CN100335630C - 筛选方法 - Google Patents
筛选方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100335630C CN100335630C CNB038155524A CN03815552A CN100335630C CN 100335630 C CN100335630 C CN 100335630C CN B038155524 A CNB038155524 A CN B038155524A CN 03815552 A CN03815552 A CN 03815552A CN 100335630 C CN100335630 C CN 100335630C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- dna
- library
- matrix
- phenotype
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 238000012216 screening Methods 0.000 title abstract description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 41
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 29
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 26
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 23
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 21
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 20
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 16
- 238000002001 electrophysiology Methods 0.000 claims description 12
- 230000007831 electrophysiology Effects 0.000 claims description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000012402 patch clamp technique Methods 0.000 claims description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 abstract description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 146
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 32
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 28
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 26
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 18
- 238000011160 research Methods 0.000 description 13
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 9
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 8
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 8
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 8
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 6
- CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N Senegenin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@](C)(C(O)=O)[C@@H]2CC[C@@]3(C)C(CC[C@]4(CCC(C[C@H]44)(C)C)C(O)=O)=C4[C@@H](CCl)C[C@@H]3[C@]21C CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 5
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 239000009871 tenuigenin Substances 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 4
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000005213 imbibition Methods 0.000 description 3
- 230000008676 import Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 3
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 238000010865 video microscopy Methods 0.000 description 2
- GGRLKHMFMUXIOG-UHFFFAOYSA-M 2-acetyloxyethyl(trimethyl)azanium;hydroxide Chemical compound [OH-].CC(=O)OCC[N+](C)(C)C GGRLKHMFMUXIOG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 1
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 101710124584 Probable DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 230000036982 action potential Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000003556 anti-epileptic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003276 anti-hypertensive effect Effects 0.000 description 1
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010523 cascade reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000004640 cellular pathway Effects 0.000 description 1
