CN104558137A - 一种珍珠蛋白的制备方法及该方法制备得到的水溶性珍珠蛋白和酸溶性珍珠蛋白 - Google Patents

一种珍珠蛋白的制备方法及该方法制备得到的水溶性珍珠蛋白和酸溶性珍珠蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种珍珠蛋白的制备方法及该方法制备得到的水溶性珍珠蛋白和酸溶性珍珠蛋白。一种珍珠蛋白的制备方法，步骤如下：1）将珍珠研磨成珍珠粉；2）用去离子水浴纳米珍珠粉超高压均质，低温离心获取水溶性珍珠提取物a和沉淀，并将沉淀用乙醇溶液清洗上边；3）以上获得的沉淀用弱酸在一定温度下溶解，低速搅拌反应；低温离心取上清液，为酸溶性珍珠提取物b；4）将水溶性珍珠提取物a和酸溶性珍珠提取物b分别进行脱盐；5）脱盐之后将水溶性珍珠提取物a和酸溶性珍珠提取物b冻干，分别获得水溶性珍珠蛋白和酸溶性珍珠蛋白。本发明利用纳米级珍珠粉，为珍珠护肤品和保健品提供原料。

Description

一种珍珠蛋白的制备方法及该方法制备得到的水溶性珍珠蛋白和酸溶性珍珠蛋白
技术领域
本发明涉及珍珠提取物生产领域，尤其涉及一种珍珠蛋白的制备方法及该方法制备得到的水溶性珍珠蛋白和酸溶性珍珠蛋白。
背景技术
目前，珍珠粉的应用过程中，曾相继遇到颗粒大小安全隐患、流动性差、不溶水以及功效成分难以释放等诸多问题，这些直接影响珍珠粉的应用领域。为能解决以上问题，业内已经向水溶性珍珠粉以及珍珠水解液发展，然而，在此过程中，我们只是简单的进行原有成分的复配或者粗放型的水解，未能研究其中各个成分的功效，很少进行精细分离纯化。
目前的珍珠提取物一般均是采用酶解的方式进行生产，如中国发明专利（申请号：01139157.X 申请日：2001-12-19）公开了一种珍珠粉的生物酶解制备方法,其关键是以乳酸水溶液为溶剂,将珍珠溶解,并调整溶液的pH值至近中性再用酸回调至偏酸性,再放入适量生物活性酶催化分解其蛋白质,得到酶解珍珠胶液,再采用喷雾干燥将酶解珍珠胶液快速干燥,固化造粒,制得超细酶解珍珠粉。所制备的珍珠粉保留了珍珠中的多种氨基酸、微量元素等有效成份,并使珍珠中的碳酸钙转化为人体易吸收的活性钙,胃酸不溶解的角质蛋白酶解成易吸收的游离氨基酸。
中国发明专利（申请号：200710141569.X 申请日：2007-08-07）公开了一种制备珍珠活性肽的方法,它从新活的珍珠贝里取出珍珠粒,水洗干净,将珍珠粒与去离子水混合后,用磷酸盐缓冲溶液将混合液的PH值调至中性偏酸,然后用沙雷肽酶与珍珠粒进行酶水解反应；用滤网过滤分离得珍珠粒和澄清液,然后将反应液水煮灭酶；再将所得的溶液经喷雾干燥即得珍珠活性肽。
中国发明专利（申请号：200910114409.5 申请日：2009-09-18）公开了珍珠水解液的制备方法，其步骤如下：1)取珍珠粉置于盐酸水溶液中，搅拌，直至反应完全，用氨水调节该混合液的pH值至中性，离心，得沉淀A；2)沉淀A用纯净水溶解，再以氨水调节其pH值为7.5～8.5，离心，得沉淀B；3)沉淀B用纯净水溶解，加入酶进行酶解，酶解液离心，得上清液和沉淀C；所述的酶为蜗牛蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合物，加入量为沉淀B重量的0.3～1.05％；4)将沉淀C用纯净水溶解加酶进行二次酶解，离心，收集上清液；酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物，加入量为沉淀B重量的0.2～0.45％；5)合并两次上清液，煮沸，用孔径为1～3nm的纳滤膜过滤，即得。
