CN111808154A - 二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的纯化方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了二氢欧山芹醇‑β‑D‑葡萄糖苷的纯化方法及其在制备镇痛药物中的应用，所述纯化方法包括将独活提取物经大孔树脂富集后经制备高效液相色谱纯化，本申请的方法成本低，收率高，操作简单，环境友好。发明人进一步对纯化的二氢欧山芹醇‑β‑D‑葡萄糖苷进行生理功能研究，发现二氢欧山芹醇‑β‑D‑葡萄糖苷具有镇痛活性，因此能够用于制备镇痛药物。

Description

二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的纯化方法及应用

技术领域

本发明涉及中药活性物质分离纯化技术领域，特别是涉及独活提取物中二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的纯化方法及应用。

背景技术

独活(Angelicae pubescentis Radix)是重齿毛当归的干燥根，在我国主要分布于四川、湖北两省。作为一种古老的中药，它已被广泛用于治疗关节痛和风湿病。发明人在前期研究中发现独活水提取物中二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷(CBG，结构式如式Ⅰ)含量较高，可能是独活的主要活性成分之一。现有技术中，从中药提取物中纯化活性成分主要采用加热回流萃取结合硅胶柱色谱法，但该方法存在回收率低、耗时长、有机试剂浪费大、污染环境等问题，不适合工业化生产。因此，为了进一步的满足CBG的研究需要，亟需发展一种CBG快速高效的纯化方法，进而对其生物学活性进行研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种独活提取物中二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的纯化方法及应用。

本申请第一方面提供了一种从独活提取物中纯化二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的方法，包括：

(1)使独活提取物的水溶液通过填充了GDX-201大孔树脂的大孔树脂填充柱，流速为3-5BV/h；其中，所述独活提取物与大孔树脂的质量比为(2-4)：1；所述聚二乙烯基苯大孔树脂经体积分数95％以上的乙醇浸泡20-30小时后，用超纯水冲洗至大孔树脂中不含乙醇；

(2)先后以8-12BV超纯水和8-12BV 4-6％乙醇水溶液冲洗大孔树脂填充柱，以去除杂质；

(3)以20-30％乙醇水溶液洗脱获得含有二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的馏分，浓缩，干燥，获得二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷粗品；

(4)将所述二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷粗品溶于甲醇、乙腈或制备高效液相色谱的初始流动相中，配制成浓度为50-150mg/L的溶液；

(5)采用制备高效液相色谱对步骤(4)的溶液进行纯化，色谱条件包括：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流速为8-10mL/min；流动相：A相为水，B相为乙腈；20-100％B相梯度洗脱；进样量0.5-1.5mL；检测波长为325nm。

本申请第二方面提供了本申请第一方面的方法所制备的二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷。

本申请第三方面提供了本申请第一方面的方法所制备的二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷在制备镇痛药物中的用途。

本申请第四方面提供了一种用于镇痛的药物组合物，包含二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷以及任意药学上可接受的载体和/或赋形剂。

本发明实施例提供的独活提取物中二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的纯化方法，利用大孔树脂对独活提取物中的二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷进行富集，进而采用制备高效液相色谱进行纯化，成本低，收率高，操作简单，环境友好。发明人进一步对纯化的二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷进行生理功能研究，发现二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷具有镇痛活性，因此能够用于制备镇痛药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A为独活提取物水溶液的色谱图；

图1B为大孔树脂富集后，含有二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的馏分的色谱图；

图1C为制备高效液相色谱图；

图1D为制备高效液相纯化产物的色谱图；

图2显示了CBG在小鼠热板测试中的镇痛效应结果；

图3显示了CBG最大潜在镇痛效应结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本申请第一方面提供了一种从独活提取物中纯化二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的方法，包括：

(1)使独活提取物的水溶液通过填充了聚二乙烯基苯大孔树脂的大孔树脂填充柱，流速为3-5BV/h；其中，所述独活提取物与大孔树脂的质量比为(2-4)：1；所述聚二乙烯基苯大孔树脂经体积分数95％以上的乙醇浸泡20-30小时后，用超纯水冲洗至大孔树脂中不含乙醇；

(2)先后以8-12BV超纯水和8-12BV 4-6％乙醇水溶液冲洗大孔树脂填充柱，以去除杂质；

(3)以20-30％乙醇水溶液洗脱获得含有二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的馏分，浓缩，干燥，获得二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷粗品；

