CN111870566A - 一种从酒糟中提取复合酵母菌发酵产物的方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从酒糟中提取复合酵母菌发酵产物的方法与应用，该方法包括如下步骤：S1提取：使用溶剂提取酒糟后，固液分离获取上清液L1；S2除杂：去除L1中大分子物质，得L2；S3脱色：去除L2中色素物质，得到澄清液体L3；S4赋形：加入抗氧化剂/防腐剂，或浓缩，或干燥成固体，得到所述产物。本发明首次从酒糟中提取出了富含独具特色美肌因子的复合酵母发酵产物使之应用于化妆品制备，填补了相关技术空白。该复合酵母发酵产物的制备方法解决了目前技术中分子量大小不一，皮肤不易吸收，颜色过深、具有不良气味等缺点，达到了化妆品对吸收率、颜色、气味等指标的要求，获得了较好的效果。

Description

一种从酒糟中提取复合酵母菌发酵产物的方法与应用

技术领域

本发明涉及一种从酒糟中提取复合酵母菌发酵产物的方法与其在化妆品制备中的应用，属于化妆品制备技术领域。

背景技术

随着发酵产品被广大用户所熟知，人们对发酵产品的认知也越来越加深。经酵母菌发酵后处理得到的发酵产物滤液，含有丰富的氨基酸、多肽、矿物质以及各种维生素，它们是人体天然保湿因子(NMF)的重要组成部分，在改善皮肤条件上起着重要的作用。

如中国专利CN108272645A，公开了一种含二裂酵母发酵产物胞溶物的精华液及其制备方法，可达到补充面部肌肤水分、提亮肤色、降低皱纹数量和深度等一系列延缓皮肤衰老的技术功效。证明以酵母菌为代表的益生菌发酵产品在护肤品领域得到了广泛认可和应用。但是随着发酵产品的不断增多，发酵产品的来源也备受关注。

另一方面，我国的酿酒历史长达数千年，而酒糟是每种类型酒生产过程中都会产生的酿酒副产物。具有中国特色的白酒酒糟，其安全性经常长时间的验证，目前主要用途为动物饲料原料，经济附加值较低。但是从营养学角度讲，酒糟的价值高于酒的价值，更富含各类健康天然的发酵源美肌成分；且酒糟价格低廉、来源广泛，具有很高的开发和应用价值。

中国专利CN107988297A公开了一种从酒糟中提取小分子肽的制备方法，并公布了该种酒糟小分子肽在护肤品中的应用，然而该方法仅仅针对了酒糟中的大分子蛋白质物质，而非对酒糟中存在的大量其他醇溶性复合酵母菌发酵产物并未涉及；中国专利CN105816414A公布了一种酵母水及其制备方法与在化妆品中的应用，该酵母水由酵母菌的水溶性发酵产物和溶胞产物滤液构成，是较为全面的酵母菌发酵产物，然而该发明中所提及的酵母为单一菌种，不是传统酿酒中包含多种酵母菌和乳酸菌的混合发酵，同时原料也不是酒糟。目前并未有任何报道提及充分利用酒糟中具有美肌功效的复合酵母发酵产物及其在化妆品中的应用。

因此，以酒糟为原料，提取一种具有保湿修复功效的复合酵母菌发酵产物及其制备方法并应用于化妆品中，既可以增加酒糟的附加值，又可以提升护肤品的补水保湿、改善皮肤屏障和抗衰老等功效，具有很好的经济效果和应用价值。

发明内容

本发明目的在于为克服现有技术的缺陷与不足，提供一种从酒糟中提取复合酵母菌发酵产物的方法与其在化妆品制备中的应用。

据信，本领域中技术人员可基于本文说明书充分利用本发明。以下具体实施方案应被理解为仅是说明性的，并且无论如何都不会以任何方式限制本公开的其余部分。除非另有定义，否则本发明使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。另外，本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献以引用方式并入本文。除非另外指明，否则用于表达成分的量的百分比为重量百分比(即，％(W/W))。类似地，用于表达成分的相对比例的重量比也使用重量百分比来确定(即，通过将一种成分与另一种成分的重量百分比相除来计算重量比)。除非另外阐明，否则

