CN107557315A

CN107557315A - 一株泰乐菌素降解菌及其应用

Info

Publication number: CN107557315A
Application number: CN201710816643.7A
Authority: CN
Inventors: 李兆君; 孟应宏; 冯瑶; 文贻荣; 文贻宣
Original assignee: Hunan Zhongke Agriculture Co ltd; Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Current assignee: Hunan Zhongke Agriculture Co ltd; Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Priority date: 2017-09-12
Filing date: 2017-09-12
Publication date: 2018-01-09
Anticipated expiration: 2037-09-12
Also published as: CN107557315B

Abstract

本发明公开了一株泰乐菌素降解菌及其应用，属于微生物降解抗生素残留技术领域。泰乐菌素降解菌LZ1，为无色杆菌(Achromobacter SP.)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年4月25，保藏编号为CGMCC No.14071，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明利用土壤为筛选的最初原料，所得到的菌株及制成的菌剂可直接用于泰乐菌素企业废弃物的处理，也有可能应用于周边被泰乐菌素污染的土壤与水体环境的修复。

Description

一株泰乐菌素降解菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物降解抗生素领域，具体涉及一株泰乐菌素降解菌及其应用。

背景技术

泰乐菌素(Tylosin)，也被称作泰乐霉素或者是泰农，是由美国科学家在1959年在对一株被称为弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)的研究当中所获得的一种大环内酯类抗生素。泰乐菌素为一种白色板状结晶，微溶于水，呈碱性。泰乐菌素的分子式为：C₄₆H₇₇NO₁₇，相对分子质量：916.1，化学结构式为：

泰乐菌素是一种广谱抗生素，对支原体有特效，对多种G+菌具有很强的抗菌作用，还对部分G－菌、弯杆菌、螺旋体及球虫具有抑制作用。

目前，泰乐菌素环境残留问题已经成为国内外普遍关注的热点环境问题之一。至今，国内外有关泰乐菌素生物降解与降解菌株筛选方面的研究报道也不是很多。

因此，找到一种能采用快速、高效的降解泰乐菌素的菌株就成了亟待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种快速、高效的降解泰乐菌素菌株，从而解决泰乐菌素环境残留的问题。

本发明的技术方案为：一株泰乐菌素降解菌LZ1，为无色杆菌(AchromobacterSP.)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年4月25，保藏编号为CGMCC No.14071，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

泰乐菌素降解菌LZ1或其代谢产物在泰乐菌素降解上的应用。

泰乐菌素降解菌LZ1或其代谢产物在修复被泰乐菌素污染的土壤或水体上的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用土壤为筛选的最初原料，得到一株能高效降解泰乐菌素的无色杆菌LZ1，该菌株及制成的菌剂可直接应用于泰乐菌素企业废弃物的处理，也有可能应用于周边被泰乐菌素污染的土壤与水体环境的修复。

附图说明

图1为泰乐菌素标准溶液高效液相色谱图；

图2为泰乐菌素高效液相色谱标准曲线图；

图3为泰乐菌素降解菌株降解效率测定图。

具体实施方式

实施例1菌株的采集

菌样品采集与处理

采集土壤，并称取土壤5g，加至装有95mL灭菌蒸馏水的三角瓶中(250mL，内含玻璃珠)，在恒温摇床上以30℃，200r/min震荡30min，取出后静置；

菌株分离

吸取100uL土壤浸出液，涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，置于30℃条件下遮光培养2天。牛肉膏蛋白胨固体培养基的组成为：牛肉膏3g，蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水定容至1000mL，用1mol/L氢氧化钠调节pH至7.0～7.2后灭菌。

菌株纯化

取平板上分离得到的单菌落，在牛肉膏蛋白胨固体培养基平板划线，进一步分离和纯化；此步骤可重复2～3次，直至得到单一菌落；然后将单菌落接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于30℃，150r/min震荡条件下，遮光培养2天；

牛肉膏蛋白胨固体培养基的组成为：牛肉膏3g，蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水定容至1000mL，用1mol/L氢氧化钠调节pH至7.0～7.2后灭菌。

牛肉膏蛋白胨液体培养基的组成为：牛肉膏3g，蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水定容至1000mL，用1mol/L氢氧化钠调节pH至7.0～7.2后灭菌。

菌株降解功能验证

首先，对纯化得到的菌株进行活化培养，用牛肉膏蛋白胨培养基活化培养2天，得到菌株培养液。然后取培养液，在泰乐菌素浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线，在30℃条件下，遮光培养2天。能够生长的菌株即为对泰乐菌素具有耐药性的菌株。观察菌株在不同浓度泰乐菌素平板上生长状况，可以得到菌株适宜的对泰乐菌素具有耐药性的浓度与范围。菌株实验结果见表1。