(4)将所述二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷粗品溶于甲醇、乙腈或制备高效液相色谱的初始流动相中，配制成浓度为50-150mg/L的溶液；

(5)采用制备高效液相色谱对步骤(4)的溶液进行纯化，色谱条件包括：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流速为8-10mL/min；流动相：A相为水，B相为乙腈；20-100％B相梯度洗脱；进样量0.5-1.5mL；检测波长为325nm。

本申请中，富集不同量的独活提取物需要使用不同用量的大孔树脂，制备具有不同柱体积的大孔树脂填充柱，所述柱体积是指大孔树脂装柱后，从柱的底板到大孔树脂沉积表面的体积。本申请中，“BV”表示柱体积。

发明人在研究中发现，当所述独活提取物与大孔树脂的质量比为(2-4)：1时，能够使独活提取物中的二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷得到更有效的富集，获得更高的回收率和富集倍数。

本申请中，如果没有特殊说明，溶液的百分含量均指体积百分比。例如4-6％乙醇水溶液表示体积分数为4-6％的乙醇水溶液。

本申请中所说的体积分数95％以上的乙醇是指体积分数大于95％的乙醇水溶液和无水乙醇。

本申请中所说的大孔树脂中不含乙醇，通常以超纯水冲洗大孔树脂的流出液无白色浑浊，且流出液无乙醇味为判断标准。

大孔树脂具有不同的极性、结构类型、粒径范围、孔径、比表面积等性能参数，发明人在研究中发现，当采用本申请的GDX-201大孔树脂时，其对二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷具有更好的吸附和解析附能力，从而使得采用本申请的方法纯化二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷能够获得更高的回收率和富集倍数。

本领域技术人员可采用现有的方法对含有二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的馏分进行浓缩、干燥，本申请在此不做限定，例如可以采用液减压浓缩，然后进行真空干燥以获得二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷粗品。

本申请中，经大孔树脂分离获得的含有二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的馏分中含有一定量的杂质，发明人在研究中发现，将此馏分浓缩干燥后复溶，有利于去除杂质，从而进一步提高二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的纯度；此外，将二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷粗品复溶，配制成浓度为50-150mg/L的溶液，有利于制备高效液相色谱的进一步纯化，使纯化产物具有更高的纯度。

在本申请第一方面的一些实施方式中，所述独活提取物的水溶液的浓度为50-200mg/ml。发明人在研究中，当独活提取物的水溶液浓度为50-200mg/ml时，能够使其中的二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷得到更有效的富集，获得更高的回收率和富集倍数。

在本申请第一方面的一些实施方式中，步骤(4)中，梯度洗脱具体为：

0～20分钟，22％～22％B；20～25分钟，22％～100％B；25～35分钟，100％B。

本申请中所述的初始洗脱液是指采用梯度洗脱时，初始阶段的洗脱液，例如，当A相为水，B相为乙腈；梯度洗脱为0～20分钟，22％～22％B；20～25分钟，22％～100％B；25～35分钟，100％B时，所述初始洗脱液即为22％的乙腈溶液。

在本申请第一方面的一些实施方式中，所述独活提取物通过以下方法获得：

(1)将独活以固液比为1:8-12加热回流提取1-3小时；提取溶剂为60-80％乙醇水溶液；加热温度60-80℃；

(2)对步骤(1)得到的提取物进行浓缩和干燥，获得粗提物；

(3)以水复溶上述粗提物，得到独活提取物。

本申请第二方面提供了本申请第一方面的方法所制备的二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷。

本申请第三方面提供了本申请第一方面的方法所制备的二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷在制备镇痛药物中的用途。

本申请第四方面提供了一种用于镇痛的药物组合物，包含二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷以及任意药学上可接受的载体和/或赋形剂。

如本文所用的，“药学上可接受的”表示当以通常用药剂量使用时没有实质的毒性作用，从而可被政府或与其相当的国际组织批准或者已被批准用于动物，更特别地用于人，或者被登录在药典上。

本发明药物组合物中可用的“药学上可接受的载体或赋形剂”可以是药物制剂领域中任何常规的载体，特定载体的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学可接受的载体包括药学领域常规的溶剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、粘合剂、润滑剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂、和抗氧化剂等。必要时，还可以在药物组合物中加入香味剂、防腐剂和甜味剂等。