所有范围均包括端值，例如，“1至9”包括端值1和9。在本发明中，“护肤品”是指能保留、恢复、给予、刺激或增强体美外观或似乎能增进美貌或年轻的美化物质或制品，尤其是涉及组织或皮肤的外观时。在本发明中，“修复和保湿”意指但不限于改善皮肤缺乏水分、缺乏皮脂、破裂、干燥、发痒、鳞屑、干皮、脱水、缺乏柔韧性、缺乏光彩、无光泽或缺乏脂质的情况。

本发明发现，局部施用提取自酒糟的复合酵母发酵产物能够出乎意料的提供良好皮肤保湿性和改善皮肤屏障和抗衰老等有益效果。

该复合酵母发酵产物具体如下特征：

(1)该产物提取自酒糟；

(2)该产物可以为澄清的无色、白色、黄色、棕色液体或白色、黄色、棕色的固体；

(3)该产物可以为滤液、发酵液、原浆、原液、浓缩液、无菌液、无菌上清液或干粉形式；

(4)该产物包含有机酸/有机酸盐；

(5)该产物包含蛋白质/胜肽/氨基酸；

(6)该产物包含多元醇。

具体的，该产物为分子量主要分布为1～10000Da。优选为分子量主要分布于1～1000Da，更优选为分子量主要分布于1～500Da，最优选为分子量主要分布于1～300Da；

该产物中的有机酸/有机酸盐为一种或几种单一水基果酸(AHA)及其盐类的混合。优选为乳酸、醋酸、柠檬酸及其盐类中一种或几种的混合，更优选为乳酸、乳酸钠、乳酸钾、乳酸钙、乳酸铵、乳酸镁、醋酸、醋酸钠、醋酸钾、醋酸钙、醋酸铵、乳醋镁、柠檬酸、柠檬酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸铵、柠檬酸钙、柠檬酸铵、柠檬酸镁中的一种或几种的混合，最优选为含有乳酸/乳酸钠/乳酸钾的混合。

该产物中有机酸/有机酸盐含量优选为0.1％～50％(w/w)，更优选为1％～25％，最优选为2.5％～12.5％。

该产物中蛋白质/胜肽/氨基酸优选为0.1％～50％(w/w)，更优选为0.1％～25％，最优选为0.5％～25％。

该产物中的多元醇为丙二醇、丙三醇、丁二醇、聚二丙三醇、戊二醇、己二醇、木糖醇中的一种或几种混合。

该产物中多元醇含量优选为0.1％～50％(w/w)，更优选为1％～25％，最优选为2.5％～12.5％。

该产物还包含以下物质中的一种或几种混合：0.001％～5％，优选为0.1％～2％的糖类；0.001％～5％，优选为0.1％～2％的脂质；0.0001％～5％，优选为0.1％～1％的维生素；0.0001％～5％，优选为0.1％～1％的角鲨烯，0.001％～5％的矿物元素，优选为0.1％～2％的钙/磷/镁中的1种或几种混合物。

本发明的技术方案中采用的酒糟包括啤酒糟、红酒糟、清酒糟、米酒糟、黄酒糟、白酒糟、酱香白酒糟、浓香白酒糟中的一种或几种的混合。优选为新鲜/冰冻储藏/干燥储藏的白酒酒糟，更优选为新鲜/冰冻储藏/干燥储藏的酱香型白酒酒糟，最优选为新鲜的茅台镇酱香型白酒酒糟。

