼司特脂质体乳膏对兔耳瘢痕组织IL-6含量抑制示意图；
图5本发明曲尼司特脂质体乳膏对兔耳瘢痕组织TGF-β含量抑制示意图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏的制备方法，包括以下步骤：
(1)脂质体的制备：分别称取磷脂600mg、胆固醇200mg及曲尼司特40mg，加入20mL体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂，搅拌使各成分溶解并均匀混合，得到澄清透明溶液；将所得溶液在减压条件下通过旋转蒸发仪使溶剂挥发，旋转蒸发仪的使用温度为50℃，转速为30rpm，使其在容器壁上形成一层均匀薄膜，然后加入pH＝7.4的磷酸盐缓冲液10mL水化得混悬液；将所得混悬液在冰浴条件下超声30min后，经0.8μm微孔滤膜过滤，即制得脂质体溶液；
(2)乳膏基质的制备：将十六醇3100mg、液体石蜡3620mg、去离子水12mL、硬脂酸钠1200mg混合加热到75℃并高速搅拌乳化完全后即得乳膏基质；
(3)曲尼司特脂质体乳膏的制备；将步骤(1)中的得到的脂质体溶液加入到步骤(2)75℃的乳膏基质中，边加入边搅拌，混合均匀后冷却，得到曲尼司特脂质体乳膏。
实施例2：
一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏的制备方法，包括以下步骤：
(1)脂质体的制备：分别称取磷脂1200mg、胆固醇300mg及曲尼司特50mg，加入20mL体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂，搅拌使各成分溶解并均匀混合，得到澄清透明溶液；将所得溶液在减压条件下通过旋转蒸发仪使溶剂挥发，旋转蒸发仪的使用温度为50℃，转速为30rpm，使其在容器壁上形成一层均匀薄膜，然后加入pH＝7.4的磷酸盐缓冲液10mL水化得混悬液；将所得混悬液在冰浴条件下超声30min后，经0.8μm微孔滤膜过滤，即制得脂质体溶液；
(2)乳膏基质的制备：将十六醇4230mg、液体石蜡5070mg、去离子水4.65mL、硬脂酸钠1550mg混合加热到75℃并高速搅拌乳化完全后即得乳膏基质；
(3)曲尼司特脂质体乳膏的制备；将步骤(1)中的得到的脂质体溶液加入到步骤(2)75℃的乳膏基质中，边加入边搅拌，混合均匀后冷却，得到曲尼司特脂质体乳膏。
实施例3：
一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏的制备方法，包括以下步骤：
(1)脂质体的制备：分别称取磷脂1000mg、胆固醇200mg及曲尼司特24mg，加入20mL体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂，搅拌使各成分溶解并均匀混合，得到澄清透明溶液；将所得溶液在减压条件下通过旋转蒸发仪使溶剂挥发，旋转蒸发仪的使用温度为50℃，转速为30rpm，使其在容器壁上形成一层均匀薄膜，然后加入pH＝7.4的磷酸盐缓冲液10mL水化得混悬液；将所得混悬液在冰浴条件下超声30min后，经0.8μm微孔滤膜过滤，即制得脂质体溶液；
(2)乳膏基质的制备：将十六醇5200mg、液体石蜡5600mg、去离子水12mL、硬脂酸钠1200mg混合加热到75℃并高速搅拌乳化完全后即得乳膏基质；
(3)曲尼司特脂质体乳膏的制备；将步骤(1)中的得到的脂质体溶液加入到步骤(2)75℃的乳膏基质中，边加入边搅拌，混合均匀后冷却，得到曲尼司特脂质体乳膏。
实施例4：
一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏的制备方法，包括以下步骤：