如本文使用的，术语“药物组合物”具有其一般含义。此外，本发明的“药物组合物”还可以以保健品、功能性食品、食品、食品添加剂等形式存在或提供。可采用制药领域特别是制剂领域中的常规技术，通过药品生产中常用的提取分离纯化手段得到本发明的药物组合物的原料的有效成分，任选地与一种或更多种药学可接受的载体混合，然后形成所需的剂型，来制备本发明的药物组合物。根据本发明的药物组合物，其为可以适用于口服给药、胃肠外给药或局部给药、外用给药的药物制剂。本发明的药物组合物可以制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。具体地说，根据本发明的药物组合物，所述的药物剂型包括但不限于：片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、注射液、注射用粉剂、透皮贴剂、软膏剂、凝胶剂、栓剂、口服溶液、口服混悬液、注射用乳剂、口服乳剂等、缓释片剂、控释片剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

用于口服施用的剂型可包括例如片剂、丸剂、硬或软胶囊剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、散剂、粉剂、细粒剂、颗粒剂、小丸剂、酏剂等，并不限于此。除了活性成分外，这些制剂还可包含稀释剂(例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和甘氨酸)、润滑剂(例如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其镁盐、钙盐和聚乙二醇)。片剂还可包含粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷。必要时，其还可包含药用添加剂，例如崩解剂(如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐)、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂等。片剂可根据常用的混合、造粒或包衣的方法制备。

用于肠道外施用的剂型可包括例如注射剂、药用滴剂、软膏剂、洗剂、凝胶剂、乳膏、喷雾剂、混悬剂、乳剂、栓剂、贴剂等，并不限于此。

根据本公开的药物组合物可口服或非肠道例如经直肠、经局部、经皮肤、经静脉内、经肌内、经腹膜内或经皮下施用。

活性成分的药学可接受的剂量，即施用剂量，可以根据待治疗对象的年龄、性别和体重、待治疗的具体疾病或病理状态、疾病或病理状态的严重程度、施用途径和诊断者的判断而改变。考虑这些因素确定施用剂量在本领域技术人员的水平范围内。一般的剂量可以是0.01-1000mg/kg/日，优选为0.1-100mg/kg/日，更优选为1-100mg/kg/日。然而，本发明公开的范围不以任何方式受限于所述施用剂量。

试剂和耗材

乙腈，色谱纯(天津康科德)；无水乙醇，分析纯(天津康科德)；超纯水制备于Mill-QⅡ型纯水仪(Millipore公司)；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)：上海麦克林生化科技有限公司；阿司匹林(aspirin)：阿斯利康制药有限公司；

独活药材购自于河北省安国市，经天津中医药大学常艳旭研究员鉴定为伞形科当归属重齿毛当归的干燥根；二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷标准品由本实验室分离纯化获得，经HPLC检测纯度大于98％。

GDX-201大孔树脂购自上海韦尔奇材料公司。其物理性能如下：

雌性C57BL/6小鼠40只，体重(20±5)g，购自于北京华阜康生物科技股份有限公司，均为SPF级别。所有动物实验均严格按照天津中医药大学实验动物指南进行，动物福利由天津中医药大学动物伦理委员会授权。

仪器

高效液相色谱仪：HPLC 1200(安捷伦科技，美国)

制备高效液相色谱仪：Shimadzu Prominence LC-20AP PHPLC(岛津，日本)

十万分之一电子天平：AX205(METTLER TOLEDO，瑞士)

超纯水器：Mill-Q II型(Millipore，美国)

实施例1独活提取物水溶液的制备

(1)2kg的独活药材采用加热回流提取2h，具体条件为：固液比为1kg：10L，提取溶剂为70％乙醇，提取次数为3次，获得的提取物经过浓缩和干燥，得到独活提取物，放置在-20℃下备用；

(2)以水溶解独活提取物获得浓度为106mg/mL的独活提取物水溶液，经高效液相色谱检测CBG浓度为477.58μg/mL，色谱图如图1A所示，计算获得CBG质量分数为0.45％。

色谱条件如下：

色谱柱：Agilent Zorbax Exclipse XDB-C18(4.6×250mm,5μm)

