CN111871246B - 抗体-树脂偶联设备和方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及抗体‑树脂偶联设备和方法。一种抗体‑树脂偶联设备快速且高效地活化树脂珠粒并将所述树脂珠粒偶联到抗体，同时防止所述珠粒分解和交联，从而改进下游柱纯化过程、延长所述树脂珠粒的可用寿命并提高得到的树脂‑抗体复合物的分子捕获效率，以允许改进因子VIII分子或其它药物化合物的分离和纯化。

Description

抗体-树脂偶联设备和方法
本申请是申请日为2018年7月30日、申请号为“201880055007.X”、名称为“抗体-树脂偶联设备和方法”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年8月4日提交的美国申请第62/541,601号的权益和优先权，所述美国申请的内容通过引用的方式并入。
技术领域
本公开涉及用于活化树脂并将抗体偶联到树脂的装置和方法。
背景技术
血友病是防止血液正常凝固并且以出血为特征的遗传性出血病状，所述出血可能自发地或在轻微创伤后发生。血友病通常与必需的血液凝固蛋白因子VIII(还称为抗血友病因子(AHF))的缺乏相关联。在人类中，因子VIII由F8基因编码。该基因的缺陷导致了血友病A(“经典”血友病)，一种导致血浆凝固时间延长的隐性的X连锁凝血病状。另一种类型的血友病是发生在F8基因正常但出现抑制因子VIII的自身抗体从而产生了阻碍凝血的功能缺陷的患者身上的获得性血友病A(AHA)。
向血友病患者提供静脉因子VIII可以暂时改善凝固。针对血友病的许多治疗，如可从夏尔制药公司(Shire Plc)(马萨诸塞州列克星敦市(Lexington,MA))获得的以商标RECOMBINATE、ADVATE、ADYNOVATE、HEMOFIL和OBIZUR销售的血友病治疗涉及在实验室中合成和纯化的重组因子VIII蛋白。
然而，产生此类治疗的主要限制因素是分离和纯化因子VIII分子的能力。一种方法是使用因子VIII的抗体来捕获柱中的分子。将抗体与树脂偶联并装载到柱中，并且使含有表达的因子VIII分子的培养基从柱中穿过。
该纯化过程需要高精度来正确地操纵树脂。由于树脂昂贵并且如果不正确地加工则容易损坏或浪费，因此该纯化过程执行起来成本极高。当树脂未与抗体充分偶联时，树脂珠粒之间可能发生交联。如果不仔细地处理树脂，则珠粒还可能分解。分解的或交联的树脂珠粒会堵塞柱，从而产生过大的背压并且导致提取过程失败。因此，树脂处理程序的困难和树脂-抗体偶联技术的局限性使血友病药物的制造过程昂贵且复杂。
发明内容
本文所述的设备高效地活化了树脂珠粒并将其偶联到抗体，同时防止了珠粒的分解和交联，从而改进下游柱纯化过程、延长树脂珠粒的可用寿命并提高得到的树脂-抗体复合物的分子捕获效率，以允许改进包含因子VIII分子在内的各种生物化合物的分离和纯化。
尽管本文参考设备在FVIII纯化中的用途对所述设备进行了总体描述，但是应当理解，所述设备和相关方法可用于将所有类型的抗体偶联到多孔树脂。本公开的发明可以应用于其它亲和树脂，特别是用于其它酶替代治疗产物或任何其它感兴趣的药物或生物分子。其适用于含蛋白质或胺的配体与树脂支撑体之间的交联化学作用。树脂可以是琼脂糖、玻璃或其它已知的各种密度的多孔树脂。所用抗体可以是多克隆的或单克隆的。虽然所述装置在本文中主要被描述为可用于将抗体偶联到树脂，但是本发明可以兼容羟基偶联到氨基的任何化学物质。应当理解，本发明可与可以用于任何生物化合物的亲和色谱纯化的任何已知抗体，包含肽、核酸、碳水化合物和任何具有氨基的配体。