(1)脂质体的制备：分别称取磷脂2400mg、胆固醇400mg及曲尼司特56mg，加入20mL体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂，搅拌使各成分溶解并均匀混合，得到澄清透明溶液；将所得溶液在减压条件下通过旋转蒸发仪使溶剂挥发，旋转蒸发仪的使用温度为50℃，转速为30rpm，使其在容器壁上形成一层均匀薄膜，然后加入pH＝7.4的磷酸盐缓冲液10mL水化得混悬液；将所得混悬液在冰浴条件下超声30min后，经0.8μm微孔滤膜过滤，即制得脂质体溶液；
(2)乳膏基质的制备：将十六醇10840mg、液体石蜡11000mg、去离子水16.8mL、硬脂酸钠3360mg混合加热到75℃并高速搅拌乳化完全后即得乳膏基质；
(3)曲尼司特脂质体乳膏的制备；将步骤(1)中的得到的脂质体溶液加入到步骤(2)75℃的乳膏基质中，边加入边搅拌，混合均匀后冷却，得到曲尼司特脂质体乳膏。
实施例5：
一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏的制备方法，包括以下步骤：
(1)脂质体的制备：分别称取磷脂1000mg、胆固醇200mg及曲尼司特120mg，加入20mL体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂，搅拌使各成分溶解并均匀混合，得到澄清透明溶液；将所得溶液在减压条件下通过旋转蒸发仪使溶剂挥发，旋转蒸发仪的使用温度为50℃，转速为30rpm，使其在容器壁上形成一层均匀薄膜，然后加入pH＝7.4的磷酸盐缓冲液10mL水化得混悬液；将所得混悬液在冰浴条件下超声30min后，经0.8μm微孔滤膜过滤，即制得脂质体溶液；
(2)乳膏基质的制备：将十六醇3200mg、液体石蜡3300mg、去离子水5.85mL、硬脂酸钠650mg混合加热到75℃并高速搅拌乳化完全后即得乳膏基质；
(3)曲尼司特脂质体乳膏的制备；将步骤(1)中的得到的脂质体溶液加入到步骤(2)75℃的乳膏基质中，边加入边搅拌，混合均匀后冷却，得到曲尼司特脂质体乳膏。
实施例6：
一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏的制备方法，包括以下步骤：
(1)脂质体的制备：分别称取磷脂1000mg、胆固醇200mg及曲尼司特20mg，加入20mL体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂，搅拌使各成分溶解并均匀混合，得到澄清透明溶液；将所得溶液在减压条件下通过旋转蒸发仪使溶剂挥发，旋转蒸发仪的使用温度为50℃，转速为30rpm，使其在容器壁上形成一层均匀薄膜，然后加入pH＝7.4的磷酸盐缓冲液10mL水化得混悬液；将所得混悬液在冰浴条件下超声30min后，经0.8μm微孔滤膜过滤，即制得脂质体溶液；
(2)乳膏基质的制备：将十六醇4200mg、液体石蜡4800mg、去离子水8.1mL、硬脂酸钠900mg混合加热到75℃并高速搅拌乳化完全后即得乳膏基质；
(3)曲尼司特脂质体乳膏的制备；将步骤(1)中的得到的脂质体溶液加入到步骤(2)75℃的乳膏基质中，边加入边搅拌，混合均匀后冷却，得到曲尼司特脂质体乳膏。
实施例7：
一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏的制备方法，包括以下步骤：
(1)脂质体的制备：分别称取磷脂2000mg、胆固醇400mg及曲尼司特100mg，加入20mL体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂，搅拌使各成分溶解并均匀混合，得到澄清透明溶液；将所得溶液在减压条件下通过旋转蒸发仪使溶剂挥发，旋转蒸发仪的使用温度为50℃，转速为30rpm，使其在容器壁上形成一层均匀薄膜，然后加入pH＝7.4的磷酸盐缓冲液10mL水化得混悬液；将所得混悬液在冰浴条件下超声30min后，经0.8μm微孔滤膜过滤，即制得脂质体溶液；
