CN111837808B

CN111837808B - 一种高效回收处理松材线虫病疫木的方法

Info

Publication number: CN111837808B
Application number: CN202010724326.4A
Authority: CN
Inventors: 吴松青; 黄晨燕; 张飞萍; 吴煊; 戴晓艺
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2020-07-24
Filing date: 2020-07-24
Publication date: 2022-06-03
Anticipated expiration: 2040-07-24
Also published as: CN111837808A

Abstract

本发明提供一种高效回收处理松材线虫病疫木的方法，以松材线虫病疫木为原料配置食用菌培养基配方（40%棉籽壳，18%疫木松针，20%疫木木屑，20%麸皮，1%石膏，1%蔗糖），并利用一步酸处理法将种植后的培养基废料用于还原糖制备。解决传统松杉木屑培养食用菌时间长，步骤繁琐等问题。或者直接将松材线虫病疫木用于制备还原糖，降低生产成本，提高资源回收价值。

Description

一种高效回收处理松材线虫病疫木的方法

技术领域

本发明属于森林保护学领域，更具体涉及生物质回收利用领域，具体涉及一种高效回收处理松材线虫病疫木的方法。

背景技术

松材线虫病是一种由松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）引起的疾病，可造成马尾松等松树的大面积枯死。1982年至今，已造成了超过5000万株的马尾松成为疫木。松材线虫病具有极强的传播性和毁灭性，能够造成成千上万的经济损失。根据松材线虫病疫区和疫木管理办法（国家林草局2018年修订），目前控制松材线虫病主要采取的直接有效措施是对病疫木进行伐倒，并就地粉碎（削片）或者烧毁处理，防止周围健康马尾松感染松材线虫病。但是如果没有科学处理伐倒木也会造成资源的浪费及病源的二次传播。因此，如何处理数量庞大的伐倒病疫木，提高其资源回收利用价值及防止其二次扩散成为研究的热点问题。

目前，处理疫木的主要方法有就地焚烧，热处理和微波处理等。这些处理方法虽有一定的成效，挽回了部分损失，但对环境造成了严重的污染，并且消耗了大量的能源。松木屑中丰富的纤维素和半纤维素能够为食用菌菌丝的生长提供营养物质。食用菌具有很高的营养价值和药用价值，市场应用前景广阔。目前只有利用松杉木屑进行食用菌培养，但其需要脱脂、堆积等过程，具有时间长、步骤繁琐、成本较高等问题。因此若将粉碎后的疫木木屑应用于食用菌种植，能够有效防止松材线虫病的传播和极大提高疫木的利用率，并且有利于降低种植金针菇的成本。

虽然进行食用菌种植能够有效提高疫木的利用率，但是食用菌培养后的疫木菌糠仍然富含大量未被利用的木质纤维素。若能建立起疫木菌糠的高效回收利用机制，将有助于克服传统处理方法中的弊端并从中获得新的利润。生物质转化法能够降解材料表面的木质素或半纤维素，实现将材料中的被阻隔的纤维素转化为还原糖，能够增加还原糖的得率。已有利用生物质转化法对高纤维材料进行还原糖获取的相关报道，但大都需要酶水解过程，生产成本较高。因此，若能寻找适合疫木菌糠转化为还原糖的实验条件，将有利于完善处理松材线虫病疫木的有效途径，降低生产成本，实现资源利用的可持续发展。

检索到国内有松杉木屑种植食用菌的配制技术的发明专利申请，未见利用疫木进行食用菌种植及还原糖制备技术的发明专利申请。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效回收处理松材线虫病疫木的方法，以降低食用菌生产成本、完善还原糖制备方法、提高资源回收利用价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种高效回收处理松材线虫病疫木的方法，将松材线虫病疫木经过一步酸处理法用于制备还原糖。一步酸处理法为：2% 稀硫酸121℃处理1h。

或，一种高效回收处理松材线虫病疫木的方法，包括如下步骤：

（1）采用松材线虫病疫木配置食用菌培养基用于种植食用菌；

（2）将种植后的培养基废料经过一步酸处理法处理用于制备还原糖。

所述的培养基为40%棉籽壳，18%疫木松针，20%疫木木屑，20%麸皮，1%石膏，1%蔗糖。

一步酸处理法的具体步骤为：将木屑或菌糠按固液比1:10（g：mL）加入2%稀硫酸溶液混合，121℃处理1h。待反应结束后，将混合液进行冰浴，然后立即加入2% NaOH溶液，中和混合液（pH=7）以停止反应。加蒸馏水将混合液冲洗到离心管中，在8000 r/min，4℃离心5min，收集上清液即获得还原糖提取液。