牛肉膏蛋白胨液体培养基，其配方为：牛肉膏3g，蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水定容至1000mL，用1mol/L氢氧化钠调节pH至7.0～7.2后灭菌。

牛肉膏蛋白胨固体培养基，其配方为：牛肉膏3g，蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水定容至1000mL，用1mol/L氢氧化钠调节pH至7.0～7.2后灭菌。

无机盐固体培养基的组成为：氯化铵1g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁0.2g，氯化钠1g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，调节pH至7.0，高压灭菌。在倒平板前，在培养基中添加泰乐菌素，添加浓度依次为25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L，摇匀。

无机盐液体培养基的组成为：氯化铵1g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁0.2g，氯化钠1g，蒸馏水1000mL，调节pH至7.0，高压灭菌。在培养基中添加泰乐菌素，添加浓度为100mg/L，摇匀。

表1不同泰乐菌素浓度下菌株生长状况

注：+代表生长；++代表大量生长；—代表未生长。

由表1可知，泰乐菌素的浓度范围在低浓度(≤25mg/L)、中低浓度(25～50mg/L)、中高浓度(50～100mg/L)、高浓度(100～200mg/L)时，都可得到耐药菌株。

5)菌株降解活性鉴定

将对泰乐菌素具有耐药性的菌株转接到牛肉膏蛋白胨液体培养基上进行活化，并将活化的菌液按1％的接种量转接到添加泰乐菌素的无机盐液体培养基中，30℃，150r/min震荡暗培养培养2天，最后用高效液相色谱法测定菌株对泰乐菌素的降解率，其高效液相色谱图见图1；试管斜面保存不同浓度降解率高的菌株，4℃储存。

标准曲线的绘制

准确称取泰乐菌素标准品0.050g，加入少量甲醇溶解，然后转移到10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，配制成5mg/mL的标准储备液。标准溶液(12.5、25、50、100、200、400mg/L)均由储存标样加甲醇稀释配制而成。以上标准储备液和标准溶液均保存在4℃冰箱中。用高效液相色谱仪进行测定，得到泰乐菌素浓度x与峰面积y的线性回归方程为y＝222216x+721806，R²＝0.9999，见图2。

色谱条件：采用Sunfire C18色谱柱(150mm×4.6mm，3.5um，Waters，USA)；流动相为0.01％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；流速为1.0mL/min；柱温40℃；进样体积10uL；检测波长为274nm。洗脱程序：0～6min，80％～0％A，20％～100％B；6～7min，0％～80％A，100％～20％B；7～10min，80％A，20％B。

样品上机检测，得到精确的降解率

取待测液1mL，加入5mL甲醇，摇匀，10000r/mim离心15min，取上清液，用0.22um针筒式微孔滤膜过滤得到滤液，然后用高效液相色谱仪进行测定，根据线性回归方程计算出泰乐菌素的含量与降解率。

实施例2泰乐菌素降解菌株降解效率测定

在无机盐液体培养基中添加100mg/L泰乐菌素，摇匀，接入单菌落，置于30℃，150r/min条件下，遮光培养。色谱条件：采用Sunfire C18色谱柱(150mm×4.6mm，3.5um，Waters，USA)；流动相为0.01％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；流速为1.0mL/min；柱温40℃；进样体积10uL；检测波长274nm。洗脱程序：0～6min，80％～0％A，20％～100％B；6～7min，0％～80％A，100％～20％B；7～10min，80％A，20％B。取待测液1mL，加入5mL甲醇，摇匀，10000r/mim离心15min，取上清液，用0.22um针筒式微孔滤膜过滤得到滤液，然后用高效液相色谱仪进行测定，如图3，根据线性回归方程计算出泰乐菌素降解率。

从图3看出，菌株编号A的降解率最高，达到74％左右。显示该菌可用于泰乐菌素的降解。该菌株及制成的菌剂可直接应用于泰乐菌素企业废弃物的处理，也可应用于周边被泰乐菌素污染的土壤与水体环境的修复。我们将菌株编号A的菌株送到专业的鉴定机构(上海美吉生物医药科技有限公司)进行了测序鉴定，结果显示，该菌株为无色杆菌(Achromobacter SP.)，我们将其命名为LZ1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年4月25，保藏编号为CGMCC No.14071，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims

1.一株泰乐菌素降解菌LZ1，为无色杆菌(Achromobacter SP.)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年4月25，保藏编号为CGMCCNo.14071，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

2.根据权利要求1所述的泰乐菌素降解菌LZ1或其代谢产物在泰乐菌素降解上的应用。

3.根据权利要求1所述的泰乐菌素降解菌LZ1或其代谢产物在修复被泰乐菌素污染的土壤或水体上的应用。