CN111850073A - 珍珠贝美白因子、其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种珍珠贝美白因子的制备方法，其包括如下步骤：步骤1)将蚌壳粉碎后，过筛，获得小颗粒蚌壳粉；步骤2)将蚌壳粉与弱酸水溶液混合后，搅拌分解，分离出固体为粗蛋白；步骤3)将粗蛋白用去离子水清洗干净，再与pH值6.0‑7.5缓冲溶液混合，将混合液通过超高压100‑200Mpa、40～80℃处理20～40min后，再在超声条件下、在40‑60℃下与蛋白酶混合反应2‑7h；步骤4)在85‑100℃下搅拌20‑50min灭酶后，通过过滤膜压滤获取无菌过滤液；步骤5)冻干保护剂与过滤液混合，在预冻后放入真空冷冻干燥仓中进行冻干12‑20h；最终收获水分含量在2‑5％的冻干粉。本发明还公开了所述方法得到的种珍珠贝美白因子在制备内皮素拮抗剂中的用途。本发明工艺简单，得到的产品美白效果明显。
Description
技术领域
本申请涉及一种珍珠贝美白因子及其制备方法、以及该珍珠贝美白因子的用途，尤其涉及一种珍珠贝美白因子的冻干粉及其制备方式、以及该珍珠贝美白因子对内皮素的拮抗作用。
背景技术
美白是亚洲人最为关心的护肤需求，针对肌肤美白功效机理的研究，其中抑制内皮素刺激细胞分泌黑色素和抑制酪氨酸酶活性是美白作用中两个关键环节。因此国内外很多研究单位开展内皮素拮抗剂的寻找工作，例如专利(申请号：200610030123.5，发明名称：具内皮素拮抗作用的天然蛋白的酶介混合肽)列举了很多相关蛋白多肽的制备。但该专利忽略了很多低值硬蛋白产物，尤其是目前产量很大的三角帆蚌的蚌壳。该蚌壳与珍珠存在明显区别，为此已有国家标准为鉴别珍珠粉和蚌壳粉提供近红外鉴别的方法，另外在中药中两个功效就存在很多的区别。蚌壳的研究，国内外主要鲜有报道，即有报道也主要集中三角帆蚌净化水质的研究。自去年发现烧制后的蚌壳粉具备超强吸附重金属的作用后，我们对蚌壳的研究也日益开始重视，因此开始探索三角帆蚌中的成分，试探其是否具备美白作用，以及作用机理如何。
这项工作目的在于提升蚌壳的附加值，开拓其在护肤品保健品中的应用领域。在已有珍珠复合美白因子专利申请的基础上，我们对其制备方法再提出创新，在基于机械化学的基础上，保留部分蚌壳中的钙质，并且将蚌壳中的蛋白进行选择性的酶切，在计划的酶解度后进行冻干干燥，获取得到具备内皮素拮抗作用的美白冻干粉。该技术克服了珍珠蛋白水解液不稳定、活性成分分子量要求严格以及优化钙离子与活性多肽的比例的探索工作。而这些都是现有技术中未考虑也未克服的问题。而且该美白效果明显，符合期望，并且低廉的蚌壳粉能得到显著的附加值，广泛应用于美白护肤品和补钙的保健食品中。
发明内容
本申请所要解决的问题是如何通过低廉大量副产物就能生产出具备内皮素抑制的产品。具体有：第一，预处理：如何处理蚌壳中的钙质，如何处理蚌壳粉的粉末粒径；第二、如何提高蚌壳半成品酶解的速率；第三、如何确定酶的种类和酶解度。第四、如何模拟皮肤黑色素生成的模型以及美白机理的研究。
基于以上这些问题，本发明的发明点在于：1.保留蚌壳中的部分钙质，有利于提高皮肤钙离子通道，有利于蚌壳多肽越过皮肤屏障，作用于黑色素细胞膜。2.本发明的发明人研究中发现，并不用进行酶解到2000Da以下的多肽才具备内皮素抑制作用，这将大大提高了利用率，而且利用三角帆蚌蚌壳这种低廉大量副产物就能生产出具备内皮素抑制的产品，这也是废弃物再利用的发现。3.基于机械化学法促进蚌壳蛋白空间结构的打开，促进蛋白酶的酶解；4、建立起3D内皮素黑色素细胞模型，科学模拟确定蚌壳多肽组分有利于内皮素的拮抗以及抑制黑色素的转移。
本提供了一种珍珠贝美白因子的制备方法，该方法包括如下步骤：
步骤1)将蚌壳粉碎后，过筛，获得小颗粒蚌壳粉；
步骤2)将蚌壳粉与质量分数为10-20％的弱酸水溶液按1:5-20的质量比混合后，在30-70℃下100-200rpm速度下搅拌，充分分解1-4小时，分离出固体为粗蛋白；