所述设备总体上是一种混合装置，所述混合装置包含具有用于引入树脂珠粒和各种流体的入口的容器、用于精确施加活化溶液的分散管、用于支撑树脂珠粒并允许流体流过的网筛、用于在流体流过时混合珠粒的搅拌器以及用于排出流体的在网筛下方的出口。设备的部件可以由不锈钢或其它弹性材料制成。在操作时，缓冲溶液中的树脂珠粒在经由分散管通过分散CNBr和乙腈被活化之前被倒入容器中。在流体通过出口排出之前，使用搅拌器将珠粒搅拌一小段时间(大约3分钟或更短的时间)。在加入偶联溶液和单克隆抗体之前，可以用水或其它缓冲液洗涤珠粒。珠粒和抗体在搅拌下培育一段设定的时间，同时装置维持低温并监测溶液的pH。将抗体偶联的树脂捕获在网筛上并从装置中取出以供使用。装置可以用于各种树脂和抗体类型。系统允许快速且均匀地活化大量树脂，而不使树脂珠粒破碎并避免珠粒之间的交联。这提供了更有效的树脂-抗体偶联，同时控制化学作用以延长树脂珠粒的可用寿命。
装置的一个关键方面是分散管，针对CNBr活化溶液到树脂的分散对所述分散管进行了优化。这允许CNBr在受控的时间周期内均匀分布并且有助于快速(优选地，在约3分钟内)实现加入活化溶液。这些因素对于抗体与树脂的均质偶联很重要，因为所述因素减少了向树脂/缓冲液混合物中加入溶液的变化，所述变化可以暂时超过缓冲液的缓冲能力。这种可变性将会导致不期望的异脲交联，所述异脲交联将会发生水解并增加抗体浸出或潜在地与其它亲核试剂交换从而污染树脂或导致浸出增加。控制对活化溶液的定时有助于对抗体偶联的下游过程控制，因为这样允许最佳的树脂活化，然后在树脂上的大量活化的基团丢失之前快速加入抗体。
在某些方面，本公开涉及一种用于将抗体偶联到树脂的装置。所述装置包含混合容器，所述混合容器通过跨所述容器伸展的网筛分成上部和下部，所述上部具有至少一个入口并且所述下部具有至少一个出口，并且所述网筛的孔径介于5与80μm之间。所述装置进一步包含安置在所述上部内的搅拌器和在所述搅拌器上方的分散设备。所述分散设备包含形成管腔的细长管状结构。所述管状结构具有：近侧部分，所述近侧部分竖直延伸到所述混合容器的外部、具有向上开口的入口；远侧部分，所述远端部分具有封闭端和水平定位于所述上部内的多个面向下的孔；以及弯头，所述弯头连接所述远侧部分与所述近侧部分。
所述搅拌器可以包含转子和旋转叶轮，所述旋转叶轮包含轮毂和从所述轮毂沿相反方向垂直延伸的至少两个叶片。每个叶片具有大致横向于所述转子的轴线的轴线，所述轮毂被配置成在所述转子的所述轴线上旋转。搅拌器被配置成旋转以向容器中的流体施加力，从而提供提升力并保持珠粒在网筛上移动。所述网筛还可以具有被配置成支撑所述网筛并防止所述网筛弯曲的支撑梁。所述网筛可以被配置成可从所述容器移除。
所述搅拌器以足以快速混合树脂珠粒而不使其破碎的速度旋转。搅拌器转速可以在约10与50RPM之间，并且在特定实施例中，速度为20或35RPM。在实施例中，所述叶片具有固定节距和圆形边缘。
在相关方面，本公开涉及一种分散管设备，所述分散管设备包含形成具有圆形截面的管腔的细长管状结构。所述管状结构包含具有面向上的入口的近侧部分、具有封闭端的远侧部分以及平行于所述远侧部分的轴线布置成两行或两行以上的介于4与100个—并且优选地，约8至30个—之间的面向下的孔。所述行彼此以介于约15度与约60度之间的间隔定位在所述远侧部分上。所述管状结构还包含介于所述远侧部分与所述近侧部分之间的弯头，所述弯头包括所述管状结构的弯部，所述弯部用于使所述入口定向成使得所述入口在基本上垂直于所述远侧部分的所述轴线的方向上开口。
在一些实施例中，所述分散设备的所述远侧部分具有三行平行的面向下的孔。在一些实施例中，具有介于12与25个之间的面向下的孔，并且在优选的实施例中，有21个孔，其中10个、8个和3个孔成行布置。在一些实施例中，所述行具有不同数量的孔，而在其它实施例中，所述行具有相同数量的孔。所述行的孔可以介于约15度与105度之间的间隔定位。弯头部分中的弯部使远侧部分与近侧部分相对于彼此定向成介于60度与120度之间并且在一些实施例中为约80-100度，并且在优选的实施例中为约90度。所述管状结构可以由不锈钢制成。所述分散设备还可以包含用于打开和关闭所述入口的阀和可连接到所述入口以用于在使用前容纳分散流体的漏斗。