(2)乳膏基质的制备：将十六醇1750mg、液体石蜡2000mg、去离子水3.36mL、硬脂酸钠380mg混合加热到75℃并高速搅拌乳化完全后即得乳膏基质；
(3)曲尼司特脂质体乳膏的制备；将步骤(1)中的得到的脂质体溶液加入到步骤(2)75℃的乳膏基质中，边加入边搅拌，混合均匀后冷却，得到曲尼司特脂质体乳膏。
对比例1
曲尼司特乳膏的制备方法，包括以下步骤：
乳膏基质的制备：将十六醇5200mg、液体石蜡5600mg、硬脂酸钠1200mg混合加热到75℃，充分熔解后趁热加入24mg曲尼司特，并高速搅拌乳化完全后，加入加热至75℃的去离子水12mL，高速搅拌混合均匀后冷却，得到曲尼司特乳膏。
对比例2：
脂质体乳膏赋形剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)脂质体的制备：分别称取磷脂1000mg、胆固醇200mg，加入20mL体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂，搅拌使各成分溶解并均匀混合，得到澄清透明溶液；将所得溶液在减压条件下通过旋转蒸发仪使溶剂挥发，旋转蒸发仪的使用温度为50℃，转速为30rpm，使其在容器壁上形成一层均匀薄膜，然后加入pH＝7.4的磷酸盐缓冲液10mL水化得混悬液；将所得混悬液在冰浴条件下超声30min后，经0.8μm微孔滤膜过滤，即制得脂质体溶液；
(2)乳膏基质的制备：将十六醇5200mg、液体石蜡5600mg、去离子水12mL、硬脂酸钠1200mg混合加热到75℃并高速搅拌乳化完全后即得乳膏基质；
(3)脂质体乳膏的制备；将步骤(1)中的得到的脂质体溶液加入到步骤(2)75℃的乳膏基质中，边加入边搅拌，混合均匀后冷却，得到脂质体乳膏。
对比例3：
乳膏基质的制备：将十六醇5200mg、液体石蜡5600mg、去离子水12mL、1200mg吐温80混合加热到75℃并高速搅拌乳化完全后即得乳膏基质。
测试例1：脂质体粒径、粒度分布、Zeta电位、包封率的测定
测定方法：将曲尼司特原料药溶于甲醇中进行紫外扫谱，选取334.5nm曲尼司特在甲醇中的最大吸收峰，制备浓度为1、2、3、5、8、10、15μg/mL的曲尼司特甲醇溶液，测定曲尼司特在甲醇中的标准曲线为A＝0.094c+0.0149，R^2＝0.9999，c的单位为μg/mL。取各实施例制备得到的曲尼司特脂质体溶液20μL，再加入甲醇3.980mL进行破乳，用紫外测定吸收波长为334.5nm下的吸光度A，带入公式A＝0.094c+0.0149得到浓度C1，利用公式包封率(％)＝C1*V1(破乳稀释倍数)*V2(脂质体溶液体积)/原料药投入量*100％；分别精密量取实施例1-4步骤(1)得到的脂质体各1ml置于50ml的容量瓶中，加纯化水稀释并定容至刻度，充分摇匀，用PSANANO2590纳米粒度仪及Zeta电位分析仪测定粒径、粒度分布及Zeta电位。结果见下表：
| 实施例 | 粒径(nm) | PDI | Zeta电位(mV) | 包封率(％) |
| 实施例1 | 587.8 | 0.407 | -20.49 | 89.01 |
| 实施例2 | 512.7 | 0.386 | -17.56 | 90.20 |
| 实施例3 | 463.6 | 0.216 | -18.86 | 90.11 |
| 实施例4 | 476.8 | 0.289 | -20.49 | 87.43 |