步骤3)将粗蛋白用去离子水清洗干净到清洗液中TDS值在100-500ppm时，再与pH值6.0-7.5缓冲溶液混合，粗蛋白与缓冲溶液的质量比为1:5-15，将混合液通过超高压100-200Mpa、40～80℃处理20～40min后，再在超声条件下、在40-60℃下与蛋白酶混合反应2-7h；
步骤4)在85-100℃下搅拌20-50min灭酶后，通过过滤膜压滤获取无菌过滤液；
步骤5)冻干保护剂与过滤液按照质量体积比0.5～4：100g/mL的比例混合，在液氮或者-70～-85℃条件下进行预冻，随后放入真空冷冻干燥仓中进行冻干12-20h；最终收获水分含量在2-5％的冻干粉。
作为优选，在步骤1)中所述蚌壳在粉碎前进行预处理，即将蚌壳清洗干净，去除表皮污物和藻类，晒干；步骤1)所述过筛优选为过200目筛。
作为优选，步骤2)所述弱酸选自醋酸、乳酸、柠檬酸、碳酸、苹果酸等中的一种或者多种；进一步优选为醋酸、乳酸或柠檬酸中的一种或者多种。
作为优选，步骤3)所述的pH值6.0-7.5缓冲溶液为PBS，Tris-HCl或柠檬酸缓冲液。
作为优选，步骤3)所述的蛋白酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胃蛋白酶等中的一种或多种；进一步优选为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶及胰蛋白酶中的一种或多种。
作为优选，步骤3)所述蛋白酶与混合液的质量体积比为1:100-1:10g/mL。
作为优选，步骤4)所述过滤膜为0.22μm的过滤膜。
作为优选，步骤5)所述的冻干保护剂为蔗糖、葡萄糖、谷氨酸、白蛋白、壳聚糖等中的一种或多种；进一步优选为蔗糖、葡萄糖或谷氨酸。
作为优选，本发明所述制备方法得到的冻干粉可以罐装于棕色的西林瓶中，在1-10℃内进行储存。
本发明还提供了一种珍珠贝美白因子，其由前述方法制备得到。
本发明还提供了所述珍珠贝美白因子在制备内皮素拮抗剂中的用途；所述内皮素拮抗剂可以为保健品或药品等。
本发明所述方法获得的珍珠贝美白因子有别于全成分酶解，以及定量选择蛋白酶解液的分子量段的提取方法，以上两种方法是目前较为普遍的珍珠贝美白因子提取的方式，本发明的优势在于：
1、制备时效短，较以往提取时间一般在3-7天，本发明提取时间可以控制在2-4天，时效上缩短一半。
2、工艺简便，接近于无损提取。本发明脱钙采用弱酸提取，保留酸不溶有机物，随后进行酶解提取。不需要筛选蛋白进行分离，如果涉及提取全部的蚌壳蛋白，涉及方法会很多，并且要去除蚌壳中的其他有机物，例如多糖、脂质等。
3、相近的现有技术中，需要将提取物进行分子量段筛选，获取20kda以内的蛋白多肽，会造成20kda以上蛋白的浪费，本发明利用工艺改进，提高酶解度，无需进行分子量段筛选。
4、美白效果更为明显，本发明获得的冻干粉，较市面上卖的珍珠内皮素拮抗剂，其美白效果以及有效浓度更为明显。
附图说明
图1为不同样品的电泳结果照片，可显示其组成的分子量分布；其中：1和6为大分子标准物；5为小分子蛋白标准物，由上往下依次为12kd，7kd；2为珍珠内皮素拮抗剂，3为本发明的珍珠贝美白因子，4为珍珠内皮素拮抗剂。
图2为不同样品作用于黑色素模型后在气液培养第七天的表观结果；
图3为在模型取样后对模型进行组织形态学银染照片。
具体实施方式
实施例1
一种珍珠贝美白因子的制备方法，该方法包括如下步骤：
步骤1)将蚌壳清洗干净，去除表皮污物和藻类，晒干粉碎后，过200目筛，获得小颗粒蚌壳粉；
步骤2)将蚌壳粉与质量分数为15％醋酸溶液按照1:20的质量比混合在60℃下200rpm速度下搅拌充分分解3h，分离固体得到粗蛋白；
步骤3)将粗蛋白用去离子水清洗干净后(清洗液中TDS值为150ppm)，与pH值7.5缓冲溶液PBS按质量比1:5混合，将混合液通过超高压100Mpa、40℃处理30min后，再在超声下60℃下与胰蛋白酶混合反应3h，胰蛋白酶与混合液的质量体积比为1:100g/mL；