在相关方面，本公开涉及用于活化树脂的方法。所述方法涉及将悬浮在水中的树脂珠粒插入混合容器中，其中所述混合容器包含分散设备、孔小于所述树脂珠粒的网筛和安置在所述网筛上方的搅拌器。所述树脂珠粒可以包括如CL-4B或CL-2B珠粒等琼脂糖或者由GE医疗生命科学公司(GE Healthcare Life Sciences)(马萨诸塞州莫尔伯勒(Marlborough,MA))以CAPTO商标出售的琼脂糖珠粒。所述方法进一步包含经由所述分散设备将包括CNBr和乙腈的活化溶液分散到所述树脂珠粒上并将所述搅拌器搅拌少于5分钟。然后，所述方法涉及通过所述网筛排出所述活化溶液，从而使活化的树脂珠粒支撑在所述网筛上。
在一些实施例中，所述方法还涉及用流体洗涤所述活化的树脂珠粒。洗涤可以包含用所述流体填充所述混合容器、在搅拌所述搅拌器的同时进行培育以及从所述混合容器中排出所述流体。所述流体可以是缓冲液、水或包括碳酸氢钠和氯化钠的溶液。搅拌可以在10RPM与40RPM之间并且优选地为约20RPM或35RPM。在搅拌的同时进行培育可以持续少于4分钟并且优选地少于3分钟。
附图说明
图1A-C示出了混合容器的视图。图1A示出了侧视截面视图；图1B示出了俯视截面视图；并且图1C示出了前视截面视图。
图2A-G示出了分散管和分散管的孔的优选布置。图2A示出了分散管的侧视图。
图2B示出了具有特定孔配置的分散管的侧视图。图2C示出了分散管的径向截面，示出了钻取孔的角度。图2D示出了具有一行8个孔的位置的分散管的侧视图。图2E示出了分散管的径向截面，示出了钻取图2D的孔的角度。图2F示出了具有一行10个孔的位置的分散管的侧视图。图2G示出了分散管的径向截面，示出了钻取图2F的孔的角度。
图3示出了活化溶液的可拆卸固持容器或漏斗和将漏斗连接到分散管的阀。
图4A-C示出了搅拌器的视图。图4A是搅拌器的侧视截面视图。图4B是搅拌器和叶片的上下颠倒透视图。图4C是图4B的轮毂和叶片的特写视图。
具体实施方式
用于从培养基中分离和纯化分子的装置是药物制造不可或缺的。许多药物涉及在培养物中生长并且然后必须从培养基中纯化和提取的重组蛋白。这些化合物的纯化需要对试剂和材料以及专用设备进行精确控制。由于制备和使用这些材料的复杂性，需要装置来生成纯化基质，以便以更高效、准确且成本有效的方式提取药物。此类装置提高了重组蛋白的可用性，所述重组蛋白是治疗多种疾病所必需的。
许多药物涉及当引入患者体内时递送期望的生化反应的重组蛋白。例如，如RECOMBINATETM和
Figure BDA0002609781580000051
等血友病药物是静脉注射的因子VIII分子，所述静脉注射的因子VIII分子改善了血友病患者的血液凝固，以控制和防止出血发作。使用这些药物进行的治疗通过增加因子VIII的血浆水平以暂时校正这些患者的凝血缺陷来在有效给药期内使凝固时间正常化。因子VIII替代药物可以用于常规预防和减少出血，或者因子VIII替代药物可以在手术前、手术中和手术后施用以控制血液凝固。此类治疗的目标是将血浆因子VIII活性水平维持在处于或高于期望的水平。例如，对于如早期出血、轻度肌肉出血或轻度口腔出血发作等小出血发作，可以期望施用达到正常因子VIII水平的约20-40％的剂量。对于如肌肉出血、口腔出血、明确的关节积血和已知的外伤等中度出血，可能需要正常因子VIII活性的30-60％。为了治疗如明显的胃肠道出血、颅内、腹内或胸腔内出血、中枢神经系统出血、咽后或腹膜后间隙或髂腰肌鞘出血、骨折或头部外伤等大出血，可能需要60-100％的因子VIII水平。
RECOMBINATETM、
Figure BDA0002609781580000052
和
Figure BDA0002609781580000053
是可以用于暂时替代患者缺失的因子VIII以实现止血的重组因子VIII分子的实例。例如，
