CN111893059A - 一种泰乐菌素降解菌及其筛选方法与应用 - Google Patents
一种泰乐菌素降解菌及其筛选方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111893059A CN111893059A CN202010680149.4A CN202010680149A CN111893059A CN 111893059 A CN111893059 A CN 111893059A CN 202010680149 A CN202010680149 A CN 202010680149A CN 111893059 A CN111893059 A CN 111893059A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tylosin
- strain
- degradation
- degrading
- screening
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N tylosin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)O[C@H]([C@@H]([C@H]1N(C)C)O)O[C@@H]1[C@@H](C)[C@H](O)CC(=O)O[C@@H]([C@H](/C=C(\C)/C=C/C(=O)[C@H](C)C[C@@H]1CC=O)CO[C@H]1[C@@H]([C@H](OC)[C@H](O)[C@@H](C)O1)OC)CC)[C@H]1C[C@@](C)(O)[C@@H](O)[C@H](C)O1 WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N 0.000 title claims abstract description 91
- 229930194936 Tylosin Natural products 0.000 title claims abstract description 88
- 239000004182 Tylosin Substances 0.000 title claims abstract description 88
- 229960004059 tylosin Drugs 0.000 title claims abstract description 88
- 235000019375 tylosin Nutrition 0.000 title claims abstract description 88
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims abstract description 27
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims abstract description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 4
- 230000003068 static effect Effects 0.000 claims description 4
- 206010028470 Mycoplasma infections Diseases 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 230000003097 anti-respiratory effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 7
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 abstract description 3
- 238000005067 remediation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001523 saccharolytic effect Effects 0.000 abstract 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- NBOODGNJLRRJNA-IAGPQMRQSA-N 2-[(4r,5s,6s,7r,9r,11e,13e,15r,16r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-5-[(2s,4r,5s,6s)-4,5-dihydroxy-4,6-dimethyloxan-2-yl]oxy-4-(dimethylamino)-3-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-16-ethyl-4-hydroxy-15-[[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-hydroxy-3,4-dimethoxy-6-methyloxan-2-yl]oxymethyl Chemical compound OP(O)(O)=O.O([C@@H]1[C@@H](C)O[C@H]([C@@H]([C@H]1N(C)C)O)O[C@@H]1[C@@H](C)[C@H](O)CC(=O)O[C@@H]([C@H](/C=C(\C)/C=C/C(=O)[C@H](C)C[C@@H]1CC=O)CO[C@H]1[C@@H]([C@H](OC)[C@H](O)[C@@H](C)O1)OC)CC)[C@H]1C[C@@](C)(O)[C@@H](O)[C@H](C)O1 NBOODGNJLRRJNA-IAGPQMRQSA-N 0.000 description 7
- 229940031989 tylosin phosphate Drugs 0.000 description 7
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 5
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 4
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical group CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 3