流动相A：乙腈流动相B:超纯水

流速：1mL/min

柱温：30℃

检测波长：325nm

进样体积：10μL

分析时间：28min

梯度洗脱方式如下：0-12min，22-22％A；12-15min，22％-95％A；15-21min，95-100％A；21-23min，100-22％A；23-28min，22-22％A。

以二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷标准品，配制浓度为0.4-500μg/mL的标准曲线工作液，建立标准曲线，标准曲线方程为：y＝25.883x+2.194(R2＝0.9998)。

实施例2二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷富集纯化

1、二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷富集纯化

(1)大孔树脂预处理：将3.0g GDX-201大孔树脂完全浸泡在无水乙醇中，静置24h，然后用超纯水冲洗，直到流出液无乙醇味；

(2)用预处理后的GDX-201大孔树脂湿法填充玻璃色谱柱(10mm×400mm，1BV＝15mL)，获得大孔树脂填充柱；取实施例1制备的独活提取物水溶液100mL，以4BV/h的流速通过大孔树脂填充柱；

(3)先后用10BV超纯水和10BV 5％乙醇冲洗大孔树脂填充柱，除去样品中的杂质；

(4)用25％乙醇(14BV)以4BV/h的流速从色谱柱上洗脱二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷，获得含有二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的馏分；

(5)将所述馏分通过减压浓缩和干燥后，用22％乙腈配制成100mg/mL的浓度；

(6)采用制备高效液相色谱对所述含有二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的馏分进行纯化，色谱条件包括：

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250×21.2mm,7μm)

流动相A：超纯水流动相B：乙腈

流速：9mL/min

检测波长：325nm

进样体积：1mL

分析时间：35min

梯度洗脱方式如下：0-20min，22-22％B；20-25min，22％-100％B；25-35min，100％B。

2、二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷富集纯化结果检测

分别将经大孔树脂富集后的含有二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的馏分、以及PHPLC纯化得到的产物，在与实施例1相同的色谱条件下检测其中二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的浓度，计算获得经大孔树脂富集后的含有二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的馏分中二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的质量分数，以及PHPLC纯化的回收率见表1(n＝3)。

表1

从表1中可以看出，当进料量为100mL时，CBG含量由0.45％提高到14.68％，回收率为90.44％。这一结果表明，GDX-201树脂可用于独活提取物中纯化二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷。

实施例3二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷富集纯化

1、二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷富集纯化

(1)大孔树脂预处理：将30gGDX-201大孔树脂完全浸泡在无水乙醇中，静置24h，然后用超纯水冲洗，直到流出液无乙醇味；

(2)用预处理后的GDX-201大孔树脂湿法填充玻璃色谱柱(40mm×600mm，1BV＝215mL)，获得大孔树脂填充柱；取实施例1制备的独活提取物水溶液1000mL，以4BV/h的流速通过大孔树脂填充柱；

(3)先后用10BV超纯水和10BV 5％乙醇冲洗大孔树脂填充柱，除去样品中的杂质；

(4)用25％乙醇(14BV)以4BV/h的流速从色谱柱上洗脱二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷，获得含有二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的馏分；

(5)将所述馏分浓缩后，干燥，加入22％乙腈溶解，配制成每100mg/mL的浓度。

(6)采用与实施例2相同的制备高效液相色谱条件，将步骤(5)中得到的溶液进行纯化，制备高效液相色谱图如图1C所示。

2、二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷富集纯化结果检测

分别将经大孔树脂富集后的含有二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的馏分、以及PHPLC纯化得到的产物，在与实施例1相同的色谱条件下检测其中二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的浓度，色谱图分别如图1B和图1D所示，将独活提取物水溶液的色谱图与大孔树脂富集后的馏分的色谱图进行比较，可以看出CBG变成了高峰(图1A和图1B)，说明CBG得到有效富集。

计算获得独活提取物、经大孔树脂富集后的含有二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的馏分中二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的质量分数，以及PHPLC纯化的回收率见表2(n＝3)。

表2

从表2中可以看出，当进料量为1000mL时，CBG含量由0.45％提高到13.32％，回收率为88.03％。这一结果表明，GDX-201树脂可用于独活提取物中大规模纯化二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷。

本实施例中，最终从25％的乙醇馏分中提取出1013.2mg的二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷，纯度大于98％。