Figure BDA0002609781580000054
是由基因工程化中国仓鼠卵巢细胞系合成的2,332个氨基酸组成的经过纯化的糖蛋白。
Figure BDA0002609781580000055
是与一或多种聚乙二醇分子共价缀合的经过纯化的
Figure BDA0002609781580000056
分子，所述共价缀合减少了与生理因子VIII清除受体(LRP1)的结合并且显示出延长的终末半衰期。
Figure BDA0002609781580000057
是猪因子VIII的重组类似物。天然存在的猪因子VIII中存在的B结构域被具有二十四个氨基酸的连接子替代。一旦被激活，所得到的药物就具有与内源性人类因子VIII相当的活性。
为了制造这些药物—以及其它涉及重组蛋白的药物—必须从培养基中纯化分子。通常，重组细胞系表达因子VIII蛋白并将其分泌到细胞培养基中。分子然后从培养基中纯化。纯化过程可以涉及将培养基引入到一或多个免疫亲和色谱柱，其中通过将单克隆抗体固定到树脂上制备的纯化基质选择性地分离因子VIII。所述方法还可以涉及一或多个过滤步骤。例如，
Figure BDA0002609781580000058
是使用针对因子VIII的小鼠单克隆抗体通过免疫亲和色谱从汇集的人类血浆中分离的因子VIII蛋白，随后进行离子交换色谱步骤以进一步纯化。
单克隆抗体对于捕获因子VIII和其它靶分子特别有用。选择性地纯化靶分子的纯化基质是通过将抗体偶联到树脂来制成的。制备树脂并且偶联抗体是困难的，因为化学作用的微小变化会影响结合过程和所得到的纯化基质。本文所公开的装置提供了抗体与树脂珠粒的改进的结合。控制树脂偶联过程的化学作用以生成具有更高功效和寿命的抗体-树脂复合物。通过适当的制造和处理，树脂可以持续存在若干年并且在需要替换之前可以重复使用数百次。因为树脂珠粒每升可以花费数万美元，所以对于制造商来说，重要的是有可靠的过程来生产持久的抗体-树脂复合物，而不必浪费大量的树脂。
如上所述，化学作用的小的畸变会降低树脂产物的功能。树脂必须快速且精确地制备以实现大规模的均质产物。所公开的装置允许可重复并且产生标准化产物的快速均质反应。在没有此类装置的情况下，所得到的树脂产物将会具有在树脂中产生浸出问题的微小非均质性。如果树脂没有均质地活化，则珠粒可以彼此交联，从而在树脂中形成团块。树脂中的团聚和非均质性导致了下游纯化方案有填装问题。例如，团聚在一起的树脂对从其中穿过的流体的渗透性可能较低并且导致柱中压力累积。非均质树脂可能导致对靶分子的捕获效率低下，或者非均质树脂可能仅仅是不能使用并需要丢弃。
所公开的装置还防止珠粒在加工步骤期间过度破碎。如果超过约2％的珠粒破碎，则所得到的树脂将会过于稠密并且将会在装载到柱中时过度压缩。因此，破碎的珠粒会在柱中产生背压。如果在制造期间有太多的树脂破碎，则将会需要丢弃一部分或全部树脂，从而导致过度浪费和开支。本文所公开的装置避免了所述问题和其它问题。所述装置优化了树脂制备，以确保树脂在下游的柱中正确地填装。
除了改进的柱流体动力学之外，使用所公开的设备偶联树脂还存在另外的益处。所述设备允许比现有技术装置更大的树脂再现性。所得到的树脂在配体密度、珠粒交联和珠粒完整性方面更均匀。这提供了更大的稳定性、制造过程中的变化的减少以及更大的产量。结果是产物具有更长的可用寿命，所述产物可以用于更大数量的生产周期，而无抗体/配体浸出和结合能力丧失。这降低了酶或其它生物产物的生产成本。
所述装置可以用于多种类型的偶联化学作用。对于抗体，偶联通常是基于胺的。抗体可以有20-30个氨基和另外20-30个羧基。本文所公开的偶联技术可以用于任何抗体或甚至更小的分子的偶联。在一些实施方案中，单克隆抗体偶联到树脂，并且在其它实施方案中，多克隆抗体偶联到树脂。所述技术也可以用于偶联肽。无论如何，所述技术的目标是实现分子(抗体、肽或其它)与树脂珠粒的均质偶联。将分子均质地连接到树脂使所得到的产物具有可预测的浸出行为和更久的可用性。