- 210000000080 chela (arthropods) Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- -1 compound Phenytoin Sodium Salt Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N fura-2 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=3OC(=CC=3C=2)C=2OC(=CN=2)C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003754 machining Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004118 muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 239000002063 nanoring Substances 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N nifedipine Chemical compound COC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC)C1C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001597 nifedipine Drugs 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1079—Screening libraries by altering the phenotype or phenotypic trait of the host
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1082—Preparation or screening gene libraries by chromosomal integration of polynucleotide sequences, HR-, site-specific-recombination, transposons, viral vectors
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
本发明涉及筛选方法,具体地讲,涉及筛选DNA文库,以便鉴定当在宿主细胞中表达时能够导致所述宿主细胞的表型发生至少一种改变的DNA分子的方法,所述表型改变可使用膜片钳芯片构建体检测。另外,本发明涉及与产生所述细胞表型改变的DNA分子相当的mRNA的分离。
Description
技术领域
本发明涉及筛选方法,具体地讲,涉及筛选DNA文库、以便鉴定在宿主细胞中表达时能导致所述宿主细胞的表型发生至少一种改变的DNA分子的方法。
背景技术
DNA文库能够方便地储存和分析多核苷酸,以及它们的转录(mRNA)和表达产物(肽,多肽或蛋白质)。本文所使用的术语“DNA文库”意在包括DNA分子的总称,其中,所述文库的各个成员编码不同的单个基因和/或其片段和/或变体。或者,所述文库的每一个成员编码不同的多种基因和/或其片段和/或变体。
DNA文库的筛选通常是直接研究异源DNA序列和/或它的表达产物,很少或不考虑它对细胞的影响。另外,大部分已知的DNA文库筛选方法不是快速、高处理量、便于使用的技术。
发明内容
根据本发明,提供了用于筛选DNA文库的方法,包括:
(i)提供进行电生理学测定的基质,在该基质上可以排布至少一个细胞;
(ii)提供能表达至少一种异源DNA序列的至少一个细胞;
(iii)将至少一个细胞排布在所述基质上,以便可以检测和/或测定所述细胞的电生理学的变化;和
(iv)鉴定具有至少一种表现型改变的至少一个感兴趣的细胞。
在本发明的方法中,筛选DNA文库能够精确研究具有已知和未知功能的核苷酸序列,包括与所述细胞表现型相关的基因以及它们的表达肽,多肽和蛋白质。
优选的是,所述感兴趣的细胞和/或遗传物质是分离的,以便能够进一步研究所述异源DNA,例如通过测序研究。
优选的是,将所述进一步研究的结果保存在信息载体上。最优选的是,所述信息载体是选自下列一组中的一种或多种:纸件,电子邮件,计算机磁盘和互联网网页。
优选的是,提供多个细胞。最优选的是,每个细胞包括不同的异源DNA序列。因此,所述多个细胞其同构成了DNA文库。
优选的是,能表达给定DNA文库的细胞群体的筛选是通过电生理学测定和/或荧光显微术和/或对细胞体积和/或形状的改变的显微镜分析进行的。
将本发明的方法用于电生理学测定。
在小的膜区域通过在电压钳条件下对所述膜片进行电绝缘研究离子通道的原理,在以下文献中进行了概述:Neher,Sakmann,和Steinback in″细胞外膜片钳,通过生物膜中的开放通道分辨电流的方法″,Pflueger Arch.375;219-278,(1978)。所述作者发现,通过将装有乙酰胆碱(ACh)的吸液管压在肌细胞膜的表面上,可以看到电流的不连续地跳动。这是由于ACh-激活的离子通道的开放和关闭造成的。他们的研究工作受到了以下事实的局限:与所述通道的阻抗(10GQ)相比,吸液管玻璃和所述膜之间的密封阻抗(10-50MQ)是非常小的。通过这种密封所产生的电噪声大到足以妨碍流过离子通道的电流。
随后发现,通过对玻璃吸液管进行火琢(fire polishing),并且对吸液管的内部施加吸力,用所述细胞的表面可以获得非常高的阻抗(1-100GQ)。这种千兆封口将所述噪音降低了一个数量级,达到可以对大部分感兴趣的生物学通道进行研究的水平,并且大大拓宽了可以进行这种研究的电压范围。这种改进了的密封被称为″千兆封口″,并且将所述吸液管称为″膜片吸液管″(patch pipette)。有关千兆封口的更详细的说明参见以下文献:O.P.Hamill,A.Marty,E.Neher,B.Sakmann&F.J.Sigworth:用于对来自细胞和无细胞膜片的电流进行高分辨率纪录的改进的膜片钳术。Pfluges Arch.391,85-100,(1981)。
离子通道是能催化无机离子通过细胞膜转运的跨膜蛋白。离子通道与很多细胞过程相关,包括产生和定时动作电位,突触传递,激素分泌,肌肉收缩。很多药物是通过调节离子通道发挥它们的特殊作用的。其例子包括抗癫痫的化合物苯妥英,它能封闭大脑中的电压依赖性Na+-通道,以及抗高血压的药物硝苯吡啶,它能封闭平滑肌细胞中的电压依赖性Ca2+-通道。除了化学诱导的离子通道活性调节之外,所述膜片钳技术使得科学家能够对电压决定型通道进行操纵。该技术包括调整膜片吸液管中的电极的极性,以及改变盐溶液的配方,以便调节浴液中的游离离子水平。
优选的是,对表型改变的筛选还可以通过研究异源DNA序列的作用,同时施加细胞内和/或细胞外测试试剂进行。
最优选的是,所述测试试剂是选自下列一种或多种成分中的至少一种:小有机分子(MW<1000g/mol),小肽(少于100个氨基酸),神经递质,激素和细胞因子。
优选的是,所述包括异源DNA序列的细胞是动物细胞,最优选的是选自人类胚胎肾293(HEK 293),中国仓鼠卵巢(CHO),COS,MDCK,NG108,NIH3T3或T84细胞。
当细胞外(例如,离子浓度,温度或配体蛋白浓度)或细胞内(例如,离子浓度,蛋白浓度或异源蛋白)成分改变时,就可能发生细胞条件的改变。因此,重组DNA序列的存在,可能影响细胞条件,以及可测定的表现型。重要的是,所述影响是对细胞内成分产生的,其中,表达了所述重组DNA,因此改变了蛋白浓度,并且通过其中某些蛋白的功能而影响其他细胞过程。所述表达的异源蛋白的影响还可以延伸到影响细胞外条件。