本发明的技术方案如下：一种从酒糟中提取复合酵母菌发酵产物的方法，该方法包含以下步骤：

S1提取：使用溶剂提取酒糟后，固液分离获取上清液L1；

S2除杂：去除L1中大分子物质，得L2；

S3脱色：去除L2中色素物质，得到澄清液体L3；

S4赋形：加入抗氧化剂/防腐剂，或浓缩，或干燥成固体，得到所述产物。

其中，步骤S1中所用酒糟提取溶剂为水、甲醇、乙醇、丁醇、乙醚、正己烷、环己烷、丁二醇、丙二醇中的一种或多种混合，或者使用超临界状态的二氧化碳与溶剂的混合物。优选为水、甲醇或乙醇中的一种或多种混合，更优选为去离子水、10％～80％(v/v)的甲醇或乙醇中的一种或多种混合，最优选为去离子水。

进一步的，步骤S1中，料液比1:1～1:30，温度0～120摄氏度，提取时间0.5h～24h，优选为1:1～1:6，温度50～70摄氏度，时间2h～4h。

进一步的，步骤S2中，去除大分子物质方式包括过滤、醇沉或离心中的一种或几种的组合。优选为超滤膜过滤，最优选为10000Da超滤膜过滤。

优选的，在S1和S2之间添加如下处理步骤：pH值调为4～6，加入酸性蛋白酶，温度控制在30～50摄氏度，酶用量为0.001％～1％，搅拌，充分反应。

其中，pH调节剂为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中的一种或几种混合。该步骤主要是为了将酒糟复合酵母发酵产物中的大分子蛋白质转为皮肤易吸收并具有保湿、滋养和抗衰老功能的胜肽/小分子肽/氨基酸等物质，进一步提高酒糟复合酵母发酵产物的利用率和所述产物在化妆品领域的功效性。

进一步的，步骤S3中，去除色素方式包括过滤、吸附或大孔树脂中的一种或几种的组合。优选吸附剂为活性炭或白陶土。最优选为每升L2加入5g活性炭；优选过滤方式为膜过滤，取透过液，最优选为500Da的纳滤膜过滤。500Da以下的分子是公认的皮肤最易吸收的分子质量，并且通过此步骤能够有效去除发酵产物中的不良气味和色素，使得产物符合化妆品的相关指标要求。

进一步的，步骤S4中，添加防腐剂为山梨酸钾、戊二醇和对羟基苯乙酮中的一种或多种组合，抗氧化剂为维生素C、维生素E、茶多酚中的一种或多种组合。优选的防腐剂/抗氧化剂为山梨酸钾/维生素E。

优选的，在S3和S4之间添加如下处理步骤：通过蒸馏的方式使得产品不含酒精或少含酒精。优选的蒸馏方式为减压蒸馏去除总体积10％的液体。更优选为减压蒸馏至产品中不含酒精。由于酒精会对一些过敏性皮肤产生负面影响，为了产品能够适合更多的肤质，因此可以去除产品中的酒精。

一种从酒糟中提取的复合酵母菌发酵产物，具有前述特征，并通过前述制备方法得到。该复合酵母菌发酵产物在制备化妆品中得到应用。

其中，该复合酵母菌发酵产物制备化妆品的形式是水剂、水凝胶、泡沫凝胶、巴布剂、膜剂、乳膏体、冻干粉、乳化体系和表面活性剂体系；其中，乳化体系和表面活性剂体系可以为洗面奶、沐浴露、化妆水、护肤啫喱、护肤乳液、护肤霜、精华液、眼霜、喷雾等形式。这些形式可通过本领域技术人员熟知的方法制备。

该复合酵母菌发酵产物具有优良的补水保湿、改善皮肤屏障和抗衰老等功效，可应用于制备抗衰、抗皱、修复皮肤屏障和保湿的美容护肤化妆品。

本发明与现有技术相比具有如下优点和效果：

本发明首次从酒糟中提取出了富含独具特色美肌因子的复合酵母发酵产物使之应用于化妆品制备，填补了相关技术空白。

该复合酵母发酵产物的制备方法解决了目前技术中分子量大小不一，皮肤不易吸收，颜色过深、具有不良气味等缺点，达到了化妆品对吸收率、颜色、气味等指标的要求，获得了较好的效果。

