CN1118575C - 番茄植酸酶基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种番茄植酸酶基因。现有的植酸酶基因来源微生物，易产生过敏反应，不能作食品添加剂。本发明提供了含1356碱基对的番茄植酸酶基因，452个氨基酸蛋白质；其编码包括完整的阅读框，因来源于植物植酸酶，无过敏反应，用转基因技术可研制有机磷高效利用型作物新品种、食品添加剂和保健食品、饲料添加剂。以适应现代人对健康的需求、促进“再生磷”的有效循环利用，并可推动农业、畜牧养殖业持续稳定发展。

Description

番茄植酸酶基因

技术领域

本发明涉及一种生物技术，特别涉及一种植物植酸酶基因。

背景技术

       植酸盐(Phytin)是一种肌醇六磷酸的复合盐，是磷、糖和各种金属离子的重要贮藏形态，大量存在于植物种子及花粉粒中。植物种子或花粉发芽时，在植酸酶的作用下将其水解为肌醇和无机磷酸及其盐类，作为新生命萌芽时的磷供给，为种子萌发和幼苗生长所利用。最初人们对植酸酶研究的兴趣来自饲料工业，因植酸是一种强抗营养剂，常与食物中人和动物所必须的钙、铁、锌、镁等鏊合形成难溶性植酸盐，降低其生物利用率，植酸酶能有效降解植酸盐，提高食物和土壤中磷和其他微量元素的生物利用率。目前植酸酶制剂主要用于饲料加工业中的添加剂。最近欧共体推出了三种植酸酶制剂，即荷兰Gise-rocades公司的“自然磷”(Natuphos)，美国Allzyme公司的“奥吉美”植酸酶(Allzyme Phytase)和芬兰AIKO Biotechnology公司推出的猪多酶系列产品(如多酶SP、TP、SF等)。这些制剂仍是一种黑曲霉发酵产物，虽可节省磷，但酶制剂加工成本高、价格昂贵，实用推广难度较大，而且容易产生过敏反应，不能用作食品添加剂。

随着世界人口增加，磷矿资源短缺日见突出。日本作为磷矿石主要进口国，首先意识到磷资源短缺的威胁，率先把目光转向运用基因工程方法探索高效利用土壤有机磷(土壤有机磷主要以植酸态、核酸、磷脂态等植物不能直接吸收利用的形态存在)的新途径。最近，日本北海道大学分离了分泌性磷酸酶基因，试图用转基因方法培育高效分泌磷酸酶的作物，作为应付磷资源危机的对策之一。然而，酸性磷酸酶虽然分解核酸态和磷脂态有机磷活性较强，但对土壤中有机磷的主要形态——植酸态有机磷的分解能力极低。因此，酸性磷酸酶转基因作物实用性和推广价值很低。

自植酸酶由日本学者Suzuki等(1902年)在米糠中发现以来。科学家对植酸酶进行了长期研究。植酸酶能有效降解植酸盐，提高食物和土壤中磷和其它微量元素的生物利用率，由此植酸酶的开发利用，引起人类和动物营养学家关注。随着分子克隆技术的迅速发展，80年代后期，对植酸酶基因克隆的研究也逐渐兴起。目前，国内外有关曲酶植酸酶基因克隆研究较多，但对植物植酸酶基因克隆研究较少，联网检索(1970-1999年)查出关于植酸酶基因克隆研究的文献16篇，其中有15篇是关于曲霉(A.niger)植酸酶基因克隆的研究报道。已经克隆的曲霉(A.niger)植酸酶基因有：Phy A，Phy B和热稳定三种类型。曲霉(A.niger)植酸酶基因已获得欧洲专利(EP0420358-A 40 03-APR-1991)。但是，从微生物分离的植酸酶基因用于食品开发，容易引起过敏反应和人们心理恐惧，不易被消费者接受。因此，曲霉植酸酶基因不能用于开发人类的食品添加剂。此外，将曲霉植酸酶基因导入植物培育转基因作物，同样会带给人们过敏危害和心理恐惧。为此科学家一直期望能够从植物中分离并克隆植物植酸酶基因。法国的S.Maugenest等(1997)虽然从玉米幼苗中克隆了植酸酶基因，遗憾的是该基因在大肠杆菌中未表达出有活性的植酸酶，无产品开发和实用价值。