附图中示出的偶联装置快速且有效地活化了树脂并偶联了抗体，以减少浪费、提高偶联效率和药物回收率。如以上所描述的，所述装置通常包含混合容器、分散管以及搅拌器和网筛。
图1A-C示出了偶联设备100。图1A示出了侧视截面视图；图1B示出了俯视截面视图；并且图1C示出了前视截面视图。设备100包含混合容器110，所述混合容器容纳下文描述的其它元件并且充当各个混合步骤的混合容器。容器110具有多个入口120和多个出口130。容器110的顶部存在铰接的舱口150，在所述铰接的舱口处，可以将树脂珠粒插入。树脂珠粒可以是如CAPTOTM、CL-4B或CL-2B珠粒等琼脂糖珠粒、可从GE医疗生命科学公司(马萨诸塞州莫尔伯勒)获得并且通常以水悬浮液的形式插入到容器110中。容器110中一次可以激活高达50升的树脂珠粒—并且通常约为22-39升。一旦在容器110内部，珠粒就由网筛310支撑，所述网筛由具有大约10-80μm的孔的网格材料制成，所述孔足够小以防止树脂珠粒进入到容器110的下部部分。在优选实施例中，孔大约为30μm。在活化和偶联过程期间，珠粒通过搅拌器410(在图4A-C中示出)混合，这防止了珠粒沉淀在网筛上并且有助于维持均质性。
容器包含分散管210，所述分散管在图2A-G中有更详细的描述，通过所述分散管将CNBr和乙腈的活化溶液添加到珠粒中。分散管210被设计成将活化溶液均匀地分布在珠粒上，同时搅拌器410保持珠粒移动以防止树脂团聚。如下所述，搅拌器410以足以为珠粒提供提升力并保持其移动但是足够温和以防止珠粒破碎的速度旋转。活化后，活化溶液可以通过排放口130排出，从而将活化的珠粒留在网筛310上。
如所期望的，可以经由分散管210、入口120或舱口150将各种流体和缓冲液插入容器110中。活化过程、洗涤过程和偶联过程需要不同的溶液。示范性树脂偶联过程从树脂通过舱口150倒入容器110中开始。树脂包含水悬浮液中的树脂珠粒。CNBr和乙腈的活化溶液通过分散管210分散到树脂上，同时搅拌器410混合树脂，从而保持珠粒在网筛310上方移动。可以使用少量乙腈来追踪分散管中的活化溶液。珠粒可以用活化溶液洗涤长达5分钟以活化树脂。优选地，活化进行少于3分钟。
可以加入各种缓冲液和偶联溶液以及悬浮在偶联溶液中以将其偶联到珠粒上的抗体。在所有的洗涤和偶联步骤下，如在活化期间，搅拌器旋转以维持珠粒的恒定运动从而防止珠粒粘在网筛上，并且均匀地分布各种流体和缓冲液并确保接触到珠粒的所有表面。洗涤步骤和其它混合步骤可以是连续的，其中流体连续流入入口并流出出口，或者可以填充容器，并且混合可以发生一段设定的时间，从几秒钟到几分钟或者甚至几个小时。容器110还包含温度控件，使得内容物可以在混合期间在期望的温度下培育。设备100还可以包含一或多个探针190，如温度计和/或pH探针，以在操作期间监测容器内部的情况。
网筛310被设计成是可移除的并且由一系列夹具330固持在位。容器110还包含耳轴175，使得设备可以安装在枢轴上。这允许设备倾斜，使得用户可以根据需要填充容器或从容器中倒出液体。倾斜功能允许加工过的树脂从舱口倒出而不是手动舀出，这防止对珠粒和网筛上的另外的应力。耳轴175可以在使用过程中锁定在适当的位置，使得其在混合时保持静止。重要的是网筛310和搅拌器410在混合期间保持基本上水平以实现珠粒在容器中的适当移动并确保珠粒均匀地暴露于各种流体混合物。
图2A-G示出了分散管210。如图2A所示，分散管210总体上是具有长水平部分230、竖直部分220和弯头240的中空管。水平部分230总体上是以规则或半规则的间隔打孔的一段金属管。所述一段水平部分230跨容器伸展。在所示实施例中，分散管210具有多个孔231，所述多个孔的位置通过其在所述一段管210之下的距离来标记(在图2B、2D和2F中)。孔231允许CNBr活化混合物流过。所述孔一起提供了活化混合物在下面的树脂上的可再现均质分布。分散管210特别是结合搅拌器410防止了CNBr分布不一致并避免了局部化的pH峰值，所述局部化的pH峰值会导致不正确的偶联化学作用并且增加的配体浸出。