| 实施例5 | 487.3 | 0.262 | -20.64 | 85.13 |
| 实施例6 | 470.6 | 0.255 | -17.19 | 90.35 |
| 实施例7 | 479.2 | 0.218 | -20.37 | 86.35 |
包封率的测定结果表明，所有实施例中脂质体的包封率均大于85％，脂质体的粒径均很小，6个实施例的平均粒径均小于600nm，且分布均匀，物理稳定性良好。实施例3中胆固醇和磷脂比例为1:5、药脂比为1:50时，脂质体具有较小的粒径和较好的包封率。
测试例2：乳膏基质外观观测
直接对实施例3和对比例3得到的乳膏基质进行观察，发现实施例3得到的乳膏基质外观细腻，光泽度好，流动性、粘度适中，对比例3得到的乳膏基质外观不够细腻，光泽度差。
测试例3：离体皮肤渗透性试验
3.1：离体皮肤制备
雄性昆明种小鼠(18-22g)颈椎脱臼处死后，剥取腹部皮肤，刮净腹部鼠毛，剔除多余的脂肪、结缔组织，用生理盐水洗净，滤纸吸干水分，将皮肤铺平，-20℃冰箱内保存，一周内用完；
3.2：透皮吸收实验
将离体鼠皮恢复至室温，用生理盐水冲洗后，用滤纸吸干水分，将其固定于TP-6透皮扩散试验仪的供给池与接受池之间，角质层面向供给池，真皮层面向接受池，接受池体积为25mL，并置于(37±0.5)℃恒温水浴，磁力搅拌速度为400rpm；通过取样管在接收池中注满pH＝7.4磷酸盐缓冲液为接收液，使液面与真皮层面接触；分别取1g对比例1制备得到的曲尼司特乳膏和实施例3制备得到的曲尼司特脂质体乳膏涂抹于鼠皮角质层面上，有效扩散面积为2.25cm2，以保鲜膜覆盖供给池。分别于6、8、10、12、24h间隔取样5mL，同时立即补充同温等体积接收液，所取样品经0.8μm的微孔滤膜过滤，用紫外分光光度法在333nm处测定吸光度，带入标准曲线计算曲尼司特的含量，并按下式计算单位面积累积透皮量：
其中，Cn：第n次取样时接收液中的浓度；Ci：第i次取样时接收液中的浓度；Vo：接受池体积；S：扩散面积。
3.3：体外渗透曲线
以药物透过量Q(μg·cm-2)为纵坐标，时间T(h)为横坐标作图，绘曲尼司特的累积透过量-时间曲线，见图1。由图1可知，与曲尼司特乳膏相比，曲尼司特脂质体乳膏的透皮量较大，说明将曲尼司特制成脂质体后可促进皮肤对药物的吸收。
测试例4：曲尼司特脂质体乳膏经皮给药药动学研究
4.1：实验方法
准备12只SD大鼠，分为两组，雌雄各半，大鼠在实验前禁食12小时，同时于前一天晚将大鼠颈背部毛发剪光，于次日晨以肥皂水清洗颈背部皮肤，清水冲洗后擦干，空腹经皮给予对比例1制得的曲尼司特乳膏和实施例3制得的曲尼司特脂质体乳膏，给药4小时后可进食。注：给药后以纱布覆盖给药部位并以胶带固定纱布以防脱落，同时每个鼠笼仅安置一只大鼠，给药面积均为3×4cm2。
4.2：采血过程及样本处理
采血时间点为给药前(0h)，给药后2、4、6、8、10、12、24(清洗药物)、28、32、36h，每个时间点经大鼠眼眶取血约0.2mL-0.5mL并置于离心管中，将载血的EP管立即转移至离心机中，以12000rpm离心8min，离心后立即取血浆转移至1.5mL的离心管中，置-20℃冰箱中保存待测。
4.3：血浆样品处理
取1.5mL离心管，精密加入格列美脲内标液(5.49μg/mL)0.01mL，精密加入血浆样品0.1mL，涡旋混匀，加入0.3mL乙腈沉淀，涡旋4min，于15600r/min高速离心8min，移取上清液，取出0.05mL上清液，加入0.1mL的纯水，涡旋30s，转移样品至自动进样器样品瓶中，进行HPLC-MS/MS分析。
4.4：实验结果