- 241001078790 Pseudochrobactrum saccharolyticum Species 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000224483 Coccidia Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187438 Streptomyces fradiae Species 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000009264 composting Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000000832 effect on mycoplasma Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A62—LIFE-SAVING; FIRE-FIGHTING
- A62D—CHEMICAL MEANS FOR EXTINGUISHING FIRES OR FOR COMBATING OR PROTECTING AGAINST HARMFUL CHEMICAL AGENTS; CHEMICAL MATERIALS FOR USE IN BREATHING APPARATUS
- A62D3/00—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances
- A62D3/02—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances by biological methods, i.e. processes using enzymes or microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A62—LIFE-SAVING; FIRE-FIGHTING
- A62D—CHEMICAL MEANS FOR EXTINGUISHING FIRES OR FOR COMBATING OR PROTECTING AGAINST HARMFUL CHEMICAL AGENTS; CHEMICAL MATERIALS FOR USE IN BREATHING APPARATUS
- A62D2101/00—Harmful chemical substances made harmless, or less harmful, by effecting chemical change
- A62D2101/20—Organic substances
- A62D2101/28—Organic substances containing oxygen, sulfur, selenium or tellurium, i.e. chalcogen
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Business, Economics & Management (AREA)
- Emergency Management (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
一种泰乐菌素降解菌及其筛选方法与应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种在好氧和兼性厌氧条件下均可高效、安全地降解泰乐菌素的微生物菌株，并将其应用于泰乐菌素的降解。所述微生物菌株为解糖假苍白杆菌(Pseudochrobactrum saccharolyticum)TYL‑B35该菌株从使用泰乐菌素的养鸡场附近的土壤中筛选获得，菌株原始编号TYL‑B35，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20191028，保藏日期为2019年12月9日，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。由该菌株制成的菌剂可应用于含泰乐菌素菌渣中泰乐菌素的降解及受泰乐菌素污染土壤或水体的修复。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种泰乐菌素降解菌及其筛选方法与应用。
背景技术
泰乐菌素(Tylosin)，又称泰农、泰乐霉素，是一种从弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)发酵液中提取的大环内酯类抗生素，其核心结构为十六元不饱和内酯，另外带有3个六碳糖衍生物结构单元(图1)。泰乐菌素可与核糖体50s亚基结合阻断转肽作用和mRNA位移，抑制细菌或支原体的蛋白质合成，从而起到杀菌作用。本品是一种广谱兽用抗生素，对支原体有特效，为畜禽支原体感染性疾病的首选药物；本品对多种革兰氏阳性菌具有很强的抗菌作用，还对部分革兰氏阴性菌及球虫具有抑制作用。此外，泰乐菌素还可用作一种饲料添加剂，连续低剂量饲用，对生长期的畜禽具有明显的促生长作用。得益于优良的药理和生理作用，泰乐菌素在畜禽养殖中得到了广泛应用，在畜禽养殖业的发展中发挥了重要作用。另一方面，泰乐菌素的大规模使用也带来了严重的抗生素残留问题。大量泰乐菌素未经处理排放到环境中，会加快诱导微生物产生抗药性，同时给人类健康带来潜在的威胁。目前，泰乐菌素残留已成为人们关注的焦点环保问题之一。如何高效、安全、低成本地降解泰乐菌素也成为科研人员研究的热点。
微生物降解抗生素，处理速度快，无二次污染，整体成本低。因此，找到高效、安全的泰乐菌素降解菌株是解决问题的关键。目前，国内只有少量针对泰乐菌素微生降解的报道。孙瑞珠等[微生物学通报,14,41(4):681-690]筛选到一株越南伯克霍尔德氏菌，72h对初始浓度为300mg/L的泰乐菌素的降解率可达99％以上。李兆君等(专利申请号：CN201710816643.7、CN201910153969.5)筛选到2株微生物，对低浓度泰乐菌素(25mg/L)的降解率达到70％以上。以上对泰乐菌素降解的报道都是在好氧条件下进行的，而在实际降解泰乐菌素的实践中，往往需要在兼性厌氧条件下进行，如泰乐菌素菌渣的堆肥。因此，找到可在兼性厌氧条件下高效、安全地降解泰乐菌素的菌株势在必行。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种在好氧和兼性厌氧条件下均可高效、安全地降解泰乐菌素的微生物菌株，并将其应用于泰乐菌素的降解。为实现该目标，本发明从使用泰乐菌素养鸡场的浅表层土壤种筛选得到了一株泰乐菌素降解菌——解糖假苍白杆菌(Pseudochrobactrum saccharolyticum)TYL-B35，该菌株可在好氧或者兼性厌氧条件高效地降解泰乐菌素。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年12月9日，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M20191028。