采用本发明提供的制备方法，工艺流程简单，操作方便，产品质量稳定，有可操作性，同时成本低廉，是适合与工业生产的制备方法。

本发明一方面能够提高酿酒废弃物酒糟的附加值，另一方面能够有效改善护肤品中的保湿补水、修复皮肤屏障和抗衰老功效。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

以下实施例中涉及的数值、份数或比例如无标注，均为质量数值、质量份数或质量比例。其中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1：

一种从酒糟中提取的复合酵母菌发酵产物制备方法，该方法包含以下步骤：

S1，将新鲜的酱香型白酒酒糟使用去离子水提取，提取条件为：固液比1:10，提取时间3h，提取温度50℃，提取后固液分离，收集液相L1；

S2，使用氢氧化钾将L1的pH值调为5，加入酸性蛋白酶0.02％进行水解，水解条件为：温度50℃，水解时间2h，转速120r/min；

S3，使用10000Da超滤膜过滤，去除高分子物质、部分色素、微生物和酶；

S4，使用500Da纳滤膜过滤，去除色素、过敏原和皮肤不易吸收的大分子物质；

S5，旋转蒸发去除酒精；

S6，添加维生素E和山梨酸钾作为抗氧化剂和防腐剂，制得复合酵母菌发酵产物1，该产物为澄清的棕色液体，无明显酒糟气味或特殊发酵气味。

实施例2：

一种从酒糟中提取的复合酵母菌发酵产物制备方法，该方法包含以下步骤：

S1，将冰冻的茅台酒酒糟使用去50％乙醇提取，提取条件为：固液比1:20，提取时间6h，提取温度50℃，提取后固液分离，收集液相L1；

S2，使用80％乙醇进行醇沉，去除高分子物质；

S3，使用活性炭进行吸附脱色除味，添加量为6％，温度50℃保持1h，固液分离得L2；

S4，使用300Da纳滤膜过滤L2，去除色素、过敏原和皮肤不易吸收的大分子物质；

S5，旋转蒸发去除酒精，得液体L3；

S6，L2浓缩，添加维生素E和山梨酸钾作为抗氧化剂和防腐剂，制得复合酵母菌发酵产物2，该产物为澄清的金黄色液体，无明显酒糟气味或特殊发酵气味。

实施例3：

一种从酒糟中提取的复合酵母菌发酵产物制备方法，该方法包含以下步骤：

S1，将干燥的浓香型白酒酒糟磨至40目以下，使用去离子水提取，提取条件为：固液比1:8，提取时间4h，提取温度60℃，提取后固液分离，收集液相L1；

S2，使用氢氧化钠将L1的pH值调为5，加入酸性蛋白酶0.05％进行水解，水解条件为：温度50℃，水解时间2h，转速120r/min，得L2；

S3，使用陶瓷膜过滤L2，去除高分子物质、部分色素、微生物和酶，得L3；

S4，使用活性炭对L3进行吸附脱色除味，添加量为6％，温度50℃保持1h，固液分离得L4；

S5，使用500Da纳滤膜过滤，去除色素、过敏原和皮肤不易吸收的大分子物质，得L5；

S6，将L5浓缩冷冻干燥，得到冻干粉，制得复合酵母菌发酵产物3，该产物为棕色粉末，无明显酒糟气味或特殊发酵气味。

实施例4：

一种从酒糟中提取的复合酵母菌发酵产物制备方法，该方法包含以下步骤：

S1，将干燥的酱香型白酒酒糟磨至40目以下，使用去离子水提取，提取条件为：固液比1:5，提取时间2h，提取温度70℃，提取后固液分离，收集液相L1；

S2，使用80％乙醇醇沉，去除高分子物质，得L2；

S3，使用10000Da超滤膜过滤L2，得L3；

S4，使用300Da纳滤膜过滤，去除色素、过敏原和皮肤不易吸收的大分子物质，得L4；

S5，旋转蒸发去除酒精，得液体L5；

S6，L5添加维生素E和山梨酸钾作为抗氧化剂和防腐剂，制得复合酵母菌发酵产物4，该产物为澄清的淡黄色液体，无明显酒糟气味或特殊发酵气味。

上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

本发明的相关检测结果如下：

(1)安全性检测：

人体斑贴实验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本发明对实施例1-4制备的发酵产物进行人体封闭式斑贴实验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。