所述表达的重组蛋白影响细胞条件的一个例子是当所述表达的重组蛋白是细胞膜离子通道时发生的。细胞内和细胞外条件都受到了影响。离子通道允许和/或导致离子通过细胞膜运动。这种运动是细胞外到细胞内的或者相反,并因此改变了细胞内和细胞外的离子浓度。
细胞条件的上述变化是表型变化,这些变化可以测定,并且用于指示感兴趣的基因型的存在,即编码导致宿主细胞表现型发生可测定变化的基因型的重组DNA。所述表型改变是相对源于被转染的宿主细胞相同的细胞系的对照细胞进行的,差别在于所述对照细胞没有用重组DNA序列进行转染。
宿主细胞表型的改变可以利用本文所披露的芯片装置测定,以便在与所述芯片的基质接触的同时,对所述宿主细胞进行表型测定。
用于本发明的细胞表达的DNA文库的构建,可以通过标准PCR和克隆技术,同时结合逆转录病毒载体技术进行。将DNA文库的每一个成员导入宿主细胞,以便每一个细胞仅包括一种重组DNA构建体。两种或两种以上异源重组构建体的存在,能削弱任何潜在可观察到的表型信号,并且使得所观察表型的原因性基因型的表征变得更困难。将一种重组构建体稳定整合到每一个细胞中的目的,可以通过使用逆转录病毒颗粒的低感染复数(MOI)实现,确保宿主细胞的低水平感染,并且结合进行对包含在逆转录病毒载体上的抗性基因的筛选。优选的是,用于筛选的抗性基因是选自下列一组:新霉素,嘌呤霉素,杀稻瘟菌素D或zeomycin。
要研究的DNA文库的优选例子是cDNA、随机化的、多态性和基因组文库。
我们所说的″cDNA文库″表示通过细胞mRNA的逆转录获得的DNA文库。
优选使用标准化cDNA文库,以便消除由于高度表达的基因所产生的偏差,我们所说的标准化cDNA文库表示这样的cDNA文库,其中,降低了高频率cDNAs的频率,产生了大致相等的cDNAs代表。
我们所说的″随机化文库″表示单一多核苷酸的DNA文库,其中,该文库的每一个成员与其他成员相差一个或多个核苷酸,并且所述变化是人工引入的。
我们所说的″多态性文库″表示单一多核苷酸的DNA文库,其中,该文库的每一个成员与其他成员相差一个或多个核苷酸,其中,所述改变是所述多核苷酸的天然和固有的特征。
我们所说的″基因组文库″是通过分级分离完整的细胞基因组DNA获得的DNA文库。
DNA文库可以通过若干种不同的分子技术构建。互补的DNA(cDNA)文库——最常用的DNA文库,可以用从真核细胞中分离的mRNA构建。mRNA的结构中引入了在转录后加工期间添加的3′polyA尾巴,使得能够从加工过的mRNA合成cDNA。将分离的mRNA与过量的poly T寡核苷酸和逆转录酶一起温育,其中,所述poly T寡核苷酸与所述互补的poly A尾巴退火。所述逆转录酶随后可以用poly T寡核苷酸作引物,由它启动DNA合成,从而所述mRNA起着模板的作用,生成单链DNA,进而用作双链cDNA合成的模板。可以将所述cDNA用于标准PCR反应中,或用于克隆到载体上,以便制备DNA文库[F MAusubel等″Current protocols in Molecular Biology-VolumeOne″John Wiley&sons,Inc.(1995)]。
由于是利用mRNA合成的,cDNA与基因组DNA的差别在于,它不包括调控序列或内含子。所产生的cDNA体现了在特定时间细胞的mRNA组成,并且不可能同样体现来自亲本细胞的基因组的每一个基因。
因此,cDNA文库有偏向性地体现细胞mRNA,主要包括多拷贝的管家基因,以及以几个或没有拷贝的形式存在的低表达基因。另外,存在未表达的基因,它们并不包括在所产生的cDNAs中。
通过统一化方法可以制备能更均等地体现细胞mRNAs的cDNA文库[M B Soares等″统一化cDNA文库的构建和表征″,PNAS 91 pp.9228-32(1994)]。这一过程是通过以下方法实现的:使用互补的单链cDNA作退火配偶体,并且随后筛选游离的单链cDNA。这种方法确保了高频率cDNAs主要与互补链结合,并且显著降低了频率,同时,正常情况下低频率的cDNAs只会中等程度地减少。可以重复用这种方式进行筛选,以便生产能适当等同地体现cDNAs的文库。
另一种DNA文库是通过直接分级分离细胞基因组DNA,并且将所得到的片段插入合适的载体上而构建的基因组DNA文库。这样的文库包括具有完整的非编码区的DNA。通常,基因组DNA的分级分离是通过机械或酶促方法实现的。
另一种类型的DNA文库是随机化文库,其中,所述文库包括编码单一基因的克隆,每一个克隆包括一个或多个核苷酸的不同修饰,通常与研究中的蛋白质的相同的具体肽结构域相当,但并不排除其他可能。所述随机文库可以是利用PCR方法构建的[T Ohmichi等″具有优化的单链启动子的DNA纳米环载体的有效细菌转录″,PNAS 99 pp.54-59(2002);T Jespersen等,“通过核酸外切酶″外端平整″进行的由非PCR介导的PCR片段的有效的重叠延伸”,Biotechniques 23 pp.48-52(1997)]。通过掺入了随机化核苷酸序列的PCR引物将随机化修饰导入所述靶核苷酸,因此将所述修饰定点到特定的氨基酸位点。
再一种类型的DNA文库是多态性文库。在特定生物群体内的很多基因是多态性的,即编码特定蛋白的相同基因存在天然变体。例如,主要组织相容性复合体(MHC)蛋白包括在肽结合裂缝中的氨基酸多态性,因此所述结合裂缝是不同的,导致不同个体在它们的MHC蛋白结合特定靶的能力方面的改变[P J Bjorkman和P Parham″I型主要组织相容性复合体分子的结构,功能和多样性″Ann.Rev.Biochem.59 pp.253-288(1990)]。
因此,多态性文库包括所述文库的每一个成员,这些成员编码单一基因的不同多态性拷贝。所述文库特别有利于药物筛选,以便研究与基因的特定多态性形式相关的不同的反应形式和潜在的副作用。
将DNA导入细胞的方法为本领域所熟知[Sambrook&Russell,″Molecular cloning;A laboratory manual″3rd edition,Cold SpringHarbor Laboratory Press(2001)],包括电穿孔,脂质体介导的转移,磷酸钙共沉淀和显微注射。
电穿孔是通过对含有DNA和待转染细胞的溶液施加短时间的电脉冲实现的[ReviewK Shigekawa&W J Dower″真核细胞和原核细胞的电穿孔:将大分子导入细胞的通用方法″,Biotechniques 6 pp.742-751(1988)]。所述电脉冲会导致细胞膜的短时间透化,在此期间,DNA能进入细胞的细胞液。随后该DNA的一部分出现在细胞核中,在这里发生了所导入基因的瞬时表达,通常在转染之后24-72小时之间达到高峰。
脂质体介导的转移(脂感染)是利用具有类似天然脂类细胞膜的人工脂膜的小泡(脂质体)携带重组DNA。所述脂质体能够自发地与细胞膜融合,从而将它们的内含物释放到细胞质中。[综述——R J Mannino和S Gould-Fogerite,″脂质体介导的基因转移″,Biotechniques,6 pp.682-690(1988)]。
F L Braham和A J van der Eb(″用于分析人类腺病毒5DNA的感染力的新技术″Virol.,52 pp.456-467(1973))证实了磷酸钙共沉淀能大大增强基因向宿主细胞的转移。将DNA与磷酸盐缓冲液混合,向该缓冲液中添加氯化钙。该方法产生了磷酸钙和DNA的细小沉淀物,将该沉淀物应用在宿主细胞上,从而所述细胞历经若干小时时间将所述沉淀DNA摄取到细胞质中。
通过显微注射方法可以将重组DNA可靠地导入宿主细胞。该方法需要细的针头以便穿入细胞,并且将DNA直接注射到细胞质中[MCapecchi,″通过直接显微注射进入培养的哺乳动物细胞进行高效转化″Cell,22 pp.479-488(1980)]。显微注射可以用计算机控制的装置进行,它能提高该技术的精确性和速度。