本发明还提供了上述泰乐菌素降解菌的筛选方法：
1)采集使用泰乐菌素作为抗呼吸道支原体感染药物的养鸡场浅表层土壤，加入到无菌缓冲液中，摇匀后稀释，将稀释液涂布于含有泰乐菌素的LB固体培养基平板上，在培养箱中静置培养；
2)待长出菌落后，挑取单菌落，接种于含有步骤1)中2倍浓度的泰乐菌素的LB平板上，重复以上步骤直至培养基中含有步骤1)中10倍浓度的泰乐菌素，测定菌株对泰乐菌素降解情况，筛选获得泰乐菌素降解菌。
进一步地限定，步骤1)所述无菌缓冲液为50mM无菌磷酸缓冲液，pH为7.0。
进一步地限定，步骤1)所述静置培养条件为30℃恒温培养2d。
进一步地限定，步骤1)所述含有泰乐菌素的LB固体培养基平板中泰乐菌素的终浓度为50mg/L。
进一步地限定，步骤2)所述菌株对泰乐菌素降解情况测定采用高压液相色谱法。
本发明还提供了上述泰乐菌素降解菌在泰乐菌素降解上的应用。
本发明还提供了一种含有上述泰乐菌素降解菌的菌剂。
本发明还提供了上述菌剂在泰乐菌素降解上的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供的菌株，在有氧或者兼性厌氧条件下均可高效地降解泰乐菌素，该菌株及其制剂可应用于泰乐菌素菌渣的处理或者用于受泰乐菌素污染环境的修复。
附图说明
图1泰乐菌素(Tylosin)化学结构；
图2 P.saccharolyticum TYL-B35对泰乐菌素的降解情况：a，空白对照；b，好氧条件下泰乐菌素的降解；c，兼性厌氧条件下泰乐菌素的降解。横坐标为时间，纵坐标为响应值。
具体实施方式
本发明所述的泰乐菌素降解菌的筛选方法如下：采集山东某散养型养鸡场浅表层土壤。该养鸡场使用泰乐菌素作为抗呼吸道支原体感染的药物。将采集到的土样带回实验室，加入到无菌缓冲液中，在摇床中振荡摇匀，稀释后涂布于含有泰乐菌素的LB固体培养基平板上，在培养箱中静置培养。待长出菌落后，挑取单菌落，接种于含有更高浓度泰乐菌素的LB平板上，重复以上步骤直至培养基中含有高浓度泰乐菌素。在含有高浓度泰乐菌素的LB液体培养基中好氧或者兼性厌氧培养筛选得到的菌株，高压液相色谱法(HPLC)测定菌株对泰乐菌素降解情况。从中筛选得到一株对泰乐菌素有较好降解效果的菌株TYL-B35，经鉴定所得菌株为解糖假苍白杆菌(P.saccharolyticum)。将该菌株应用于泰乐菌素的降解，在LB液体培养基中振荡培养5d后，泰乐菌素的降解率可以达到96％以上。
下面具体描述本发明。
实施例1.泰乐菌素抗逆菌株的分离与筛选。
1)采集山东某散养型养鸡场浅表层(表面以下10cm)湿润土壤，密封于自封袋中，置于低温保温箱(箱中温度约4℃)中带回实验室。该养鸡场建成约5年，使用泰乐菌素作为禽类抗呼吸道感染的药物。所得土样带回实验室后，称取5.0g加入含有100mL 50mM无菌磷酸缓冲液(pH7.0)的500mL挡板摇瓶中，在30℃恒温摇床中振荡20min，转速180rpm。取悬浊液，分别稀释10倍、102倍、103倍、104倍，取100μL均匀涂布于含有50mg/L磷酸泰乐菌素的LB固体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉20g/L，121℃高温高压灭菌20min)平板上，30℃恒温静置培养2d。根据菌落形态、大小、颜色的不同，挑取菌落在含有50mg/L磷酸泰乐菌素的LB平板上划线，直至菌落形态单一。
2)挑取单菌落在含有更高浓度磷酸泰乐菌素(100mg/L)的LB固体培养基上划线，30℃恒温静置培养2d。依次将培养基中磷酸泰乐菌素升高至200mg/L、500mg/L，重复上述操作。通过以上操作得到的菌株初步认定为可耐受高浓度泰乐菌素。
将上述得到菌株，分别接种于含有500mg/L磷酸泰乐菌素的LB液体培养基中，在30℃恒温摇床中振荡(转速180rpm)培养5d。取2mL菌液，12000×g离心1min，收集上清，过0.22μm滤膜，HPLC法测定菌液中残留的泰乐菌素并计算降解率。以含有相同浓度的泰乐菌素但不接种菌落的LB液体培养基为对照。
HPLC条件如下：Waters 1525高效液相色谱仪配备W2489UVD双通道紫外可见检测器；色谱柱为Agilent HC-C18柱(5μm，250mm×4.6mm)；流动相为乙腈:KH2PO4溶液(0.02M，pH2.5)＝30:70(体积比)等度洗脱，流速1mL/min；柱温25℃；进样量20μL；检测波长285nm。
经过上述筛选步骤，最终得到1株可以高效降解泰乐菌素的菌株TYL-B35。提取TYL-B35菌株基因组，PCR扩增菌株的16S rDNA基因序列，PCR反应体系如下：
表1 PCR反应体系
27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACCTTGTTACGACTT-3')是克隆细菌16S rDNA基因序列的通用引物。PCR条件如下：98℃预变性30s，98℃变性10s，52℃复性10s，72℃延伸10s，32个循环，72℃保真延伸3min。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后，送青岛擎科梓煕生物技术有限公司测序，序列如SEQID No.1所示。将序列在GenBank中比对，结果显示，TYL-B35序列与数据库中Pseudochrobactrum saccharolyticum 16S rDNA基因序列相似性高达99.8％，因此，TYL-B35鉴定为解糖假苍白杆菌(Pseudochrobactrum saccharolyticum)。该菌株于2019年12月9日，送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M20191028，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
实施例2.P.saccharolyticum TYL-B35对泰乐菌素的降解。