分散管210的竖直部分220被配置成延伸出容器110，而水平部分230在搅拌器410和网筛310上方定位于容器110内。竖直部分220包含入口225，通过所述入口，CNBr可以流入并引入混合容器110中。水平部分230具有封闭端235和多个孔231。尽管图2B-G中示出了孔的一种可能的布置，但是也可以设想其它类似的孔布置。孔应当沿分散管的水平部分分布，以实现对以下混合的树脂的充分覆盖。
图2B-C示出了沿水平部分230的底部边缘钻取的三个孔的位置。图2B显示了分散管的径向截面。如所描绘的，孔位于从竖直部分220的轴线229测量的11.75英寸、15.75英寸和26.50英寸处。图2C示出了水平部分的横向截面。如图2C所示，通过水平部分的底部点钻取孔。
图2D-E示出了与水平部分230的底部边缘成45度角钻取的八个孔的位置。图2D示出了分散管的径向截面，示出了从竖直部分220的轴线229对孔的测量结果。如所描绘的，孔位于3.00英寸、4.00英寸、6.00英寸、8.00英寸、19.50英寸、21.50英寸、23.50英寸和25.00英寸处。图2E示出了水平部分的横向截面，指示了钻取这组孔的角度。
图2F-G示出了在分散管210的另一侧与一组八个孔(示出在图2D中)成45度角钻取的另外十个孔的位置。图2F示出了分散管的径向截面，示出了从竖直部分220的轴线229对孔的测量结果。如所描绘的，孔位于2.50英寸、3.50英寸、4.50英寸、6.50英寸、9.50英寸、11.50英寸、21.00英寸、23.00英寸、24.00英寸和26.00英寸处。图2G示出了水平部分的横向截面，指示了钻取这组孔的角度。
如图2B-G所描绘的，所述组孔布置成钻入水平部分230的下半部分中的三个平行的行。所述三行中的每一行具有不同数量的孔231，并且每个孔沿着水平部分230以不同于所有其它孔的距离钻取。孔的位置是确保活化溶液在树脂上均匀分布的重要考虑因素。基于盐建模实验，发现孔的这种布置是最佳的。然而，也可以使用孔的其它布置。可以根据需要调整孔的精确数量、所述孔彼此之间的关系、行数、钻取孔的角度、孔的大小以及其它因素。
使用分散管添加活化混合物优于手动添加，因为这样在得到的树脂产物中实现了更好的均匀性。如上文所解释的，与使用其它方法生成的树脂相比，通过公开的偶联设备制造的树脂在柱中以不同的方式起作用。使用分散管可以使树脂珠粒的可用寿命增加一百个或一百个以上循环。
分散管的另一个重要优点是分散管允许活化混合物在非常短的时间内均质分布。用CNBr活化树脂需要快速进行，以减少交联的发生。在大多数情况下，应当在不到5分钟内完成，并且理想情况下应当在不到3分钟内完成。如果活化过程花费的时间明显超过3分钟，则偶联效率降低，从而导致过度交联。分散管特别是结合以下描述的搅拌器系统允许活化过程快速发生，以生产高质量树脂。CNBr可以添加到多达约40升的树脂中、混合并在3分钟内移除，并且有时在2分钟内移除。
图3示出了可以包含在设备中的用于CNBr-乙腈溶液的可拆卸固持容器或漏斗290。漏斗290的出口291与分散管的竖直部分220上的入口225流体连通。阀280控制流体从漏斗290流入分散管210中。在使用时，可拆卸固持容器290填充有CNBr溶液并附接到分散管。漏斗290的可移除性允许更安全地处理CNBr并避免溢出。CNBr-乙腈混合物具有腐蚀性和危险性，并且因此可移除漏斗允许混合物在连接到偶联设备之前在罩下混合。
一旦制备好树脂进行活化，就打开阀280以允许溶液经过分散管210并到达树脂上。分散通常需要2-4分钟。可以用少量乙腈溶液跟踪溶液，以将剩余的CNBr从漏斗290和管210中冲洗掉。