目前国内外尚未见番茄植酸酶基因的报道。

发明内容

本发明的目的是分离一种可用作开发且易于消费者接受，无过敏反应的植酸酶分泌型酵母食品添加剂，缓解磷资源短缺，能培育土壤有机磷高效利用型农作物新品种的番茄植酸酶基因。

本发明技术方案是：番茄植酸酶基因含1356碱基对，蛋白质编码区包括完整的阅读框，编码为452个氨基酸蛋白质，该基因的碱基顺序及编码蛋白如图10所示。

番茄植酸酶基因与曲霉植酸酶基因Phy A有30个氨基酸相似(图10中画底线部分)，与玉米植酸酶基因有63％同源率，但属不同的植酸酶基因。

番茄植酸酶基因，通过转基因技术可研制土壤有机磷利用型作物新品种转基因大豆、食品添加剂和保健食品、植酸酶分泌型酵母饲料添加剂。

本发明的番茄植酸酶基因分离方法是：采用异硫氰酸胍法从发芽3-4天的番茄幼苗中提取出总RNA，用Oligo(dT)纤维素亲和层析分离纯化mRNA。以mRNA为模板，Oligo(dT)为引物用逆转录法合成双链cDNA。将cDNA与EcoRI接头连接后克隆到表达载体λgt11的单一EcoRI位点，经体外包装后感染宿主菌Y1090，构建了番茄幼苗cDNA文库。用颜色筛选法筛选重组子，然后用植酸酶抗体做探针进行免疫筛选，得到两个阳性克隆。挑取阳性克隆噬菌斑扩增后纯化DNA，切出插入片段，获得全长cDNA克隆Phyt1，将该cDNA克隆到大肠杆菌后表达出有活性的植酸酶蛋白。

本发明技术的优点和积极效果是：我们分离的番茄植酸酶来源于植物，编码植物植酸酶蛋白，表达活性高，不会引起人类过敏反应，可通过转基因技术在番茄植酸酶基因上游添加酵母α-因子前导序列，构建分泌性表达载体，导入面包酵母菌，筛选出能大量分泌植酸酶的酵母工程菌，开发高效植酸酶分泌型酵母饲料和食品添加剂。酵母营养丰富无毒无害、本身富含蛋白质和维生素等营养成分，再导入来源于植物的植酸酶基因，开发植酸酶高效分泌型酵母食品和饲料添加剂，既能补充营养，又能增加食物和饲料中矿质元素的营养有效性和蛋白质消化率，提高其能量利用效率。既无过敏之忧，易于被消费者接受，又省去植酸酶分离和制剂加工过程，成本低廉，具有很大的经济效益和社会效益。本发明可直接用于开发新型保健食品和高效饲料添加剂，适应人们对健康食品的新需求，对推动畜牧养殖业的发展有重要意义。番茄植酸酶基因也可通过转基因技术开发土壤有机磷高效利用型作物新品种，有效循环利用土壤“再生磷”，缓解磷资源短缺，保证农业持续稳定发展，具有深远意义。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。

附图说明

图1是番茄幼苗总RNA电泳图谱。图2是mRNA亲和层析洗脱图谱。图3是mRNA电泳图谱。图4是cDNA合成的条件和基本过程。图5是cDNA碱变性凝胶电泳放射性自显影结果。图6是cDNA与EcoR I接头连接、DNA的磷酸化过程及反应条件。图7是cDNA插入片断与λgt11载体的连接过程。图8是目的克隆的免疫探针筛选结果。图9是含目的插入片断的λgt11 DNA克隆(Phyt1)电泳结果。图10是番茄植酸酶基因的碱基序列和编码蛋白。