步骤4)85℃搅拌30min灭酶后，通过0.22μm过滤膜压滤获取无菌过滤液，向过滤液中分别加入蔗糖和白蛋白进行混合；蔗糖与过滤液的质量体积比为2:100g/mL，白蛋白与过滤液的质量体积比为2:100g/mL；
步骤5)将混合液在-85℃下预冻，然后进行冻干获取冻干粉，即为珍珠贝美白因子冻干粉，具有内皮素拮抗作用。
实施例2
一种珍珠贝美白因子的制备方法，该方法包括如下步骤：
步骤1)将蚌壳清洗干净，去除表皮污物和藻类，晒干粉碎后，过200目筛，获得小颗粒蚌壳粉；
步骤2)将蚌壳粉与质量分数为10％乳酸溶液按照1:20的质量比混合在60℃下200rpm速度下搅拌充分分解4h，分离固体得到粗蛋白；
步骤3)将粗蛋白用去离子水清洗干净后(清洗液中TDS值为100ppm)，与pH值7.5缓冲溶液Tris-HCl按质量比1:10混合，将混合液通过超高压100Mpa、40℃处理30min后，再在超声下60℃下与中性蛋白酶混合反应3h，中性蛋白酶与混合液的质量体积比为1:100g/mL；
步骤4)85℃搅拌35min灭酶后获取上清液，通过0.22μm过滤膜压滤获取无菌过滤液，向过滤液中分别加入蔗糖和谷氨酸进行混合；蔗糖与过滤液的质量体积比为2:100g/mL，谷氨酸与过滤液的质量体积比为2:100g/mL；
步骤5)将混合液在-85℃下预冻，然后进行冻干获取冻干粉，即为珍珠贝美白因子冻干粉，具有内皮素拮抗作用。
实施例3
一种珍珠贝美白因子的制备方法，该方法包括如下步骤：
步骤1)将蚌壳清洗干净，去除表皮污物和藻类，晒干粉碎后，过200目筛，获得小颗粒蚌壳粉；
步骤2)将蚌壳粉与质量分数为20％柠檬酸溶液按照1:5的质量比混合在50℃下100rpm速度下搅拌充分分解3小时，分离固体得到粗蛋白；
步骤3)将粗蛋白用去离子水清洗干净到清洗液中TDS值在120ppm时，再与pH值7.0柠檬酸缓冲溶液按质量比1:15混合，将混合液通过超高压200Mpa、45℃处理40min后，再在超声下40℃下与木瓜蛋白酶混合反应7h，木瓜蛋白酶与混合液的质量体积比为1:100g/mL。
步骤4)100℃搅拌20min灭酶后获取上清液，通过0.22μm过滤膜压滤获取无菌过滤液，向过滤液中分别加入壳聚糖和谷氨酸进行混合；壳聚糖与过滤液的质量体积比为2:100g/mL，谷氨酸与过滤液的质量体积比为2:100g/mL；
步骤5)将混合液在液氮条件下预冻，然后进行冻干获取冻干粉，即为珍珠贝美白因子冻干粉，具有内皮素拮抗作用。
实施例4
一种珍珠贝美白因子的制备方法，该方法包括如下步骤：
步骤1)将蚌壳清洗干净，去除表皮污物和藻类，晒干粉碎后，过200目筛，获得小颗粒蚌壳粉；
步骤2)将蚌壳粉与质量分数为15％乳酸溶液按照1:5质量比混合在70℃下100rpm速度下搅拌充分分解2小时，分离固体得到粗蛋白；
步骤3)将粗蛋白用去离子水清洗干净到清洗液中TDS值在500ppm时，再与pH值7.5Tris-HCl缓冲溶液按质量比1:5混合，将混合液通过超高压200Mpa、800℃处理20min后，再在超声下55℃下与木瓜蛋白酶混合反应5h，木瓜蛋白酶与混合液的质量体积比为1:100g/mL。
步骤4)90℃搅拌20min灭酶后获取上清液，通过0.22μm过滤膜压滤获取无菌过滤液，向过滤液中分别加入壳聚糖和白蛋白进行混合；壳聚糖与过滤液的质量体积比为2:100g/mL，白蛋白与过滤液的质量体积比为2:100g/mL；
步骤5)将混合液在液氮条件下预冻，然后进行冻干获取冻干粉，即为珍珠贝美白因子冻干粉，具有内皮素拮抗作用。
测试例1—成分匹配
珍珠贝美白因子成分质量验证，确保具备内皮素拮抗剂相应成分。进行电泳分子量检测，用以验证本发明发明的提取物与已有的珍珠内皮素拮抗剂一致。
如图1，试验证明，本发明能够利用低成本贝壳为生物质原料，制备出与珍珠中内皮素拮抗剂分子量分布相一致的产品。
测试例2—功效性强