导入靶细胞的DNA序列是异源DNA。我们所说的异源DNA,表示业已导入所述细胞、超出所述细胞的正常DNA组成以外的DNA序列,并且,其中,所述DNA文库的每一个异源DNA成员与其他成员相差一个或多个核苷酸。
异源DNA序列的可靠表达是通过将克隆的DNA稳定整合到宿主细胞DNA中实现的。例如,这一目的是利用基于逆转录病毒将它们的基因组稳定整合到宿主细胞DNA中的天然能力的逆转录病毒转导系统可靠地实现的[Mann等″逆转录病毒包装突变体的构建及其在生产无辅助缺陷型逆转录病毒上的用途″,Cell 33 pp.153-159(1983)]{图1}。在这样的系统中,将克隆的DNA导入病毒基因组。逆转录病毒转导系统通常包括两种功能因子,顺式因子和反式因子。反式因子编码病毒包装蛋白,而顺式因子编码其他必需的病毒核苷酸序列。将克隆的DNA导入所述宿主基因组,以便它被顺式因子包围成不能产生其自身包装蛋白的重组前病毒DNA,因此,将所述前病毒DNA转染到包装细胞中。
包装细胞包括反式因子,并且能产生病毒外壳,将克隆的前病毒DNA包装到该外壳中,以便产生感染性颗粒。
所述感染性颗粒被从宿主细胞中释放,并且可以收获,以便转染靶细胞培养物,其中,它能稳定地整合病毒基因组,包括包含在它里面的克隆DNA。因此,所述克隆的DNA可以在所述靶细胞中表达,而所述逆转录病毒不能进一步复制,因为所述重组病毒基因组缺乏必要的病毒基因[综述-J M Coffin″逆转录病毒科,病毒及其复制,pp.1767-1845″In:D M Knipe等(ed.)″Fields virology″Lippencott-Ravenpublishers(1996)]。
附图的说明
下面将结合附图对本发明的具体实施方案进行说明:
图1-表示利用逆转录病毒载体构建DNA文库和DNA文库的细胞表达的示意图。所述载体包括感兴趣的异源DNA(基因),抗性标记(neo-新霉素抗性)和内部核糖体进入位点(IRES)。所述异源DNA的旁侧是顺式因子,包括长的末端重复(LTR)。该构建体的转录产生了包括所述异源DNA和所述抗性标记的mRNA。特定序列的随机化是通过PCR、随后进行重叠延伸实现的。2号引物包括随机化的核苷酸,以便将核苷酸变化导入特定位点。将通过PCR获得的片段混合在重叠延伸中,以便获得完整长度的载体,用于所述逆转录病毒载体转导系统。将所述载体构建体转染到包装细胞中,在这里,通过瞬时表达产生了上清液,该上清液在提取之后将包含可应用于所述靶细胞的病毒。
图2-表示位于芯片上的检测位点处的单一靶细胞的示意图。所述细胞能表达单一基因组构建体。在所述细胞的下面是测试位点和孔之间的小的开口,对位于该位点的细胞膜进行穿孔或将其去掉,以便进行电生理学分析。示出了其他表型分析(点划线)。还通过所述开口提取mRNA进行了基因型检测,在所述开口上的细胞膜是不完整的。
图3-是优选的芯片结构示意图,其构造如下:
1.芯片外壳。
2.微型结构单元。
3.微型结构单元上的玻璃/硅膜。
4.包括含有细胞外缓冲液和化合物的通道/区室的小池。
5.含有细胞内缓冲液和来自具有完整细胞结构的细胞的mRNA的通道。
6.用于导入细胞和化合物的入口/取液孔。
7.细胞捕获位点,包括位于膜3上的孔。所述孔是适当成型的,以便能够进行千兆封口和形成完整细胞。
8.悬浮液中的细胞。
9.微型泵。
图4-表示筛选细胞表现型的方法的示意图。具有用于表达cDNA的稳定整合载体的细胞——由它产生膜结合蛋白(例如,离子通道)。
图5-表示肽随机化DNA文库的表型研究的示意图。筛选与已知膜蛋白相互作用的肽调节化合物(编码序列-XXX)。可以测定影响该膜蛋白的肽的调节作用。
图6-表示较大的蛋白-细胞调节剂的肽随机化的表型研究示意图。业已将低效率调节子随机化,以便提高它与已知膜蛋白的结合效率。X是来自所述DNA文库的随机化构建体。
图7-表示较大的蛋白-受体——例如ScFv——的肽随机化表型研究示意图。ScFV结合位点随机化(改变的区域通过X表示)可能影响结合亲和力,而对这种亲和力可以进行表型测定。
实施例
实施例1-优选实施方案的说明
预测性实施例:在细胞系中表达的基因组文库的构建
该实验的目的可以是增强特定配体与特定离子通道的结合。这是通过对已知配体与之结合的离子通道内的特定氨基酸进行随机化实现的,包括将这些随机化的基因产物导入细胞,并且在显微阵列系统中对它进行测定。显微阵列测定的例子如例3,4,5所述。
将所述离子通道基因插入双顺反子逆转录病毒载体,该载体包括转导靶细胞所必需的所有逆转录病毒顺式因子,以及来自EMCV的内部核糖体进入位点,随后是新霉素选择基因(Morgan RA,Couture L,Elroy-Stein O,Ragheb J,Moss B,Anderson WF。包括推测的内部核糖体进入位点的逆转录病毒载体:多顺反子基因转移系统的开发以及在人类基因治疗上的应用。NAR 1992,20:1293-9)。当所述离子通道基因被插入IRES因子上游时,所述离子通道基因和neo-基因将出现在来自该逆转录病毒载体转录单位的同一mRNA转录物上。所述离子通道基因随后通过帽子-扫描机制进行翻译,同时,所述neo翻译将从IRES因子开始。所述离子通道中四个氨基酸的随机化是通过基于两步骤PCR的方法完成的(参见图1)(通过核酸外切酶″末端平整″进行的非PCR介导的有效PCR重叠延伸。Jespersen T,Duch M,Pedersen FSBiotechniques 1997 Ju1;23(1):48,50,52)。在第一个步骤中,进行对所述转录单位(逆转录病毒载体)的每一个末端进行扩增的两个平行PCR。2号引物编码12个随机化的核苷酸(产生4个氨基酸),紧靠与DNA链退火的序列的3′末端。在将这些随机化的核苷酸引入到所述离子通道的编码序列上时,将构建出多达204种不同的基因型。2号和3号引物在这些引物的5′末端是彼此互补的,因此通过这些引物导入的序列可用于重叠延伸方法。PCR应当用以下成分进行:0.5pM引物(寡核苷酸),100ng模板/100μl反应体积,2.5单位校正聚合酶(如Pfu(Stratagene)或Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity(LifeTechnologies)),以及相应的缓冲液和200μM dNTP。PCR条件为:在95℃下进行2分钟;随后95℃30秒,50℃15秒,72℃3分钟共15个循环,最后在72℃下进行5分钟。
通过诸如BOSC23的逆转录病毒包装细胞,将通过所述重叠延伸方法获得的基因组文库导入靶细胞(Pear WS,Nolan GP,Scott ML,Baltimore D.通过瞬时转染生产高效价的无辅助逆转录病毒。Proc NatlAcad Sci U S A.1993 Sep 15;90(18):8392-6)(Coffin JM(1996)Retroviridae)。在将所述PCR产物转染(例如,使用lipofectamine(LifeTechnologies),按照生产商的说明进行)到所述包装细胞系中时,所述DNA可以被转录成RNA,该转录的RNA将被包装到由所述包装细胞所产生的逆转录病毒颗粒中。在转染72小时之后,对培养基进行过滤(0.5μm过滤器),并直接添加到靶细胞中(转导)。在转导48小时之后,应当将选择(新霉素)培养基添加到所述细胞中。在14天之后,未转导的细胞会死亡,而转导过的细胞将形成集落。应当混合这些集落(胰蛋白酶化),以便获得含有所述基因组文库的群体。此时,可以将该群体直接用于筛选实验或在-80度下保存。
实施例2-用于表型分析的芯片
在WO 02/9402中披露了用于膜片钳实验的合适的芯片。为了在本发明中使用,对该芯片进行了改进,以便能够从细胞中提取mRNA,其结构如图3所示。