本发明的优点在于：

本申请提供一种以松材线虫病疫木为原料的食用菌培养基（40%棉籽壳，18%疫木松针，20%疫木木屑，20%麸皮，1%石膏，1%蔗糖）。该配方中的松材线虫病疫木无须经过脱脂及堆积处理，食用菌培养效果好。与直接利用松杉木屑种植食用菌相比，能够大大缩短食用菌种植时间。由于疫木成本和健康木成本相差大概10倍，该配方有利于降低食用菌生产成本。此外，利用疫木和疫木菌糠的材料结构特异性，发明一步酸处理法对疫木和疫木菌糠进行还原糖制备，免去还原糖制备过程中的酶水解过程，降低还原糖的生产成本，提高松材线虫病疫木的回收利用价值。

附图说明

图1不同材料在最佳一步酸处理法下的还原糖产量，图中标注相同字母表示差异不显著（p＞0.05），标注不同字母表示差异显著（p＜0.05）。

具体实施方式

实施例1

实验方法：

1. 金针菇种植

松材线虫病疫木的枝条和健康松木枝条皆采自福州市闽侯县（福建省，中国）。疫木枝条和采集后健康木枝条均直接经过研磨器研磨成粉末后用于直接配置培养基。采用罐头瓶栽，每种处理（处理1-3）都有干料重1.8kg，各装有20瓶，每个罐头瓶干料重约90g。罐头瓶灭菌后，将其冷却至28℃以下，进行接种（金针菇FL19），然后封口。接种30天后，菌丝长满袋。最后将其放在温度为10℃，湿度为80%-90%的环境下培养至采收。采收后立即用电子天平记录金针菇的鲜重，统计分析每种栽培材料单个栽培瓶的平均菇产量，回收菌糠。

处理1培养基配方：58%棉籽壳，20%阔叶树木屑，20%麸皮，1%石膏，1%蔗糖，

处理2培养基配方：40%棉籽壳，18%健康松木松针，20%健康松木木屑，20%麸皮，1%石膏，1%蔗糖，

处理3培养基配方：40%棉籽壳，18%疫木松针，20%疫木木屑，20%麸皮，1%石膏，1%蔗糖。

2.不同的水解处理及成分检测

将健康松木木屑、疫木木屑、健康松木菌糠、疫木菌糠晒干后过40目筛。以反应溶液类型、反应溶液浓度和反应时间作为变量，设置不同处理条件，包括酸水解（H₂SO₄溶液浓度0.5−4%，50−121℃，1h）, 碱水解（NaOH溶液浓度2%，121℃，1h）和水处理（121℃，1h）。样品置于250 mL锥形瓶中，根据不同处理条件按固液比1:10（g：mL）加入水解液混合进行反应。待反应结束后，将混合液进行冰浴，然后立即加入相应浓度的H₂SO₄或NaOH溶液，中和混合液（pH=7）以停止反应。利用蒸馏水将中和样品冲洗至离心管后离心（8000 r/min，4℃离心5min），收集上清液即获得还原糖提取液，并进行化学成分分析及还原糖测定。采用中华人民共和国国家标准GB/T 2677.2-2011，GB/T 742-2008测定了材料的水分、灰分含量。用国家可再生能源实验室（NREL）的方法测定材料的纤维素、半纤维素、酸溶性木质素（ASL）和酸不溶性木质素（AIL）。采用高效液相色谱法（HPLC）测定还原糖的含量。使用高效色谱仪型号为Agilent 1260，色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（4.6×250 mm，5µm），色谱条件：流动相及其混合比例为16%乙腈-84%的0.05mol/L醋酸铵溶液，测试波长为245nm，检测柱温为30℃，流动相的流速为1.5 mL/min。每个样品做三个重复。

实验结果：

1.金针菇产量比较分析

为探究疫木种植金针菇的可行性，利用3种不同处理的培养基配方种植金针菇，进行金针菇的产量对比分析。由表1展示了种植后菌丝的生长情况及培菌时间。相较于处理1和处理3，处理2的培菌天数和成熟天数均最长，并且处理2的菌丝生长较为稀疏。通过对比不同处理条件下的金针菇产量发现（表1），处理1种植的金针菇平均每瓶产量为39.7g，处理2种植的金针菇平均每瓶产量为25.8g，处理3种植的金针菇平均每瓶产量为42.4g。处理2金针菇产量显著比其他两者低，这可能是由于阔叶木中基本不含萜烯类化合物，但健康松木松针和木屑中的萜烯类物质使得菌丝生长受一定的影响。而疫木被松材线虫侵染后，其萜类物质含量减少，菌丝生长不受影响。由此看来，处理3所采用的培养基配方适用于金针菇的栽培，有助于提高疫木的经济价值。