具体实施方式

实施例1

番茄植酸酶基因分离方法及过程：

1.总RNA提取：

图1是番茄幼苗总RNA电泳图谱。泳道1：2.8μg，泳道2：7.5μg，泳道3：15.0μg。采用异硫氰酸胍法从发芽3-4天的番茄幼苗中提取出总RNA。

2.mRNA的分离与纯化

图2是mRNA亲和层析洗脱图谱。用Oligo(dT)纤维素亲和层析法分离纯化mRNA。

图3是mRNA电泳图谱。泳道1：mRNA 2μg，泳道2-3：3μg，泳道4：上过柱的总RNA。

3.cDNA合成：

图4是cDNA合成的条件和基本过程。以mRNA为模板，Oligo(dT)为引物用逆转录法合成双链cDNA。

图5是cDNA碱变性凝胶电泳放射性自显影结果。泳道1为样品第一链cDNA，泳道2为对照第一链cDNA(1.2kb)，泳道3为样品双链cDNA，泳道4为对照双链cDNA(1.2kb)。

4.cDNA文库构建：

图6是cDNA与EcoR I接头连接、DNA的磷酸化过程及反应条件。将cDNAEcoR I接头连接后克隆到表达载体λgt11的单一EcoR I位点，经体外包装后感染宿主菌Y1090，构建了番茄幼苗cDNA文库。

图7是cDNA插入片断与λgt11载体的连接过程。

5.植酸酶基因克隆的筛选。

图8是目的克隆的免疫探针筛选结果。箭头所指目的克隆噬菌斑。用颜色筛选法筛选重组子，然后用植酸酶抗体做探针进行免疫筛选，从1.5×10⁵个克隆中筛选出两个阳性目的克隆，命名为Phyt1和Phyt2。

6.目的基因DNA片段的回收与检测：

图9是含目的插入片断的λgt11 DNA克隆(Phyt1)电泳结果。泳道1为λgt11 DNA，泳道2为λgt11 NDA经EcoR I酶切；泳道3为重组λgt11 NDA经ECoR I酶切。

挑取阳性克隆噬菌斑扩增后纯化DNA，切出插入片段，采用琼脂糖电泳检测，证明cDNA克隆Phyt1为全长，cDNA克隆Phyt2为非全长片段。

7.Phyt cDNA测序：

图10是番茄植酸酶基因的碱基序列和编码蛋白

图中奇数行表示基因的碱基序列(A、C、G、T)，偶数行表示翻译为蛋白质的氨基酸序列。

采用双脱氧末端终止法和核酸序列自动分析仪对该cDNA克隆Phyt1进行测序，结果表明，该cDNA包括完整的阅读框，含1356碱基对，番茄植酸酶基因的蛋白质编码区。如图10所示。

8.番茄植酸酶在大肠杆菌中的表达：

图11是番茄植酸敏基因表达载体结构图谱。Phyt1为番茄植酸酶基因，Hc、Ps、Hp为限制性内切酶位点。番茄植酸酶基因表达载体构建、转化及测试步骤如下：

①分泌性表达构建：将植酸酶基因克隆到分泌性表达载体pINIII-(lpp^p-5)-ompA的EcoRI位点，构建载体载体pINIII-Phyt1，如图11所示。