所述芯片包括平面基质,它包括第一表面部分和相对的第二表面部分。第一表面部分具有多个位点,其中的每一个位点适合承载包括离子通道的结构。
每一个位点包括与它相关联的测量电极,所述基质携带有一个或多个参考电极,所述测量电极和相应的参考电极是在彼此形成电解接触时、并且在它们之间施加电位差时,能够通过由一个电极输送离子、由另一个电极接受离子而在它们之间产生电流的电极。
所述每一个位点适合在承载在该位点上的含有离子通道的结构和该位点的表面部分之间提供高电阻密封。在提供这种密封时,可以隔离含有所述离子通道的结构一侧上确定的、并且与测量电极电解接触的结构域与包括所述离子通道的结构的另一侧确定的、与相应的参考电极形成电解接触的结构域。该密封可以对通过所述电极之间的含离子通道结构的离子通道流动的电流进行测定和/或监测。本发明的电极是与所述基质整合的,并且已通过晶片加工技术生产的。
可以通过主动或被动方法将存在于溶液中的包括离子通道的结构(例如动物细胞)导向基质上的位点。当所述包括离子通道的结构与所述位点,例如电极周围的基质接触时,接触表面在该位点(例如电极周围)上形成了高电阻密封(千兆封口),以便可以利用相应的电极测定所述离子通道的电生理学特征。所述电生理学特征可以是通过由所述千兆封口包围起来的所述包括离子通道的结构的膜部分传导的电流。
在本说明书中,术语″千兆封口″一般表示至少1G欧姆的密封,并且这是通常追求的最起码的密封程度,不过,对于某些类型的测定来说,当电流较大时,较低的值也可能足以作为阈值。
优选使用膜片钳的完整细胞构造方法。该构造可以通过以下方法获得:在与每一个许可的位点相关联的测量电极和参考电极之间施加一系列的秒电位差脉冲(second electric potential difference pulses),监测在测量电极和参考电极之间流动的秒电流(second current),并且当所述秒电流超过预定的阈值时,中断所述系列的秒电位差脉冲,以便使最接近测量电极的所述包括离子通道的结构部分破裂。
另外,所述完整细胞构造可以通过让所述包括离子通道的结构最接近测量电极的部分与成孔基质相互作用获得。
应当指出的是,在本发明中,术语“完整细胞构造”不仅表示其中完整细胞已与测量位点的基质接触、并且业已打孔或通过成孔物质造成开口而与细胞内部发生电接触的构造,而且还包括这样的构造,其中,业已安装了切割的细胞膜片,以便所述膜的外表面是“向上”,朝向要施加的测试样品。
由于与一个位点相关联的所述测量电极是所述基质上的多个电极之一,并且所述包括离子通道的结构是存在于溶液中的很多结构之一,优选在特定的基质上存在多个测量位点。所述多个测量位点可以用于对多个测试细胞同时进行分析。
实施例3-电生理学测定
电生理学测定可以用由所述基质制成的芯片构建体进行,并且按照上文所述以及图3所示方法使用,从而通过对测试细胞施加电压改变来进行膜片钳测试。
典型的测定包括在测定装置上添加特定的测试样品,为此,每一个测定装置是与其他测定装置彼此分离的,以避免测试样品的混合,以及在所述装置之间的电流传导。此外,对没有用异源DNA序列转化过的对照细胞进行测定,以便提供所述细胞系的对照表型参数。
可以在任何时间对多个测试细胞进行研究,并且进行所述电生理学测定和分析,以便证实哪一个测试细胞表现出与所述对照细胞不同的表型(如果有的话)。
将通过对测试细胞施加电压改变产生的电生理学测定值用于分析选自下列细胞表型特征中的一个或多种:电流幅度(在去极化脉冲期间测定的最大电流),激活动力学(在去极化脉冲期间电流增加的时间常数),失活动力学(在去极化脉冲之后电流减弱的时间常数),激活阈值(在细胞膜上打开离子可渗透的孔的电压电位)以及尾电流(在去极化脉冲之后测定的电流)(Hille B.Ion channels of excitable membranes.3th edition.2001.Sinauer Associates,Inc,Sunderland,MA,USA)。
实施例4-基于荧光的筛选
已知某些荧光探针能结合细胞分子,用于指示多种细胞参数中的一个或多种,包括,但不局限于pH(例如,H+特异性探针),膜电位和离子的浓度通量(例如,Ca2+(fura2)和Mg2+(mag-fluo4)特异性探针(Molecular Probes,Inc,The Netherlands))(Methods Cell Biol 1989;30:157-92 Bright GR,Fisher GW,Rogowska J,Taylor DL.Fluorescence ratio imaging microscopy)(Inoue S.Progress in videomicroscopy.Cell Motil Cytoskeleton 1988;10(1-2):13-7。
在对位于所述基质上的测试细胞施加电压改变时——此时业已额外添加了荧光探针,所述荧光探针将与它的特异性靶分子(如果在测试细胞中存在这样的分子的话)结合,导致荧光信号的诱导。可以通过荧光显微术对所述荧光信号进行定量(Methods Cell Biol 1989;30:157-92Bright GR,Fisher GW,Rogowska J,Taylor DL.Fluorescence ratioimaging microscopy)(Inoue S.Progress in video microscopy.CellMotil Cytoskeleton 1988;10(1-2):13-7),并由此翻译成被测量的细胞内条件的直接测定值,以便将测试细胞与对照细胞进行比较,从而确定表现出不同表现型的测试细胞。
实施例5-大小或形状测定值
对表达所述DNA文库的细胞大小或形状改变的测定能够用于鉴定与对照细胞相比业已影响了宿主细胞的总体物理构型的多核苷酸和/或基因和/或肽和/或多肽和/或蛋白。所述测定是通过自动化显微检测进行的(Foskett JK.[Ca2+]i modulation of Cl-content controls cell volume insingle salivary acinar cells during fluid secretion.Am J Physiol 1990Dec;259(6 Pt 1):C998-1004)(S Muallem,BX Zhang,PA Loessberg,和RA Star,在单个骨肉瘤细胞UMR-106-01中同时记录细胞体积变化和细胞内pH或Ca2+浓度。J.Biol.Chem.1992 267:17658-17664)。
实施例6-mRNA的分离和“命中”的表征
提供“阳性”结果或“命中”(hit)的细胞是这样的细胞:与来自相同细胞系的未转化过的对照细胞相比,它们具有改变了的表现型。
一旦鉴定了阳性细胞,则表征其基因型就是筛选异源DNA序列的下一个步骤。通过从阳性细胞中分离mRNA,分析造成所述阳性表型信号的基因型的表征。所述mRNA的提取可以通过选自吸液、细胞裂解和机械取出的一种或多种方法进行。
吸液是通过将吸液管、注射器、针头或类似的工具之一插入细胞并取出细胞质部分来进行的。优选的吸液方法是通过从所述芯片的测试基质的细胞固定位点上的通道抽取细胞质进行的{图2&3}。另外优选的是,通过所述通道取出mRNA的过程是通过微型泵(9)施加的吸力实现的,或在通过所述通道之后,将吸液管、注射器、针头或类似的工具之一插入所述细胞来实现的。
裂解是通过将裂解缓冲液(例如,0.2M NaOH,1%SDS)添加到装有细胞的腔室中实现的,以便分解细胞膜,并且释放细胞成分。
mRNA提取的机械方法是通过以下步骤进行的:使用专门设计成从阵列的孔中取出细胞的工具将细胞从腔室中刮出。将所述细胞从所述腔室上刮掉的过程使所述细胞破裂,并且释放出细胞成分,然后从这些成分中提取mRNA。
受到所施加的刺激影响的多核苷酸、肽、多肽和/或蛋白的进一步表征是通过从所述测试细胞中分离的mRNA进行RT-PCR(逆转录酶PCR)表征进行的。