上述的方法采用了酶解的方法可以获得低分子量的氨基酸和多肽，但同时酶解也会破坏一些有活性的蛋白物质，造成活性物质的流失。
中国发明专利申请（申请号 201410055730.1，申请日 2014.02.19）公开了一种纳米珍珠蛋白的制备方法，是将珍珠粉碎制成平均粒径为1～4微米的珍珠微粉，酸解，过滤，滤渣用净化水洗涤干净即为粗珍珠蛋白，在粗珍珠蛋白中加入分散剂进行研磨，期间超声震荡；研磨后的液体用膜后浓缩，然后加热杀菌保存得到纳米珍珠蛋白。该方法加入分散剂物质，在后续的处理工艺中很难去除，限制了产品的应用。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种珍珠蛋白的制备方法，本该方法利用纳米级珍珠粉，进行水解和酸解然后进行脱盐，分别获得水溶性珍珠蛋白和酸溶性珍珠蛋白，为珍珠护肤品和保健品提供原料。
为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种珍珠蛋白的制备方法，该方法包括以下的步骤：
1）将珍珠研磨成纳米级珍珠粉；
2）用去离子水浴纳米珍珠粉超高压均质，40～80℃下均质0.2～1h，低温0~8℃离心获取水溶性珍珠提取物a和沉淀，并将沉淀用乙醇溶液清洗上边，随后进行下一步操作；
3）以上获得的沉淀用弱酸在30～50℃温度下溶解，低速搅拌80-120rpm下反应0.5～3h；低温0~8℃离心取上清液，为酸溶性珍珠提取物b；
4）将水溶性珍珠提取物a和酸溶性珍珠提取物b分别进行脱盐；
5）脱盐之后将水溶性珍珠提取物a和酸溶性珍珠提取物b冻干，分别获得水溶性珍珠蛋白和酸溶性珍珠蛋白。
作为优选，所述的纳米级珍珠粉的粒度为10~100nm。
作为优选，所述的弱酸采用食用醋酸、柠檬酸或碳酸。
作为优选，所述的脱盐采用透析脱盐：2~10℃环境下用3000~5000Da分子量的透析袋透析3~5天除盐，1体积的样品对应10~20体积的蒸馏水，每天换水1~2次。
作为优选，所述的脱盐采用层析脱盐：用葡聚糖凝胶 G-15装柱，首次脱盐加样后即开始收集，每1~2分钟收集一次，收集多份样品，分别加入少量硫酸铵，检测是否有沉淀，验证从第几份样品开始有盐析出，收集这个时间点之前的溶液即为脱盐之后的蛋白溶液。
本发明所述的方法制备的水溶性珍珠蛋白，该水溶性珍珠蛋白的主要分子量分布为小于15kd。本发明的“主要”表示该蛋白中90%以上的物质。
本发明所述的方法制备的酸溶性珍珠蛋白，该酸溶性珍珠蛋白的主要分子量分布为14kd~50kd。本发明的“主要”表示该蛋白中90%以上的物质。
本发明由于采用上述的技术方案，利用纳米级珍珠粉，进行水解和酸解然后进行脱盐，分别获得水溶性珍珠蛋白和酸溶性珍珠蛋白，为珍珠护肤品和保健品提供原料。其中，酸溶性珍珠蛋白抗氧化能力强，并能促进成纤维细胞的生长，同时有利于胶原蛋白的分泌，有利于伤口的愈合，在化妆品修护领域具有强劲的潜力。而珍珠水溶性珍珠蛋白可以在美白、补水等方面获得良好的效果。
附图说明
图1为酸溶性珍珠蛋白的分子量分布图。
图2为水溶性珍珠蛋白的分子量分布图。
图3为不同珍珠蛋白对成纤维细胞生长的影响图。
图4为不同珍珠蛋白对DPPH自由基清除率的影响图。
图5为酸溶性珍珠蛋白对成纤维细胞分泌胶原蛋白的影响图。
具体实施方式