②转化大肠杆菌：用LE392制备感受态细胞，将含番茄植酸酶基因的重组载体导入大肠杆菌细胞，借助lpp(脂蛋白基因启动子)进行表达，通过Amp筛选出转化菌落。

③植酸酶活性测定：通过以植酸钙为底物，用测定每分钟无机磷释放量的方法测定细胞内外植酸酶活性，结果显示，重组体分泌性植酸酶活性比对照高10倍以上。

实施例2：土壤有机磷高效利用型转基因大豆开发

图12是番茄植酸酶中间载体的构建过程

图13是转植酸酶基因大豆植株

图14是转植酸酶基因大豆植株的Southern和Northern检测结果。S Southern杂交结果，N Northern检测结果(b，c为对照)。

转基因大豆的分子检测，用Southern和Northern印迹杂交鉴定外源基因存在和表达状况。

土壤有机磷高效利用型转基因大豆开发步骤如下：

①构建含植酸酶基因中间质粒载体，如图12所示。将番茄植酸酶基因Phyt1克隆到载体Co24的EcoR I位点，构建含植酸酶的中间载体。

②将植酸酶基因转移到土壤农杆菌(三亲交配法)。

③用农杆菌介导法进行大豆遗传转化，选适当的外植体(如7-10天无菌苗子叶节等)，与含植酸酶基因的供体菌共培养，进行转化，通过诱导培养、分化培养和生根培养等过程获得转基因大豆植株，如图3所示。用Southern法进行分子杂交检测结果，如图14所示。可见，植酸酶基因已整合到植物染色体上，并能表达高活性的植酸酶(比对照高3-5倍)。

实施例3：植酸酶分泌型酵母饲料及食品添加剂开发

图15是番茄植酸酶基因分泌性酵母表达载体构建过程。运用转基因技术在番茄植酸酶基因上游添加酵母α-因子前导序列，构建分泌性表达载体，导入面包酵母菌，筛选出能大量分泌植酸酶的酵母工程菌，开发高效植酸酶分泌型酵母饲料和食品添加剂。可按下列步骤实施合成：

①合成45个碱基对的酵母α-因子前导序列。

②将酵母α-因子分泌前导序列DNA片段与植酸酶基因Phy t1连接与扩增。

③表达载体构建：将含酵母α-因子分泌前导序列和植酸酶基因Phy t1的全基因片段克隆到酵母表达载体pYX212，构建重组表达载体pXPh1。如图15所示。

④酵母细胞转化：将重组质粒表达载体pXPh1引入酵母细胞，得到携带酵母α-因子分泌前导序列和植酸酶Phy t1的全基因克隆。

⑤植酸酶表达与分泌活性鉴定：对携带植酸酶基因的酵母工程菌进行培养，测定不同时间培养液(分泌到细胞外的)和细胞内植酸酶活性(用植酸钙为底物，测定无机磷释放量)，鉴定植酸酶表达与分泌效果。

⑥试制酵母工程菌干粉食品和饲料添加剂样品，进行动物实验，对营养促进效果和食用安全性进行研究。

Claims (2)