为充分证明本发明制备的珍珠贝美白因子是否具备内皮素拮抗作用，鉴于内皮素是通过角质形成细胞的分泌刺激黑素细胞分泌黑色素，本发明首次选用黑色素细胞的3维模型，利用内皮素(ET-1)诱导黑色素模型形成黑色素沉积，从而更好模仿皮肤应激过程中的色素沉积。以3D黑色素皮肤模型(购于广州博溪生物科技有限公司)为测试工具，采用表面给药的方式，将样品模拟人体使用过程，均匀涂布于3D黑色素皮肤模型体外模拟表面，通过外观颜色变化、黑色素含量、黑色素分布等指标，评估样品对内皮素引起的黑色素合成的抑制作用及美白功效。
1.实验方案
表1基于ET-1刺激的黑色素模型的活性物美白体外评估方案
参照表1中的实验分组及相应处理条件，自3D细胞模型建立后，每天进行5nM的ET-1液下刺激处理，连续刺激3天后建立阴性对照组，随后将珍珠贝美白因子和内皮素拮抗剂涂布于阴性对照组模型表面，给药体积10μL/每次，每2天给药一次，连续刺激4天结束操作，备用。
1.1分组及给药
取3D黑色素皮肤模型分成8组，分别为空白组(Control)、阴性对照组(ET-1)，SPE-0.01％组、SPE-0.1％组、SPE-1％组、OSPE-0.01％组、OSPE-0.1％组、OSPE-1％组。测试空白组的表观、L*值和黑色素含量。
除了空白组外，使用内皮素(ET-1)5nM对各组3D黑色素皮肤模型进行液下刺激处理，内皮素给药体积10μL/每次，连续刺激3天，测试空白组和阴性对照组的表观、L*值和黑色素含量。
然后除了空白组和阴性对照组外，使用本发明的珍珠贝美白因子(SPE)或市购的内皮素拮抗剂(OSPE)开始均匀涂抹给药，给药体积为10μL/每次，每2天给药一次；每次使用内皮素拮抗剂给药后，使用内皮素(ET-1)5nM进行一次给药刺激，给药体积为10μL/每次，给药4天(即给药2次)后结束操作，测试各组的表观、L*值和黑色素含量。
其中，所述内皮素拮抗剂的给药方式为：
SPE-0.01％组，将实施例1制备得到的珍珠贝美白因子冻干粉用稀释溶剂配制成质量分数为0.01％的溶液进行给药；
SPE-0.1％组，将实施例1制备得到的珍珠贝美白因子冻干粉用稀释溶剂配制成质量分数为0.1％的溶液进行给药；
SPE-1％组，将实施例1制备得到的珍珠贝美白因子冻干粉用稀释溶剂配制成质量分数为1％的溶液进行给药；
OSPE-0.01％组，将对照珍珠内皮素拮抗剂用稀释溶剂配制成质量分数为0.01％的溶液进行给药；
OSPE-0.1％组，将对照珍珠内皮素拮抗剂用稀释溶剂配制成质量分数为0.1％的溶液进行给药；
OSPE-1％组，将市购的内皮素拮抗剂用稀释溶剂配制成质量分数为1％的溶液进行给药；
所述稀释溶剂为丙二醇：乙醇体积比为7:3的混合溶剂。
1.2模型表观拍照观察
对不同实验组的模型进行表观拍照观察。若组织表面存在少量水分或样品，用无菌棉签小心吸干组织表面。拍照在光线强度固定的摄影棚内进行。具体拍照操作标准如下：(1)相机模式：手动；拍照参数设置：焦距＝5.8mm，孔径＝f/8，光圈F22，快门速度-1/80s，ISO＝1600.(2)将黑色素模型放于比色卡的中心位置进行拍照。结果见图2。
1.3L*值检测
对不同实验组的模型进行L*值检测。具体检测标准操作如下：(1)用手术刀片将模型沿小室边缘环切取下；(2)将模型至于一个平整坚硬的白色平面上，按照色差仪使用说明，将色差仪检测孔垂直对准模型表面进行检测，每个模型重复读数三次，并记录数据。结果见表2。
表2不同样品细胞模型L*值的测定
1.4模型黑色素分布检测
对不同实验组的模型进行黑色素分布检测，黑色素分布检测使用的模型为L*值检测后相应分组的模型。检测方法如下：待测模型采用4％多聚甲醛固定模型，组织包埋，切片后进行Fontana-Masson染色，回收切片结果，使用显微镜拍照，进行两次平行试验。结果见图3。
1.5模型黑色素含量检测