在容器110内部，通过搅拌器410搅拌树脂珠粒，从而保持树脂珠粒在网筛310上移动。图4A中示出了搅拌器的侧视截面视图。搅拌器包括转子420，所述转子是附接到搅拌电机(未示出)的竖直杆。搅拌器还包含在轮毂445处附接到杆的叶片440。在图4A中，叶片440以截面示出。图4B中示出了搅拌器的上下颠倒透视图，以提供叶片440构型的更清晰视图。叶片440旋转以将树脂珠粒从网筛310上提起。搅拌器还可以包含圆形框架450，所述圆形框架围绕叶片440的最外面的点，并且搅拌器可以进一步包含辐条460以用于另外的支撑。再次参考图4A，框架450的底部边缘被配置成与安置在搅拌器410下方的网筛(未示出)平行。
图4A所示的叶片440的宽度为3.0英寸、厚度为0.25英寸并且长度为28.0英寸。然而，叶片440的尺寸针对不同的用途可以有所不同。在一些实施例中，搅拌器410可以包含两个以上叶片。如所示出的，每个叶片440相对于水平面具有40度的节距。在不同的实施例中，叶片可以具有不同的节距角，如10度、20度、30度、50度、60度、70度、80度等。如图4C所示，叶片440可以具有圆形边缘449，这有助于防止珠粒破碎。搅拌器可以由不锈钢或另一种弹性材料制成。在图4A-C所示的实施例中，搅拌器被配置成顺时针旋转，使得叶片在容器中的流体中产生向上的提升力(而不是将流体向下推入网筛中)。
搅拌器的转速可以基于所用的树脂珠粒的类型和所需的混合量进行调整。搅拌器必须提供足够的提升力，以保持珠粒悬浮并在网筛上移动并且快速混合珠粒，同时避免珠粒破碎或压碎。由于不同的珠粒以不同的速度沉降，因此搅拌器的速度应当是可调的，以适应不同类型的珠粒。例如，CAPTOTM珠粒比CL-4B或CL-2B珠粒沉降得更快。在各种实施例中，搅拌器可以以高达60RPM的速度旋转。优选的搅拌速度是35RPM。另一个优选的搅拌速度是20RPM。速度可以基于珠粒类型、流体类型、流体温度和培育时长来确定。基于这些因素，搅拌器被设计成在树脂活化过程期间并且在抗体偶联过程期间将树脂充分混合。这允许正确混合以进行化学分散并且避免了树脂珠粒在偶联过程期间压碎/破碎。搅拌器还提高了树脂回收率，因为其防止树脂粘在网筛上。
在一些实施例中，搅拌器的两个叶片440可以沿相反方向倾斜，以在容器内提供动态树脂搅拌和溶液内悬浮。换句话说，一个叶片向下倾斜，使树脂被拍落到网筛上，而另一个叶片向上倾斜，以产生提升力。在其它实施例中，搅拌器叶片都向同一方向倾斜。搅拌器被配置成产生当搅拌器旋转时使树脂浆料充分混合和悬浮的流动模式。
在树脂活化过程中，当珠粒移动时，可以使用上述分散管210将活化混合物分布到珠粒上。根据各种方法，在活化、洗涤和偶联过程期间，可以通过容器来泵送缓冲液和其它流体。流体穿过网筛并通过容器底部的出口排出，同时搅拌器410保持珠粒在网筛上方移动。
图1A-C所示的网筛的直径为30英寸，其中网格孔径为30μm，以保留树脂并允许不同的溶液和缓冲液在偶联过程期间过滤通过网格。网格的孔径可以小到约5μm并且大到约80μm。在任何情况下，孔径都应当足够小，使得珠粒无法通过网筛。网筛可以是单个网筛，或者网筛可以是两个、三个或三个以上烧结层。Topmesh TM3-BM 30是与本发明兼容的网格，由G.BOPP USA,INC.公司(纽约沃平格斯瀑布市(Wappingers Falls,NY))供应。
在一个实施例中，顶层是30μm过滤网格，烧结有0.850mm方形网格和2.0mm方形网格以用于支撑。网筛被焊接到30英寸的不锈钢框架上。网筛可以通过垫圈固持在容器内的适当位置，所述垫圈可以可从网筛移除。
如上文所讨论的，搅拌器被设计成将树脂充分混合，同时防止树脂分解，所述分解将会堵塞网筛并妨碍高效的树脂回收。然而，网筛是可移除的，使得网筛在正常磨损后可以清洗或更换。偶联活化过程需要几分钟左右的快速缓冲液交换，其中网筛堵塞将导致缓冲液交换速率变慢，从而导致过程不符合要求并且批次可能拒收。