两组SD大鼠单次经皮曲尼司特给药后，测得曲尼司特的经时血药浓度-时间曲线见图2。由以上结果发现，大鼠经皮给药后，曲尼司特乳膏和曲尼司特脂质体乳膏中的药物均可透皮吸收，且曲尼司特血药浓度2-4小时基本达到峰值。与曲尼司特乳膏相比，曲尼司特脂质体乳膏在同样时间内透皮吸收量更大，同时，由所测结果可见，大鼠经皮给药24h清洗药物后，出现曲尼司特血药浓度骤升现象，推测为清洗药物过程中存在反复摩擦大鼠皮肤导致皮肤局部产热等因素均可能促进曲尼司特的快速透皮吸收。
测试例5：曲尼司特脂质体乳膏对瘢痕增生的抑制作用
5.1.1：兔耳增生瘢痕模型制作
20只家兔分为四组，每组5只，分别为空白对照组、对比例1曲尼司特乳膏组、实施例3曲尼司特脂质体乳膏组和对比例2脂质体乳膏赋形剂组；用速眠新II大腿内侧肌肉(股四头肌)注射，麻醉用药剂量：0.1mL/kg。曲尼司特乳膏组、曲尼司特脂质体乳膏组和脂质体乳膏赋形剂组创面制作方法：在每个兔耳上制作三个长条形的创面，先用沿笔在兔耳中间位置画出三个横向走行的方框(长×宽＝34mm×9mm)，内侧方框离耳根部约2cm，方框间距1.5cm。用直径9mm圆形角膜环钻自左至右或自右至左碾钻，碾钻深度直达软骨表面，同时用止血钳剥离碾钻下来的皮肤直至软骨表面，去掉全部框内皮肤组织，再用骨膜剥离器去掉软骨表面骨膜,创面长约3.4cm，宽约0.9cm，面积约2.89cm2。空白对照组不制作创面。待实验兔清醒后，放回兔笼中，随意进食及饮水。手术后连续两天肌肉注射青霉素，给药剂量4万单位/kg体重。
5.1.2：二次揭疤手术
造模手术后第7天，创面结痂。按上述方法麻醉后揭去兔耳表面痂壳，过程中如有出血，压迫止血。第二次揭痂后给予青霉素，防止感染。
5.1.3：剂量设置及给药方法
造模手术后隔天开始给药，每天8:00和20:00时各给药一次，连续给药30天。给药方法为局部创面药物均匀涂布，给药剂量为0.035cm2。
5.2：瘢痕厚度测量方法及动物处理
瘢痕厚度测量方法：选取瘢痕中心点以及距离瘢痕两侧边缘约0.5cm处三点在创面及相应的正常皮肤上分别测量，瘢痕厚度即为创面处测得厚度减去正常皮肤处厚度，三点中的最大数值即为瘢痕厚度最大值，三点均值即为瘢痕厚度平均值。重复测量三次取平均得测量结果。瘢痕厚度变化率计算公式如下：瘢痕平均厚度变化率(％)＝(实验组瘢痕平均厚度-赋形剂组瘢痕平均厚度)/赋形剂组瘢痕平均厚度；瘢痕最大厚度变化率(％)＝(实验组瘢痕最大厚度-赋形剂组瘢痕最大厚度)/赋形剂组瘢痕最大厚度。
从造模手术开始计算，连续给药30天后动物创口已愈合，瘢痕已形成。然后按前法将动物麻醉，手术切取兔耳，切取兔耳瘢痕位置耳廓，去掉瘢痕背侧正常皮肤，保留增生性瘢痕组织和软骨，分成三份，两份组织块立即放入-80℃冰箱中冷冻保存，另一份放入4％中性甲醛溶液中固定，备用。
实验结果见图3，由图3可知，曲尼司特乳膏和曲尼司特脂质体乳膏均能减少兔耳瘢痕厚度，且脂质体乳膏的降低效果更明显。
5.3：瘢痕组织TGF-β及IL-6含量测定方法
取出冻存的兔耳瘢痕组织，括取已获得的增生性瘢痕组织，称重后放入玻璃匀浆器中，冰浴匀浆，制备成10％兔耳瘢痕组织生理盐水匀浆液，使用前放入漩涡混合器上混合。按照TGF-β、IL-6、VEGF及bFGF含量测定ELISA试剂盒说明书操作步骤用ELISA法在450nm波长处进行含量检测。
实验结果见图4、图5，由图4、图5可知，与空白对照组相比，赋形剂组瘢痕组织中TGF-β1、IL-6含量明显升高，提示瘢痕和炎症反应；曲尼司特乳膏和曲尼司特脂质体乳膏均能使TGF-β1、IL-6两指标减少，且脂质体乳膏对瘢痕组织中TGF-β1、IL-6的抑制作用更强。