1.一种番茄植酸酶基因，其特征在于该基因含1356碱基对，蛋白质编码区包括完整的阅读框，编码为452个氨基酸蛋白质，该基因的碱基顺序及编码蛋白如下：1 ATGGACGTCTCTGCTGTAGCAGCAAAGGTGTGGGGTCAAACTACTAAATCCGGACTGGCAGTCCCCGCCGAGAGCAAGGCC1 M  D  V  S  A  V  A  A  K  V  W  G  Q  T  T  K  S  G  L  A  V  P  A  E  S  K  A82 CCGGCAAGCCAAGAAGACGGCGTCGATCAGGGGGGGATGACTGATCTGTGGGGTCAATACGACAAGGCAAACGAACAGGCG28 P  A  S  Q  E  D  G  V  D  Q  G  G  M  T  D  L  W  G  Q  Y  D  K  A  N  E  Q  A163 CTAGCGATGCATGGAGCGCGGAACGAGGAGCTCATGATGTACTCCGCTCTCAAGTCGGAGACGCAGAACGCGACCTACCTC55 L  A  M  H  G  A  R  N  E  E  L  M  M  Y  S  A  L  K  S  E  T  Q  N  A  T  Y  L244 TATGCCTTCAGCGACTGCTACACGTACAGCTTGGGTCTTGACGACTCCCAGAACGTCCGCATCACGTACGAGCGTTCGGAC82 Y  A  F  S  D  C  Y  T  Y  S  L  G  L  D  D  S  Q  N  V  R  I  T  Y  E  R  S  D325 GGCGAATCGCTAACACTCGTCGCCAAGTTCTACCAGGACTACGTCGTCTACGGCCTCAACGCGTGCTTGCAGAACGTCCGC109 G  E  S  L  T  L  V  A  K  F  Y  Q  D  Y  V  V  Y  G  L  N  A  C  L  Q  N  V  R406 AACTGCTGCATCGCCTCCGGCGCCATCGACAAGATCGAGGGCTTCTACGACGCCCTCAAGGATCCTCGTGCCGAATCCGCC136 N  C  C  I  A  S  G  A  I  D  K  I  E  G  F  Y  D  A  L  K  D  P  R  A  E  S  A487 GCCAACCTCGACCCAGGCGCCGCGGAGGCGTCCGATACCGTCGAAGCCATGTGGCAGACGTTCGTCCCCCAGCGGAGCCTC163 A  N  L  D  P  G  A  A  E  A  S  D  T  V  E  A  M  W  Q  T  F  V  P  Q  R  S  L568 TCCCTCCAGAACGACTCCCGCGCCCTCACAGACACACTCAAGCTGGAGAAGATCGACTTCGCCGAGCTTGTGCGGAGGCAC190 S  L  E  N  D  S  R  A  L  T  D  T  L  K  L  E  K   I  D  F  A  E  L  V  R  R  H649 CAGCTCCGGCTCGGGTACGGCAGCAAGGGCGAGGAGTTCGAGGACCTGGACGACACCCAGAAGCTGGAGGTGTACAACGAT217  Q  L  R  L  G  Y  G  S  K  G  E  E  F  E  D  L  D  D  T  Q K  L  E  V  Y  N  D730 ATCTGCTCCTTCGACGGGCGGGCGGGGCTAACCAAGCTGTCCTTCTCATCGGGCACCCATGACGAAGGCCCTCCAATTGCA244 I  C  S  F  D  G  R  A  G  L  T  K  L  S  F  S  S  G  T  H  D  E  G  P  P  I  A811 GCCACGACGTGGGCGCAGGCGGTGAGCGTCTTCATCATGGGCCCGACCCAGCTGGCGTGGCGTCTGACCCACACGGGCCAC271 A  T  T  W  A  Q  A  V  S  V  F  I  M  G  P  T  Q  L  A  W  R  L  T  H  T  G  H892 GAGGTGGAGGCCATCCTCAGCCCGGCTACCAACCTCCTGGCGGGGTCCATTCTCTTTGCCGTGGAGGCCGTCAAGGGCGCG298 E  V  E  A  I  L  S  P  A  T  N  L  L  A  G  S  I  L  F  A  V  E  A  V  K  G  A973 GCGACCGTGGAGGCGGTCGCAAACATGCAGTGTCTCGTCTTTGCTTGCTTGGTTAATGATTTCATTGTGGGCGCCATCCAG325 T  T  V  E  A  V  A  N  M  Q  C  L  V  F  A  C  L  V  N  D  F  I  V  G  A  I  Q1054 GGGCTGATCTTCGTCGGCGTCAGCGGCCTCCTCATTAACCTCATCATCGGCTCCCCTAGGAAGGTGCCTGACATGAGCAAG352 G  L  I  F  V  G  V  S  G  L  L  I  N  L  I  I  G  S  P  R  K  V  P  D  M  S  K1135 CTCATGGGGTGTTGGGTTGTCATGACCGTCGATAGCGCCCTTCATGACAACGGCTCTGCCTTGGGGTCCTGTACCTTCGAT379 L  M  G  C  W  V  V  M  T  V  D  S  A  L  H  D  N  G  S  A  L  G  S  C  T  F  D1216 ACTATCGACACGAGCCCGTTTACCAACCCGCTCCAGTCTACTCACTACGCGGGTTGGTCGGATTGGCTGGAGACCTTTGCT406 T  I  D  T  S  P  F  T  N  P  L  Q  S  T  H  Y  A  V  W  S  D  W  L  E  T  F  A1297 ACTTGGATCTCGACCCCGGACACCCATCCGCTCAACGTCACTCTCCCGGCGGACGCGGAG                 1356433 T  L  I  S  T  P  D  T  H  P  L  N  V  T  L  P  A  D  A  E                   452

2.根据权利要求1所述的番茄植酸酶基因，用于研制土壤有机磷高效利用型作物新品种转基因大豆、食品添加剂和保健食品、植酸酶分泌型酵母饲料添加剂。

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