实施例1
一种珍珠蛋白的制备方法，该方法包括以下的步骤：
1）将珍珠研磨成纳米级珍珠粉（10～100nm）；
2）用10倍质量的去离子水浴纳米珍珠粉超高压均质，60℃下均质0.5h。低温4℃离心获取水溶性珍珠提取物a和沉淀。并将沉淀用乙醇溶液清洗3遍，随后进行下一步操作；
3）以上获得的沉淀用弱酸中温真空下（40℃，101325~1333pa）溶解，低速搅拌（100rpm）下反应2h；低温4℃离心取上清液，为酸溶性珍珠提取物b；
4）珍珠提取物a和b可用以下两种方法可以脱盐
①透析脱盐：4～7℃环境下用3500Da分子量的透析袋透析4天除盐，1体积的样品对应10～15体积的蒸馏水，每天换水1次
或②层析脱盐：用葡聚糖凝胶 G-15装柱，首次脱盐加样后即开始收集，每1分钟收集一次，收集15份样品，分别加入少量硫酸铵，检测是否有沉淀。通过这个步骤可以验证从第几份样品开始有盐析出，收集这个时间点之前的溶液即为脱盐之后的蛋白溶液；最终对应获得水溶性珍珠蛋白a和酸溶性珍珠蛋白b；
5）将a、b溶液分别真空冷冻冻干收集，分别获得水溶性珍珠蛋白和酸溶性珍珠蛋白。
实施例2
不同珍珠蛋白分子量检测，试验方法：SDS-PAGE检测法
a)      稀释1倍水溶性珍珠蛋白和酸溶性珍珠蛋白各取20μl，分别加入五倍浓缩样品缓冲液5μl，在80℃水浴锅中煮5min；
b)      按照上面配方制SDS-PAGE凝胶，安装好电泳仪，在槽中加入电极缓冲液；
c)      按一定顺序在加样孔中加入样品，根据SDS-PAGE电泳玻璃板间隙厚度不同，选择加入样品量，一般0.75mm间隙15孔的上样量<10uL/孔,1mm间隙10孔的上样量<20ul/孔。上样量根据实际经验自己掌握；
d)      打开电源将电压调到80v（一般15min左右），待样品跑过压缩胶后将电压调到120v至样品电泳到胶底部为止；
e)      将凝胶小心取下放入容器中，加入染色液，用摇床摇2－3h ；
f)      待条带清晰后倒出染色液，加入脱色液过夜 ；
g)      将脱色液倒掉，可以用Quality One，或者相应的成像系统拍照、分析、估算蛋白浓度。
实验结果
如图1为酸溶性珍珠蛋白，分子量分布在14.4、31和43kd范围内，属于大分子蛋白。图2为水溶性珍珠蛋白分子量测定图，分子量主要集中在14.4，甚至更低分子量范围内，属于小分子量蛋白。
实施例3
1.      不同珍珠蛋白影响成纤维细胞生长的研究
a)      试验方法
细胞生长曲线图试验
不同珍珠蛋白对成纤维细胞增殖的影响通过8天培养过程中细胞数量的检测反映。将酸溶性珍珠蛋白和水溶性珍珠蛋白各自制成系列稀释成15.6μg/ml的培养基，添加1%的小牛血清；将1%小牛血清培养基作为空白对照。每隔一天，通过细胞计数板计数
b)      实验结果
由图3所示，酸溶性珍珠蛋白能够促进细胞生长，相比较只含1%小牛血清的空白对照，具有显著的差别，与此同时，水溶性珍珠蛋白同样具有显著提高成纤维细胞的有效生长数量的作用。但相比酸溶性蛋白，作用时间稍微滞后。总而言之，两者均具备提高成纤维细胞生长速度的作用。
2.      不同珍珠蛋白对清除DDPH自由基能力的研究
a)      试验方法
DPPH自由基抑制能力
实验步骤：配制浓度2×10-4mol/L的DPPH95%乙醇溶液，避光保存。取2mlDPPH溶液，分别加入2ml不同浓度的酸溶性珍珠蛋白或水溶性珍珠蛋白溶液，充分混合，在25℃下反应30min后在517nm（最大吸收波长）测定其吸收值，计算清除率。以为对照