挑取实施例1筛选获得的P.saccharolyticum TYL-B35单菌落转接于5mL含有500mg/L磷酸泰乐菌素的LB液体培养基中，30℃和180rpm条件下振荡培养18h。分别吸取50μL菌液转接于5mL含有500mg/L磷酸泰乐菌素的LB液体培养基中。培养基分别装于两种小瓶中，两种小瓶均带有硅胶塞，一种容积为25mL(好氧培养)，另一种为5mL(兼性厌氧)，分别用于验证好氧和兼性厌氧条件下泰乐菌素的降解。接种好的小瓶分别置于30℃恒温摇床中以180rpm振荡培养5d，HPLC法测定菌液中残留的泰乐菌素并计算降解率，结果显示泰乐菌素的降解率达到96％以上。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
核苷酸序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 一种泰乐菌素降解菌及其筛选方法与应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1361
<212> DNA
<213> 16S rDNA基因序列
<400> 1
ttaactgcag tcgaacggtc tcttcggagg cagtggcaga cgggtgagta atgcatggga 60
atctaccgtt ctctacggaa taactcaggg aaacttgtgc taataccgta tacgcccttt 120
tggggaaaga tttatcggag aatgatgagc ccatgttgga ttagctagtt ggtagggtaa 180
aggcctacca aggcgacgat ccatagctgg tctgagagga tgatcagcca cactgggact 240
gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca atgggcgcaa 300
gcctgatcca gccatgccgc gtgagtgatg aaggccctag ggttgtaaag ctctttcacc 360
ggtgaagata atgacggtaa ccggagaaga agccccggct aacttcgtgc cagcagccgc 420
ggtaatacga agggggctag cgttgttcgg atttactggg cgtaaagcgc acgtaggcgg 480
acttttaagt caggggtgaa atcccggggc tcaaccccgg aactgccttt gatactggaa 540
gtcttgagta tggaagaggt aagtggaatt gcgagtgtag aggtgaaatt cgtagatatt 600
cgcaggaaca ccagtggcga aggcggctta ctggtccatt actgacgctg aggtgcgaaa 660
gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgaatgtta 720
gccgtcgggg tgtttacact tcggtggcgc agctaacgca ttaaacattc cgcctgggga 780
gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 840
tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgcagaac cttaccagct cttgacatgc ctatgaatgt 900
tagtggagac actttcagcc tttcggggcg taggacacag gtgctgcatg gctgtcgtca 960
gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctcg cctttagttg 1020
ccatcattta gttgggcact ctaaagggac tgccagtgat aagctggagg aaggtgggga 1080
tgacgtcaag tcctcatggc ccttacgggc tgggctacac acgtgctaca atggtggtga 1140
cagtgggcag cgagaccgcg aggtcgagct aatctccaaa agccatctca gttcggattg 1200
cactctgcaa ctcgagtgca tgaagttgga atcgctagta atcgcggatc agaatgccgc 1260
ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag ttggttttac 1320
ccgaaggcgc tgtgctaacc gcaaggaggc agcgaccacc g 1361
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 27F
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 1492R
<400> 3
taccttgtta cgactt 16
Claims (9)
1.一株泰乐菌素降解菌，其特征在于，所述泰乐菌素降解菌为解糖假苍白杆菌Pseudochrobactrum saccharolyticum TYL-B35，保藏编号为CCTCC NO:M20191028。
2.权利要求1所述泰乐菌素降解菌的筛选方法，其特征在于，步骤如下：
1)采集使用泰乐菌素作为抗呼吸道支原体感染药物的养鸡场浅表层土壤，加入到无菌缓冲液中，摇匀后稀释，将稀释液涂布于含有泰乐菌素的LB固体培养基平板上，在培养箱中静置培养；
2)待长出菌落后，挑取单菌落，接种于含有步骤1)中2倍浓度的泰乐菌素的LB平板上，重复以上步骤直至培养基中含有步骤1)中10倍浓度的泰乐菌素，测定菌株对泰乐菌素降解情况，筛选获得泰乐菌素降解菌。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤1)所述无菌缓冲液为50mM无菌磷酸缓冲液，pH为7.0。
4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤1)所述静置培养条件为30℃恒温培养2d。
5.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤1)所述含有泰乐菌素的LB固体培养基平板中泰乐菌素的终浓度为50mg/L。