网筛具有弹性并且耐撕裂或断裂，以防止树脂从网筛中逸出。另外，网筛结构足够坚固，以免在树脂的重量下弯曲(bow/bend)。弯曲将会导致混合不均质或缓冲液流经设备不畅并且可能导致网筛堵塞。弯曲还会阻塞位于网筛水平下方较短距离处的容器110的释放阀130。在一些实施例中，穿孔的支撑板可以定位于各层之间，以增加刚性和耐用性。另外或可替代地，网筛可以包含定位于网筛下方以支撑中心的不锈钢支撑梁。包含支撑结构有助于防止珠粒在网筛上的分布不均质。分布不均将会导致树脂团聚并且树脂的化学作用和浸出特性发生变化。
通过引用的方式并入
贯穿本公开中对如专利、专利申请、专利出版物、期刊、书籍、论文和网络内容等其它文件的任何和所有参考和引用出于所有目的通过全文引用的方式并入本文中。
等同物
本发明可以在不偏离其精神或实质特征的情况下以其它具体形式实施。因此，前述实施例应当在所有方面均视为是说明性的而不是限制本文所述的发明。

Claims (22)

1.一种用于将抗体偶联到树脂的装置，所述装置包括：
混合容器，所述混合容器通过跨所述容器伸展的网筛分成上部和下部，所述上部包括入口并且所述下部包括出口，并且其中所述网筛的孔径为5μm到80μm；
搅拌器，所述搅拌器安置在所述上部内；以及
分散设备，所述分散设备包括形成管腔的细长管状结构，所述管状结构包括：近侧部分，所述近侧部分竖直延伸到所述混合容器的外部且具有向上开口的入口；远侧部分，所述远侧部分水平定位于所述搅拌器上方的所述上部内并且包括封闭端和多个面向下的孔；以及弯头，所述弯头连接所述远侧部分与所述近侧部分。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述搅拌器包括转子和旋转叶轮。
3.根据权利要求2所述的装置，其中所述叶轮包括轮毂、第一叶片和第二叶片，所述第一叶片和所述第二叶片从所述轮毂沿相反方向垂直延伸，每个叶片具有横向于所述轮毂被配置成在其上旋转的轴线的轴线。
4.根据权利要求3所述的装置，其中每个叶片具有固定节距。
5.根据权利要求3所述的装置，其中所述叶片具有圆形边缘。
6.根据权利要求1所述的装置，其中所述搅拌器被配置成向所述容器中的流体施加力，其中所述力被引导远离所述网筛。
7.根据权利要求1所述的装置，其中所述管状结构具有圆形截面。
8.根据权利要求1所述的装置，其中所述远侧部分具有介于8与30个之间的孔。
9.根据权利要求1所述的装置，其中所述远侧部分包括正好21个面向下的孔。
10.根据权利要求1所述的装置，其中所述孔平行于所述远侧部分的轴线布置成三行。
11.根据权利要求10所述的装置，其中所述行各自具有相同数量的孔。
12.根据权利要求10所述的装置，其中所述行各自具有不同数量的孔。
13.根据权利要求12所述的装置，其中所述三行中的第一行有10个孔，所述三行中的第二行有8个孔，并且所述三行中的第三行有3个孔。
14.根据权利要求10所述的装置，其中所述三行各自以介于30与60度之间的间隔定位。
15.根据权利要求10所述的装置，其中所述三行各自以45度的间隔定位。
16.根据权利要求1所述的装置，进一步包括用于打开和关闭所述入口的阀。
17.根据权利要求1所述的装置，进一步包括能够连接到所述入口的漏斗。
18.根据权利要求1所述的装置，进一步包括支撑梁，所述支撑梁被配置成支撑所述网筛并防止所述网筛弯曲。
19.根据权利要求1所述的装置，其中所述网筛能够从所述混合容器移除。
20.根据权利要求1所述的装置，其中所述弯头包括所述管状结构的弯部，所述弯部使所述入口定向成使得所述入口在基本上垂直于所述远侧部分的轴线的方向上开口。
21.根据权利要求1所述的装置，其中所述网筛孔径介于20与50μm之间。
22.根据权利要求1所述的装置，其中所述网筛孔径为30μm。
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