清除DPPH自由基活性的计算公式：P=[（1-（Ai-Aj）/Ac）]×100%
式中：Ai=2mlDPPH溶液+2ml样品溶液的吸光度；
        Aj=2ml样品溶液+2ml溶剂的吸光度；
       Ac=2mlDPPH溶液+2ml溶剂的吸光度
b)      实验结果
由图4所示，酸溶性珍珠蛋白显著高于水溶性珍珠蛋白去除DPPH自由基能力，这也说明，酸溶性珍珠蛋白能够具备较强的抗氧化能力。
3.      不同珍珠蛋白的对细胞生成胶原蛋白的影响
a)      试验方法
羟基脯氨酸实验
成纤维细胞的胶原蛋白产物通过定量羟基脯氨酸含量的方式来评估。成纤维细胞接种于24孔板，在酸溶性珍珠蛋白浓度15.6μg/ml条件下作用72小时。将1%的小牛血清培养基和10%的小牛血清培养基分别作为空白和阳性对照。用氯胺T法检测羟基脯氨酸含量。数据表示为106个细胞中胶原蛋白的微克量，假定胶原蛋白中含13.5%的羟基脯氨酸
b)      实验结果
由图5所示，相比较空白对照和较高含量小牛血清对照，酸溶性珍珠蛋白很明显具备显著提高胶原蛋白的分泌。而相比空白对照，水溶性珍珠蛋白能显著促进胶原蛋白分泌，却低于10%小牛血清的作用，可见酸溶性珍珠蛋白在促进成纤维细胞作用上更有优势。

Claims (7)

1.一种珍珠蛋白的制备方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：
1）将珍珠研磨成纳米级珍珠粉；
2）用去离子水浴纳米珍珠粉超高压均质，40～80℃下均质0.2～1h，低温0~8℃离心获取水溶性珍珠提取物a和沉淀，并将沉淀用乙醇溶液清洗2~4遍；
3）以上获得的沉淀用弱酸在30～50℃温度下真空溶解，低速搅拌80-120rpm下反应0.5～3h；低温0~8℃离心取上清液，为酸溶性珍珠提取物b；
4）将水溶性珍珠提取物a和酸溶性珍珠提取物b分别进行脱盐；
5）脱盐之后将水溶性珍珠提取物a和酸溶性珍珠提取物b冻干，分别获得水溶性珍珠蛋白和酸溶性珍珠蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种珍珠蛋白的制备方法，其特征在于纳米级珍珠粉的粒度为10~100nm。
3.根据权利要求1所述的一种珍珠蛋白的制备方法，其特征在于弱酸采用食用醋酸、柠檬酸或碳酸。
4.根据权利要求1所述的一种珍珠蛋白的制备方法，其特征在于脱盐采用透析脱盐：2~10℃环境下用3000~5000Da分子量的透析袋透析3~5天除盐，1体积的样品对应10~20体积的蒸馏水，每天换水1~2次。
5.根据权利要求1所述的一种珍珠蛋白的制备方法，其特征在于脱盐采用层析脱盐：用葡聚糖凝胶 G-15装柱，首次脱盐加样后即开始收集，每1~2分钟收集一次，收集多份样品，分别加入少量硫酸铵，检测是否有沉淀，验证从第几份样品开始有盐析出，收集这个时间点之前的溶液即为脱盐之后的蛋白溶液。
6.根据权利要求1~5任意一项权利要求所述的方法制备的水溶性珍珠蛋白，该水溶性珍珠蛋白的主要分子量分布为小于15kd。
7.根据权利要求1~5任意一项权利要求所述的方法制备的酸溶性珍珠蛋白，该酸溶性珍珠蛋白的主要分子量分布为14kd~50kd。
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