6.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤2)所述菌株对泰乐菌素降解情况测定采用高压液相色谱法。
7.权利要求1所述泰乐菌素降解菌在泰乐菌素降解上的应用。
8.一种含有权利要求1所述泰乐菌素降解菌的菌剂。
9.权利要求8所述菌剂在泰乐菌素降解上的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010680149.4A CN111893059B (zh) | 2020-07-15 | 2020-07-15 | 一种泰乐菌素降解菌及其筛选方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010680149.4A CN111893059B (zh) | 2020-07-15 | 2020-07-15 | 一种泰乐菌素降解菌及其筛选方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111893059A true CN111893059A (zh) | 2020-11-06 |
| CN111893059B CN111893059B (zh) | 2021-12-21 |
Family
ID=73191377
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010680149.4A Active CN111893059B (zh) | 2020-07-15 | 2020-07-15 | 一种泰乐菌素降解菌及其筛选方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111893059B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109652350A (zh) * | 2019-03-01 | 2019-04-19 | 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 | 一株泰乐菌素降解菌及其应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103008339A (zh) * | 2012-09-21 | 2013-04-03 | 浙江大学 | 一种碱性铬污染土壤的微生物修复方法 |
| EP3026125A1 (en) * | 2014-11-26 | 2016-06-01 | ATOTECH Deutschland GmbH | Means and methods for bioremediating glycol ethers |
| CN106116874A (zh) * | 2016-06-27 | 2016-11-16 | 安徽金联地矿科技有限公司 | 一种土壤修复治理用缓释调理剂 |
| CN107557315A (zh) * | 2017-09-12 | 2018-01-09 | 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 | 一株泰乐菌素降解菌及其应用 |
| US20180229282A1 (en) * | 2017-02-14 | 2018-08-16 | Northeast Agricultural University | Device and method for remedying heavy-metal-polluted soil with microorganism |
| CN109652350A (zh) * | 2019-03-01 | 2019-04-19 | 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 | 一株泰乐菌素降解菌及其应用 |
-
2020
- 2020-07-15 CN CN202010680149.4A patent/CN111893059B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103008339A (zh) * | 2012-09-21 | 2013-04-03 | 浙江大学 | 一种碱性铬污染土壤的微生物修复方法 |
| EP3026125A1 (en) * | 2014-11-26 | 2016-06-01 | ATOTECH Deutschland GmbH | Means and methods for bioremediating glycol ethers |
| CN106116874A (zh) * | 2016-06-27 | 2016-11-16 | 安徽金联地矿科技有限公司 | 一种土壤修复治理用缓释调理剂 |
| US20180229282A1 (en) * | 2017-02-14 | 2018-08-16 | Northeast Agricultural University | Device and method for remedying heavy-metal-polluted soil with microorganism |
| CN107557315A (zh) * | 2017-09-12 | 2018-01-09 | 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 | 一株泰乐菌素降解菌及其应用 |
| CN109652350A (zh) * | 2019-03-01 | 2019-04-19 | 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 | 一株泰乐菌素降解菌及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| DONGYAN LONG ET AL.: "Cr(VI) reduction by a potent novel alkaliphilic halotolerant strain Pseudochrobactrum saccharolyticum LY10", 《JOURNAL OF HAZARDOUS MATERIALS》 * |
| MENGKE-LI ET AL.: "Exploration on the bioreduction mechanism of Cr(Ⅵ) by a gram-positive bacterium: Pseudochrobactrum saccharolyticum W1", 《ECOTOXICOLOGY AND ENVIROMENTAL SAFETY》 * |