参照4.2.1的给药方式进行处理后，对不同实验组的模型进行黑色素含量检测，黑色素含量检测使用的模型为L*值检测后相应分组的模型。检测方法如下：待测模型采用0.6mL0.25％胰酶，37℃静置处理2h；结束后，用弯头吸管反复吹打组织约1min；吹打结束后，用弯头镊子将脱离的PC膜取出；终止：添加0.6mL含10％血清的PBS，2000r/min，离心10min，弃上清；沉淀部分加入1NNaOH(含10％DMSO)，吹打数次，于80℃水浴反应30min，使黑色素颗粒完全溶解，然后1200r/min离心5min，取上清液加入96孔板，每孔200μL，于酶标仪A405nm处检测OD值。结果见表3。
表3珍珠贝美白因子对黑色素含量的影响
本发明中的统计方法：
应用GraphPadPrism作图，结果表示为Mean±SD。各组间多重比较采用one-wayANOVA单因素方差统计分析。所有的统计分析均为双尾。p<0.05被认为具有差异显著性，其中*p<0.05，0.005<**p<0.01，***p<0.001，p值越小越显著。
以上的实验结果可见，本发明发明的珍珠贝美白因子在万分之一的浓度添加量中就具备非常显著抑制黑色素的能力。相比较市面上采购的十几万一公斤的珍珠中提取的内皮素拮抗剂，具备更加明显的抑制黑色素的能力。不管在成本，副产物的开发，还是在美白效果上，本发明发明的珍珠贝美白因子都具备十分明显的提升作用。
测试例3—质量更为稳定
进行蚌壳为原料制备的提取物和珍珠中内皮素拮抗剂的稳定性试验，发现本发明发明的珍珠贝美白因子具备更强的稳定性。
表4两种内皮素拮抗剂稳定性中理化指标比对
Claims (9)
1.一种珍珠贝美白因子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1)将蚌壳粉碎后，过筛，获得小颗粒蚌壳粉；
步骤2)将蚌壳粉与质量分数为10-20％的弱酸水溶液按1:5-20的质量比混合后，在30-70℃下100-200rpm速度下搅拌，充分分解1-4小时，分离出固体为粗蛋白；
步骤3)将粗蛋白用去离子水清洗干净到清洗液中TDS值在100-500ppm时，再与pH值6.0-7.5缓冲溶液混合，粗蛋白与缓冲溶液的质量比为1:5-15，将混合液通过超高压100-200Mpa、40～80℃处理20～40min后，再在超声条件下、在40-60℃下与蛋白酶混合反应2-7h；
步骤4)在85-100℃下搅拌20-50min灭酶后，通过过滤膜压滤获取无菌过滤液；
步骤5)冻干保护剂与过滤液按照质量体积比0.5～4：100g/mL的比例混合，在液氮或者-70～-85℃条件下进行预冻，随后放入真空冷冻干燥仓中进行冻干12-20h；最终收获水分含量在2-5％的冻干粉。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2)所述弱酸选自醋酸、乳酸、柠檬酸、碳酸、苹果酸中的一种或者多种。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3)所述的pH值6.0-7.5缓冲溶液为PBS，Tris-HCl或柠檬酸缓冲液。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3)所述的蛋白酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胃蛋白酶中的一种或多种。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3)所述蛋白酶与混合液的质量体积比为1:100-1:10g/mL。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤4)所述过滤膜为0.22μm的过滤膜。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤5)所述的冻干保护剂为蔗糖、葡萄糖、谷氨酸、白蛋白、壳聚糖中的一种或多种。
8.一种珍珠贝美白因子，其由权利要求1-7中任一项所述方法制备得到。
9.权利要求8所述珍珠贝美白因子在制备内皮素拮抗剂中的用途。
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