实施例3二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷镇痛活性验证

本申请采用小鼠热板试验，评价小鼠口服CBG后的镇痛效果。

分别以4mL 0.5％CMC-Na溶液溶解实施例2纯化得到的二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷30mg、60mg，配置成浓度为7.5mg/mL、12.5mg/mL的混悬液，以4mL 0.5％CMC-Na溶解30mg的阿司匹林，配置成7.5mg/mL的阳性对照混悬液；

小鼠分为四组，分别以0.1ml/10g的剂量灌胃给与0.5％CMC-Na溶液(空白对照组)、7.5mg/mLCBG(低剂量组)、12.5mg/mLCBG(高剂量组)以及7.5mg/mL阿司匹林(阳性对照组)；

在给药后不同时间(15、30、60、90、120、240分钟)，分别将小鼠放在恒温热板(55℃)上，记录小鼠由于热刺激舔爪作出反应的时间即为热板延迟时间(或称反应潜伏期)。为避免对小鼠足爪组织造成损伤，最大痛阈值设为45s。

采用热板法测定CBG的镇痛活性，结果如图2所示，阳性对照组给药后可显著延长热板痛阈时间。低剂量组中，CBG可显著延长口服后60、90、120和240分钟的热板痛阈时间，高剂量组中，CBG可显著延长口服后30、60、90、120和240分钟的热板痛阈时间(55℃，n＝10，*P<0.05，**P<0.01，与空白对照组相比较)。这些结果说明CBG具有一定的镇痛作用。

为了进一步了解二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷和阿司匹林镇痛潜力的差异，使用以下方程计算阿司匹林和CBG的最大潜在镇痛响应(MPA)：

其中，HPT代表给药后的热板痛阈值，HPC代表灌胃0.5％CMC-Na的热板痛阈值。

结果如图3所示。在给药240min后，CBG(75mg/kg和125mg/kg)的MPA均超过阿司匹林，进一步表明二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷具有镇痛活性。

通过以上结果可以看出，采用大孔树脂与制备高效液相色谱结合，提纯独活提取物中纯化二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷，收率高，操作简单，环境友好；

通过热板试验评价CBG镇痛效果，发明CBD具有一定的镇痛活性，因此能够用于制备镇痛药物。

本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种从独活提取物中纯化二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的方法，其包括：

(1)使独活提取物的水溶液通过填充了GDX-201大孔树脂的大孔树脂填充柱，流速为3-5BV/h；其中，所述独活提取物与大孔树脂的质量比为(2-4)：1；所述聚二乙烯基苯大孔树脂经体积分数95％以上的乙醇浸泡20-30小时后，用超纯水冲洗至大孔树脂中不含乙醇；

(2)先后以8-12BV的超纯水和8-12BV的4-6％乙醇水溶液冲洗大孔树脂填充柱，以去除杂质；

(3)以20-30％乙醇水溶液洗脱获得含有二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷的馏分，浓缩，干燥，获得二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷粗品；

(4)将所述二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷粗品溶于甲醇、乙腈或制备高效液相色谱的初始流动相中，配制成浓度为50-150mg/L的溶液；

(5)采用制备高效液相色谱对步骤(4)的溶液进行纯化，色谱条件包括：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流速为8-10mL/min；流动相：A相为水，B相为乙腈；20-100％B相梯度洗脱；进样量0.5-1.5mL；检测波长为325nm。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述独活提取物的水溶液的浓度为50-200mg/ml。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(4)中，梯度洗脱具体为：

0～20分钟，22％～22％B；20～25分钟，22％～100％B；25～35分钟，100％B。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述独活提取物通过以下方法获得：

(1)将独活以固液比为1:8-12kg/L加热回流提取1-3小时；提取溶剂为60-80％乙醇水溶液；加热温度60-80℃；

(2)对步骤(1)得到的提取物进行浓缩和干燥，获得独活提取物。

5.权利要求1-4中任一项所述的方法制备的二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷。

6.权利要求5所述的二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷在制备镇痛药物中的用途。

7.一种用于镇痛的药物组合物，其包含二氢欧山芹醇-β-D-葡萄糖苷以及任意药学上可接受的载体和/或赋形剂。

8.如权利要求7所述的药物组合物，其中，所述药学可接受的载体或赋形剂选自溶剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂和抗氧化剂。

9.根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述药物组合物配制为散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、注射剂、乳剂、混悬剂或酊剂中的任意一种剂型。

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