| 刘艳薇 等: "除氨菌复配对鸡粪堆肥除臭和腐熟效果的影响", 《河南农业科学》 * |
| 张盼 等: "高效纤维素优势分解菌的筛选和鉴定", 《中国土壤与肥料》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109652350A (zh) * | 2019-03-01 | 2019-04-19 | 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 | 一株泰乐菌素降解菌及其应用 |
| CN109652350B (zh) * | 2019-03-01 | 2022-01-28 | 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 | 一株泰乐菌素降解菌及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111893059B (zh) | 2021-12-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107893040B (zh) | 一种微生物群体感应信号分子降解菌及其在病害防治中的应用 | |
| CN109182178B (zh) | 一株具有铬耐受和Cr(VI)去除能力的菌株及其在原位修复中轻度铬污染土壤中的应用 | |
| CN112251382B (zh) | 一种恶臭假单胞菌db-1及其培养方法和应用 | |
| CN110713946B (zh) | 一株可降解双酚a和磷酸三苯酯的鞘氨醇菌 | |
| CN111154687A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌及其在降解环氧乙烷中的应用 | |
| CN112574929B (zh) | 一株吉林类芽孢杆菌ypg26及其医用用途 | |
| CN112410253B (zh) | 枯草芽孢杆菌及其抗黄曲霉和高产聚谷氨酸的应用和方法 | |
| CN111117931A (zh) | 一种发酵乳杆菌及其在降解环氧乙烷中的应用 | |
| CN106011040B (zh) | 一株降解氧氟沙星的苍白杆菌及其应用 | |
| WO2021147262A1 (en) | Method for screening bacteria capable of degrading ethylene oxide | |
| CN113980856B (zh) | 假单胞菌新菌种及其应用 | |
| CN106906158B (zh) | 一株含油污泥降解功能菌及其应用 | |
| CN111893059B (zh) | 一种泰乐菌素降解菌及其筛选方法与应用 | |
| CN113957004A (zh) | 一株金黄杆菌及在制备盐生植物附生修复养护菌剂中的应用 | |
| CN117229960A (zh) | 一种海水芽孢杆菌及其在养殖尾水治理中的应用 | |
| CN115125178B (zh) | 一株具有四环素类抗生素降解功能的类芽孢杆菌、方法及应用 | |
| CN113249276B (zh) | 一种蜡样芽孢杆菌及其应用 | |
| CN101045911A (zh) | 一种降解酚类有机物的方法及其专用菌群 | |
| CN108410760B (zh) | 一株高效降解氰戊菊酯的酯香微杆菌及其应用 | |
| CN112961794A (zh) | 一种高效吸附汞的复合菌制剂及应用 | |
| CN114657097B (zh) | 一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌lgt-1及其应用 | |
| CN115537352B (zh) | 一种降解氯霉素的解鸟氨酸拉乌尔菌、菌剂及其应用 | |
| CN114134079B (zh) | 一株四环素类抗生素降解菌、方法及应用 | |
| CN108949627B (zh) | 一株微生物采油菌w-y7及其应用 | |
| CN113462592B (zh) | 一种红霉素降解菌iurm f69及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240221 Address after: 266101 Shandong Province, Qingdao city Laoshan District Songling Road No. 189 Patentee after: Shandong Energy Research Institute Country or region after: China Address before: 266101 Shandong Province, Qingdao city Laoshan District Songling Road No. 189 Patentee before: QINGDAO INSTITUTE OF BIOENERGY AND BIOPROCESS TECHNOLOGY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES Country or region before: China |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240528 Address after: Room 312, Building 6, No. 61 Guangsheng Road, High tech Zone, Qingdao City, Shandong Province, 266000 Patentee after: Qingdao High Energy Hecheng Biotechnology Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 266101 Shandong Province, Qingdao city Laoshan District Songling Road No. 189 Patentee before: Shandong Energy Research Institute Country or region before: China |