为了只扩增感兴趣的核苷酸,RT-PCR引物的设计需要对感兴趣的核苷酸序列有事先了解,或对感兴趣的核苷酸旁侧序列有事先的了解。在本发明中,位于所述感兴趣的核苷酸旁侧的区域是已知的,因为它们包括位于所述异源DNA序列旁侧的病毒载体区域。
在从所述阳性细胞中分离了mRNA之后,将被设计成与感兴趣的核苷酸的旁侧病毒区互补的RT-PCR引物用于进行逆转录反应,以便合成单链cDNA。将该cDNA进一步用作常规PCR反应的模板,用于该反应的引物包括已知的限制位点,以便来自PCR的双链产物能够方便地亚克隆到其他载体上。
这种包括感兴趣的核苷酸的新型载体可用于测序反应和用于表达合适的产物,以便更好地表征感兴趣的核苷酸,并且,如果合适的话,可以表征它的表达产物。例如,所述表达产物的进一步表征可以通过常规膜片钳技术或荧光测试实现。
通过芯片技术分析细胞表达的cDNA文库,能够用于筛选多种已知和未知蛋白。可以针对所研究的蛋白质功能,对在具体筛选中所采用的参数进行调整,例如,如果所述筛选针对的是新的电压门控离子通道的话,所述筛选方法优选涉及电生理学参数。
实施例7-测试试剂的应用
优选的实施方案还可以包括让测试细胞接触测试试剂的步骤,所述测试试剂可能会或不会影响与异源DNA序列有关的表型。将所述测试细胞的表型与业已额外接触了所述测试试剂的对照细胞进行比较。
优选的是,所述测试试剂是下列一组中的至少一种:有机小分子,小肽,神经递质,激素和细胞因子。
实施例8-本发明的其他用途
本发明的主要用途是筛选DNA文库,但本发明的用途是多种多样的。本发明的潜在用途包括,但不局限于新型治疗化合物和新型药物目标的鉴定和/或表征和/或合成。
其他用途包括以下成分的鉴定和/或表征:参与或影响细胞级联反应和/或转导途径的分子;与靶分子结合相关和/或必需的结合蛋白的氨基酸。
本发明的另一种用途是筛选随机化的和/或多态性文库,用于鉴定和/或表征具有增强的和/或减弱了的功能的变体。
实施例9-作为起点的随机化文库
随机化肽的表达,在新药物的潜在发现和小肽的功能和相互作用方式研究中都有重要意义{图5}。
可以通过某些小肽改变蛋白功能和细胞途径,这一目的是通过它们与蛋白质内的特定肽结构域结合实现的。因此,所述小肽具有治疗疾病的潜在能力。对在本发明中发现的所述肽的进一步研究可能显示体内功能缺乏。不过,用分离的mRNA和表达的产物,还可以建立所述肽的结构模型,通过它可以得到能模拟所述肽的功能的合成有机化合物。
另外,业已在体内的细胞外和细胞内发现了具有未知功能的多种小肽。随机化肽的表达是阐明所述小肽功能的一种方法。
实施例10-作为起点的大蛋白质随机化文库
其他随机化文库可以包括较大蛋白质内的局部肽结构域随机化{图6&7}。结合蛋白包括具有不同功能的结构域,即结合结构域和通常的效应子结构域。已知多种这样的结构蛋白能以较低的亲和力结合它们的靶分子,因此,将所述结合结构域进行随机化,以便提高(例如,抗体)或降低(例如,降低副作用)配体和靶蛋白之间的亲和力,可以产生要研究的理想文库。
实施例11-作为起点的多态性文库
存在于人群中的很多基因是多态性的。多态性文库在筛选潜在药物的副作用和不同的反应方式方面是具有价值的。当所述多态性文库较大和/或并非所有多态性序列都是已知的时,通过芯片技术进行筛选可能是有利的,因为这种技术有利于研究的方便性。
Claims (11)
1.一种用于进行电生理学测定的方法,其中包括以下步骤:
(i)提供进行电生理学测定的基质,在该基质上可以排布至少一个细胞;
(ii)提供多个细胞,每一细胞包含衍生自DNA文库的不同的异源DNA序列,其中每一细胞均表达其中包含的异源DNA序列;
(iii)将步骤(ii)中提供的所述多个细胞排布在所述基质上,以便检测和/或测定每一细胞中与对照细胞相比的电生理学的变化,所述变化是因该异源DNA序列的表达而导致的;和
(iv)鉴定具有至少一种表现型改变的至少一个感兴趣的细胞;
其特征在于,该方法进一步包括下述步骤:
分离感兴趣的细胞和/或其遗传物质;和
从在步骤(iv)中鉴定的感兴趣的细胞中分离mRNA。
2.如权利要求1的方法,其中,所述方法还包括对所述遗传物质进行测序的步骤。
3.如权利要求2的方法,其中,所述方法还包括将所述序列信息保存或记录在信息载体上的步骤。
4.权利要求3的方法,其中所述信息载体是计算机磁盘。
5.如前述任一权利要求的方法,其中,所述DNA文库是cDNA文库。
6.如权利要求1-4任一项的方法,其中,所述细胞的电生理学变化是通过膜片钳技术检测和/或测定的。
7.如权利要求1-4任一项的方法,其中,所述细胞在步骤(iii)之前用测试试剂处理过。
8.如权利要求7的方法,其中,所述测试试剂选自下列一组中的至少一种:小有机分子,小肽,神经递质,激素和细胞因子。
9.如权利要求1-4任一项的方法,其中,所述细胞是动物细胞。
10.权利要求9的方法,其中,所述动物细胞选自:人类胚胎肾293,中国仓鼠卵巢,COS,MDCK,NG108,NIH3T3或T84细胞。
11.如权利要求1-4任一项的方法,其中,所述细胞被排布在所述基质内或基质上的间隔开的位点处。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US38639102P | 2002-06-07 | 2002-06-07 | |
DKPA200200869 | 2002-06-07 | ||
US60/386,391 | 2002-06-07 | ||
DKPA200200869 | 2002-06-07 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1665928A CN1665928A (zh) | 2005-09-07 |
CN100335630C true CN100335630C (zh) | 2007-09-05 |
Family
ID=29737850
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB038155524A Expired - Fee Related CN100335630C (zh) | 2002-06-07 | 2003-06-06 | 筛选方法 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20060121464A1 (zh) |
EP (1) | EP1511843B1 (zh) |
CN (1) | CN100335630C (zh) |
AT (1) | ATE321851T1 (zh) |
AU (1) | AU2003251124A1 (zh) |
CA (1) | CA2488449A1 (zh) |
DE (1) | DE60304345T2 (zh) |
DK (1) | DK1511843T3 (zh) |
WO (1) | WO2003104455A1 (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE0400421D0 (sv) * | 2004-02-23 | 2004-02-23 | Astrazeneca Ab | Assay |
US8585881B2 (en) * | 2004-09-10 | 2013-11-19 | Onda Via, Inc. | Localized chemical microgradients |
CN106818295B (zh) * | 2017-02-07 | 2021-05-28 | 上海市绿化管理指导站 | 行道树栽植基质、行道树栽植基质的筛选方法及行道树种植系统 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999064582A2 (en) * | 1998-06-12 | 1999-12-16 | Introgene B.V. | High-throughput screening of gene function using libraries for functional genomics applications |