实验对象：在知情且同意的前提下，招募志愿者30名，年龄范围18-50岁。

实验方法如下：

1.将0.2mL的发酵产物低价在滤纸片上，再将滤纸片置于斑贴器，作为实验组；将0.2mL蒸馏水滴加在滤纸上，作为空白对照。

2.利用无刺激胶带将一个实验组斑贴和一个空白组斑贴分别固定贴敷于同一受试者背部不同部位，持续24h，然后去除斑贴，从去除斑贴开始计时，于1h后观察皮肤的反应。

实验结果如表1所示。

表1各符号含义如下：“-”表示阴性反应；“±‘’表示可疑反应：仅有微弱红斑；“+”表示若阳性反应：红斑、浸润、水肿等不良反应；“++”表示强阳性反应：红斑、浸润、水肿等不良反应，且超出受试区。

根据化妆品卫生规范2007:30例受试者中出现1级皮肤不良反应(±)的人数多于5例，或出现二级皮肤不良反应(+)的人数多于2例，或出现任何1例三级以上皮肤不良反应(++)时，则判断受试物对人体有不良反应；反之，则视为对人体无不良反应。

表1斑贴实验结果

反应程度	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4
					-	29	28	30	30
±	1	2	0	0
					+	0	0	0	0
++	0	0	0	0

其中对照组阴性反应均为30人。

从表1可以看出：本发明提供的发酵产物具有安全性，不会给人体带来不良反应。

(2)保湿效果的检测：皮肤角质层水合率实验

采用世界公认的Cornemeter法—电容法：按照含水量的不同，适当形状的测量用电容器会随着皮肤的电容量的变化而变化，而皮肤的电容量又是在测量的范围内，这样就可以测量出皮肤的水分含量。电容量的测量方法比其他方法更优越，由于被测试皮肤和测试探头没有不自然的接触，几乎没有电流通过被测试皮肤，因此测试结果实际上不受极化效应和离子导电率的影响。仪器探头和皮肤中水分建立平衡过程中没有惯性，可以实现快速测量，这样同时也消除了活性皮肤对测量结果的影响。

实验方法：测试区域：手后臂内侧

实验前，受试者需要统一清洁后臂内侧，用干的面巾纸搽拭干净，清洁后在受试者后臂内侧做好测量区域标记，正式测试前应该在符合标准的房间内静坐至少0.5h，前臂暴露，呈测试状态放置，保持轻松。

实验中前臂内侧标记2×4cm²实验区域，同一手臂可同时标记多个区域，区域间隔2cm。测试产品和空白对照均随机分布在手前臂上，先测量各测试区域清洁后0.5h的空白值，然后按2.0±0.1mg样品/cm²的用量，使用乳胶指套将受试样均匀涂布于实验区内，涂抹后分别测量0.5h、1h、2h、4h受试区域和对照区域的皮肤水分含量。同一个志愿者的测量由同一个测量人员完成。

水合率＝(测试值-空白对照值)/空白对照值*100％

保湿效果的测试结果如下表2：

表2

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4
					0.5h	82％	80％	70％	75％
2h	77％	74％	62％	71％
					4h	74％	69％	61％	62％
8h	58％	61％	30％	39％

从表2可以看出，不同实施例的发酵产物均有良好的保湿效果，其中以实施例1和2的保湿效果最好。

(3)刺激胶原蛋白生产

胶原蛋白是人体皮肤的主要部分，起到支撑器官，保护机体的功能。同时胶原蛋白是维持皮肤与肌肉弹性的主要部分，随着年龄的增长、紫外线照射、氧化、糖化等内外因素，胶原蛋白的合成能力下降，皮肤的胶原蛋白含量每年以1％的速度递减，一担胶原蛋白缺失，细胞间粘多糖减少，胶原蛋白与弹性蛋白交互构成有规则的王母结构会逐渐崩解，同时可大致真皮纤维断裂，脂肪萎缩，最终会导致皮肤失去弹性，变薄变老化，出现色斑，皱纹，皱裂等一系列老化现象。