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏，其特征在于：所述曲尼司特脂质体乳膏包括脂质体、乳膏基质，所述脂质体包封有曲尼司特原料药，且所述脂质体包括磷脂、胆固醇，胆固醇和磷脂的质量份数比为1:3-6，曲尼司特原料药的重量份数和磷脂、胆固醇的总重量份数比为1:10-60；所述脂质体和乳膏基质的重量份数比为1:3-20；所述乳膏基质包括油相成分、水相成分、乳化剂，所述各成分按重量百分比计，油相成分40-60％、乳化剂1-15％、余量为水相成分；该曲尼司特脂质体乳膏通过以下步骤制备得到：(1)脂质体的制备：分别称取磷脂、胆固醇及曲尼司特，加入低沸点溶媒，搅拌使各成分溶解并均匀混合，得到澄清透明溶液；将所得溶液在减压条件下通过旋转蒸发仪使溶剂挥发，使其在容器壁上形成一层均匀薄膜，然后加入pH＝7.4的磷酸盐缓冲液水化得混悬液；将所得混悬液在冰浴条件下超声30min后，经0.8μm微孔滤膜过滤，即制得脂质体溶液；(2)乳膏基质的制备：将油相成分、水相成分、乳化剂混合加热到70-80℃并高速搅拌乳化完全后即得乳膏基质；(3)曲尼司特脂质体乳膏的制备；将步骤(1)中的得到的脂质体溶液加入到步骤(2)70-80℃的乳膏基质中，边加入边搅拌，混合均匀后冷却，得到曲尼司特脂质体乳膏。
2.根据权利要求1所述的一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏，其特征在于：所述胆固醇和磷脂的质量份数比为1:5，所述曲尼司特原料药的重量份数和磷脂、胆固醇的总重量份数比为1:50。
3.根据权利要求1所述的一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏，其特征在于：所述磷脂为卵磷脂、脑磷脂、肌醇磷脂、丝氨酸磷脂、核苷酸磷脂、甘油磷脂中的一种或多种复配。
4.根据权利要求1所述的一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏，其特征在于：所述油相成分包括凡士林、羊毛脂、固体石蜡、液体石蜡、蜂蜡、鲸蜡、硬脂酸、高级醇、植物油中的一种或几种；所述水相成分为蒸馏水、去离子水、纯水及超纯水其中的一种；所述乳化剂为皂类乳化剂。
5.根据权利要求1所述的一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏，其特征在于：所述皂类乳化剂为硬脂酸钠。
6.根据权利要求1所述的一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏，其特征在于：所述高级醇为碳原子个数为16-22的一元醇；所述植物油为花生油、大豆油、麻油及氢化植物油中的一种。
7.根据权利要求1所述的一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏，其特征在于：所述步骤(1)中的低沸点溶媒包括二氯甲烷、甲醇、四氢呋喃、丙酮、乙醚中的一种或多种复配。
8.根据权利要求7所述的一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏，其特征在于：所述步骤(1)中的低沸点溶媒为体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂。
9.根据权利要求7所述的一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏，其特征在于：所述步骤(1)中的低沸点溶媒为丙酮溶剂。
10.根据权利要求7所述的一种具有抑制瘢痕增生作用的曲尼司特脂质体乳膏，其特征在于：所述步骤(1)中旋转蒸发仪的使用温度为50℃，转速为30rpm。
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Legal Events
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20201120 |