WO2001073000A2 (en) * | 2000-03-24 | 2001-10-04 | Maxygen, Inc. | Methods for modulating cellular and organismal phenotypes |
EP1143013A1 (en) * | 2000-04-03 | 2001-10-10 | Warner-Lambert Company | Methods and compositions for screening Icrac modulators |
CN1330154A (zh) * | 2000-06-27 | 2002-01-09 | 南京益来基因医学有限公司 | 细胞微阵列芯片及其制备方法 |
WO2002004943A2 (en) * | 2000-07-07 | 2002-01-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Electrophysiology configuration suitable for high throughput screening of compounds for drug discovery |
WO2002024862A2 (en) * | 2000-09-19 | 2002-03-28 | Cytion S.A. | Sample positioning and analysis system |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6936457B1 (en) * | 1990-04-03 | 2005-08-30 | Merck & Co., Inc. | DNA ENCODING HUMAN α AND β SUBUNITS OF NEURONAL NICOTINIC ACETYLCHOLINE RECEPTOR, CELLS TRANSFORMED THEREWITH, AND RECOMBINANT CELL LINE EXPRESSING A HUMAN α AND β SUBUNIT OF NEURONAL NICOTINIC ACETYLCHOLINE RECEPTOR |
DK0877752T3 (da) * | 1996-01-23 | 2003-09-15 | Univ Leland Stanford Junior | Fremgangsmåder til screening af transdominante effektorpeptider og RNA molekyler |
NZ516848A (en) * | 1997-06-20 | 2004-03-26 | Ciphergen Biosystems Inc | Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine |
US6897031B1 (en) * | 1998-04-17 | 2005-05-24 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Multiparameter FACS assays to detect alterations in exocytosis |
DE19950385A1 (de) * | 1999-01-29 | 2000-08-03 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur Isolation von Apoptose-induzierenden DNA-Sequenzen und Detektionssystem |
DK1221046T3 (da) * | 1999-10-01 | 2006-06-12 | Sophion Bioscience As | Samling og fremgangsmåde til bestemmelse og/eller overvågning af elektrofysiologiske egenskaber ved ionkanaler |
US6699697B2 (en) * | 2000-02-11 | 2004-03-02 | Yale University | Planar patch clamp electrodes |
CA2411069A1 (en) * | 2000-06-07 | 2001-12-13 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | The human voltage gated sodium channel .beta.-1a subunit and methods of use |
US6686193B2 (en) * | 2000-07-10 | 2004-02-03 | Vertex Pharmaceuticals, Inc. | High throughput method and system for screening candidate compounds for activity against target ion channels |
AU9367601A (en) * | 2000-10-02 | 2002-04-15 | Sophion Bioscience As | System for electrophysiological measurements |
-
2003
- 2003-06-06 CA CA002488449A patent/CA2488449A1/en not_active Abandoned
- 2003-06-06 AU AU2003251124A patent/AU2003251124A1/en not_active Abandoned
- 2003-06-06 CN CNB038155524A patent/CN100335630C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-06-06 DK DK03757145T patent/DK1511843T3/da active
- 2003-06-06 US US10/516,741 patent/US20060121464A1/en not_active Abandoned
- 2003-06-06 EP EP03757145A patent/EP1511843B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-06-06 DE DE60304345T patent/DE60304345T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-06-06 WO PCT/GB2003/002459 patent/WO2003104455A1/en not_active Application Discontinuation
- 2003-06-06 AT AT03757145T patent/ATE321851T1/de not_active IP Right Cessation