1.将实施例1-4的发酵产物用DMEM培养基稀释，配制成含量0.05％、0.5％和5％的待测液(将无血清的DMEM培养基作为空白对照)。

2.将人成纤维细胞接种至96孔板，培养至细胞贴壁后去除上清液，然后每孔加入100μL待测液并培养24h。培养条件为温度37℃，二氧化碳浓度5％。

3.取步骤2中得到的培养液，采用人I型胶原酶联免疫检测试剂盒检测人I型胶原的浓度。

其结果见表3。

表3

由表3可知，不同实施例均有促进胶原蛋白合成的作用，其中实施例4的胶原蛋白浓度在0.5％时达到峰值，相比对照组提高了209％。结果表明，本发明的酒糟复合酵母发酵产物有促进胶原蛋白合成，从而起到减缓皮肤衰老的功效。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种从酒糟中提取复合酵母菌发酵产物的方法，该产物提取自酒糟；该产物为澄清的无色、白色、黄色、棕色液体或白色、黄色、棕色的固体；该产物为滤液、发酵液、原浆、原液、浓缩液、无菌液、无菌上清液或干粉形式；该产物包含有机酸/有机酸盐；该产物包含蛋白质/胜肽/氨基酸；该产物包含多元醇，其特征在于该方法包括如下步骤：

S1提取：使用溶剂提取酒糟后，固液分离获取上清液L1；

S2除杂：去除L1中大分子物质，得L2；

S3脱色：去除L2中色素物质，得到澄清液体L3；

S4赋形：加入抗氧化剂/防腐剂，或浓缩，或干燥成固体，得到所述产物。

2.根据权利要求1所述的从酒糟中提取复合酵母菌发酵产物的方法，其特征在于：步骤S1中所用酒糟提取溶剂为水、甲醇、乙醇、丁醇、乙醚、正己烷、环己烷、丁二醇、丙二醇中的一种或多种混合，或者以上一种或多种混合的物质与超临界状态的二氧化碳的混合物。

3.根据权利要求2所述的从酒糟中提取复合酵母菌发酵产物的方法，其特征在于：步骤S1中提取条件如下：料液比1:1～1:30，温度0～120摄氏度，提取时间0.5h～24h，所述料液比指酒糟与提取溶剂的质量比。

4.根据权利要求1所述的从酒糟中提取复合酵母菌发酵产物的方法，其特征在于：步骤S2中去除大分子物质方式包括过滤、醇沉或离心中的一种或几种的组合。

5.根据权利要求4所述的从酒糟中提取复合酵母菌发酵产物的方法，其特征在于：步骤S2中去除大分子物质方式是采用1000Da超滤膜过滤。

6.根据权利要求1所述的从酒糟中提取复合酵母菌发酵产物的方法，其特征在于：还包括在步骤S1和S2之间的如下处理步骤：pH值调为4～6，加入酸性蛋白酶，酶用量为0.001％～1％，温度控制在30～50摄氏度，搅拌，充分反应。

7.根据权利要求5所述的从酒糟中提取复合酵母菌发酵产物的方法，其特征在于：pH调节剂为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中的一种或几种混合。

8.根据权利要求1所述的从酒糟中提取复合酵母菌发酵产物的方法，其特征在于：步骤S3中去除色素方式包括过滤、吸附或大孔树脂中的一种或几种的组合；步骤S4中添加防腐剂为山梨酸钾、戊二醇和对羟基苯乙酮中的一种或多种组合，抗氧化剂为维生素C、维生素E、茶多酚中的一种或多种组合。

9.按照权利要求1-9中任意一项所述方法制备得到的复合酵母菌发酵产物。

10.权利要求1-9中任意一项所述方法制备得到的复合酵母菌发酵产物在制备具有补水保湿和改善皮肤屏障的功能的化妆品中的应用。