表1不同处理下的培养基配方对金针菇菌丝生长、出菇期及产量的影响

注：同行数据肩注相同字母表示差异不显著（p＞0.05），肩注不同字母表示差异显著（p＜0.05）。

从表1可见：处理3所采用的培养基配方金针菇产量最高，说明疫木适用于金针菇的栽培（p＜0.05）。

2.化学成分分析

为测试疫木菌糠转化为还原糖的潜力，对不同处理条件下的健康木、疫木、健康木菌糠、疫木菌糠进行化学成分测定并与一些常见农业废弃物进行比较分析。从表2中可以看出健康松木的多糖含量的百分比（包括纤维素和半纤维素）54.2%。然而疫木、健康木菌糠和疫木菌糠的多糖含量都比健康松木的少。原因可能是一些纤维素和半纤维素在患松材线虫病和种植金针菇期间被真菌水解。疫木的木质素含量也低于健康松木，原因可能是松木患病期间被真菌侵染使得部分木质素被降解。低的木质素木屑有利于减轻材料表面致密结构的阻碍作用，提高多糖部分的转化率。但是健康木菌糠和疫木菌糠的木质素含量均高于健康松木，这可能是由于在种植金针菇期间，材料多糖部分被消化，间接提高了木质素内容在材料中的占比。4种材料的多糖部分含量均高于玉米秸秆和酒糟等常见农业废弃物的多糖部分，多糖是制备还原糖的主要原料，由此可见4种材料都有很大的潜力去制备还原糖。此外，酸、碱、热水处理都能有效降解纤维素、半纤维素和木质素。

表2 健康松木、疫木及其对应菌糠处理前后的成分和其它农业废料的成分比较

^a反应条件 121℃ ，1 h

^b数据来源Zheng et al. 2015

^c数据来源 Zhao et al. 2017

^dND: No detection

从表2可知：酸、碱和热水处理都能降解纤维素、半纤维素和木质素。疫木和疫木菌糠都有较好的还原糖转化潜力，可以用于还原糖转化。

3.还原糖产量比较

为进一步寻找还原糖转化的最优处理条件，利用HPLC法对各种处理条件下的还原糖产量进行分析。如表3所示，碱处理后的还原糖含量都低于可被检测的范围，分析原因可能是在高温条件下，氢氧化钠会与纤维素水解出的单糖发生化学反应，导致还原糖的产量降低。热水处理后的还原糖产量也十分不理想，只有健康木和疫木被检测到有少量的还原糖产量。可能是由于高温促使材料易接近表面的小部分半纤维素或纤维素发生降解，但是这样的作用是十分轻微的。由此，虽然水处理具有成本低、无腐蚀的优势，但是并不适用于转化木质纤维素。

相比于碱处理和水处理，酸处理后都明显的表现出了更高的还原糖产量。这个结果归功于酸处理能降解大部分的半纤维素内容，与Syaichurrozi等人酸处理槐叶萍（Salvinia molesta）的研究结果相似。四种材料的还原糖产量都随着反应温度和酸浓度的升高而升高。特别是在121℃，4%H₂SO₄反应1h的处理条件下，健康木、疫木、健康木菌糠和疫木菌糠都能获得最高的还原糖产量，分别为111.9g/kg，236.8g/kg，101.3g/kg和137.2g/kg。由该结果可以发现健康木菌糠和疫木菌糠的还原糖产量并没有明显的高于疫木，原因可能是多糖提前被真菌消化（表1），用于金针菇的生长，使得每单位材料的还原糖产量变少。但考虑到反应试剂、仪器和废水处理费用等成本问题，转化疫木最经济有效的处理条件为121℃，2%H₂SO₄处理1h。在此处理条件下，疫木能够获得202.2g/kg的还原糖产量，疫木菌糠能够获得126.3g/kg的还原糖产量。疫木菌糠和传统的农业废弃物一样，在酸水解后获得的还原糖可以作为微生物碳源或者用于生物乙醇发酵，不仅有利于发酵工业的生产利用，也有利于减少农林业废弃物的产生。

表3健康松木、疫木及其对应菌糠处理后的还原糖产量

从表3可知：相比于碱处理和热水处理，酸处理是较好的还原糖制备条件。最佳的一步酸处理条件为2% 稀硫酸121℃处理1h。从图1可知：疫木可以用于直接制备还原糖，还原糖产量最高。疫木种植金针菇后的菌糠用于制备还原糖也可以获得较高的还原糖产量。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种高效回收处理松材线虫病疫木的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（2）将种植后的培养基废料经过一步酸处理法处理用于制备还原糖；

2.根据权利要求1所述的一种高效回收处理松材线虫病疫木的方法，其特征在于：所述的食用菌包括金针菇、香菇、木耳、银耳或猴头菇。

3.根据权利要求1所述的一种高效回收处理松材线虫病疫木的方法，其特征在于：一步酸处理法为：2% 稀硫酸121℃处理1h。