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999064582A2 (en) * | 1998-06-12 | 1999-12-16 | Introgene B.V. | High-throughput screening of gene function using libraries for functional genomics applications |
WO2001073000A2 (en) * | 2000-03-24 | 2001-10-04 | Maxygen, Inc. | Methods for modulating cellular and organismal phenotypes |
EP1143013A1 (en) * | 2000-04-03 | 2001-10-10 | Warner-Lambert Company | Methods and compositions for screening Icrac modulators |
CN1330154A (zh) * | 2000-06-27 | 2002-01-09 | 南京益来基因医学有限公司 | 细胞微阵列芯片及其制备方法 |
WO2002004943A2 (en) * | 2000-07-07 | 2002-01-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Electrophysiology configuration suitable for high throughput screening of compounds for drug discovery |
WO2002024862A2 (en) * | 2000-09-19 | 2002-03-28 | Cytion S.A. | Sample positioning and analysis system |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1665928A (zh) | 2005-09-07 |
DE60304345D1 (de) | 2006-05-18 |
DK1511843T3 (da) | 2006-07-24 |
CA2488449A1 (en) | 2003-12-18 |
EP1511843A1 (en) | 2005-03-09 |
WO2003104455A1 (en) | 2003-12-18 |
DE60304345T2 (de) | 2006-11-30 |
US20060121464A1 (en) | 2006-06-08 |
AU2003251124A1 (en) | 2003-12-22 |
EP1511843B1 (en) | 2006-03-29 |
ATE321851T1 (de) | 2006-04-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101902526B1 (ko) | 특이적 프로모터의 작제 방법 | |
US6395872B1 (en) | Secreted neural adhesion proteins | |
CN108359692B (zh) | 一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统 | |
WO2022159402A1 (en) | Composition and method for high-multiplexed genome engineering using synthetic crispr arrays | |
CN100335630C (zh) | 筛选方法 | |
WO2020180506A1 (en) | Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells | |
CA2385134A1 (en) | Template molecule having broad applicability and highly efficient function means of cell-free synthesis of proteins by using the same | |
US20080299546A1 (en) | Canine Cd20 Gene | |
WO2023034913A2 (en) | Methods of in situ total rna-based transcriptome profiling for large-scale subcellular structure profiling | |
CN111088272A (zh) | 一种双启动子表达载体及其构建方法 | |
EP2216340A1 (en) | Isoforms of human somatostatin receptor type 5 produced by alternative processing and oligonucleotide pairs for detection thereof by pcr | |
EP1078987A1 (en) | Method for examining central nervous system diseases and method for screening remedies | |
CN105695509B (zh) | 一种获得高纯度心肌细胞的方法 | |
US20180298425A1 (en) | Differential shearing of nucleic acids | |
US11802866B2 (en) | High-throughput screening system for identification of novel drugs and drug targets | |
CN111440783B (zh) | 一种caii的突变体及其应用 | |
US20070128168A1 (en) | Novel genes regulated in the developing human ventral mesencephalon | |
WO2023102481A1 (en) | Trackable nucleic acid-guided editing | |
Benson | Of Molecules and Mechanisms | |
CN114934106A (zh) | 一种高通量酵母双杂交文库筛选方法 | |
WO2023245010A2 (en) | Crispr-transposon systems for dna modification | |
Araki | Single Nuclei RNA Sequencing of Mice Hippocampus to Evaluate in vivo Gene Editing by a Biodegradable Nanocage for CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins | |
CN1238504C (zh) | 一个肿瘤相关基因及其应用 | |
CN114586735A (zh) | Pparg基因定点突变小鼠模型的构建与应用 | |
EP4373957A1 (en) | Method for the identification of the whole sequence of the variable region of the heavy and light chains of immunoglobulins |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20070905 Termination date: 20180606 |