CN112972460A - 二氢欧山芹醇当归酸酯在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了二氢欧山芹醇当归酸酯在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的用途。二氢欧山芹醇当归酸酯能够增加骨密度,改善骨微结构,抑制破骨细胞分化,从而能够预防和/或治疗骨质疏松,进而用于制备预防和/或治疗骨质疏松药物。本申请还提供了包含二氢欧山芹醇当归酸酯的植物提取物、药物组合物在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的用途。基于二氢欧山芹醇当归酸酯能够抑制破骨细胞分化,本申请还提供了二氢欧山芹醇当归酸酯及包含其的药物组合物,在制备抑制破骨细胞分化的药物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,特别是涉及二氢欧山芹醇当归酸酯在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的用途。
背景技术
骨质疏松(Osteoporosis,OP)是一种以骨量减少、骨微结构退化为主要特征,致使骨脆性增加,易发生骨折的全身性骨骼疾病。目前,中医药在治疗OP上已经取得了显著的成就,大量中药及其有效成分的临床疗效确切,在治疗OP上有其独特的优势。
二氢欧山芹醇当归酸酯(columbianadin,CBN),又名二氢欧山芹素、哥伦比亚内酯,是一种呋喃香豆素类化合物,经药理实验证实其具有良好的抗炎、镇痛、抑制血小板聚集和抗脂质过氧化作用。该物质分布较广,易获得,具有良好的应用前景。但目前未见CBN在防治骨质疏松方面的报道及应用。
发明内容
本申请的发明人通过深入研究,发现二氢欧山芹醇当归酸酯能够增加骨密度,改善骨微结构,抑制破骨细胞分化,从而可以用来预防和/或治疗骨质疏松,并基于此完成了本申请。
本申请的第一方面提供二氢欧山芹醇当归酸酯在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的用途。
本申请的第二方面提供包含二氢欧山芹醇当归酸酯的植物提取物在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的用途,其中,所述植物提取物选自独活提取物、当归提取物、紫花前胡提取物、竹叶防风提取物和花椒提取物中的至少一种。
本申请的第三方面提供二氢欧山芹醇当归酸酯在制备抑制破骨细胞分化的药物中的用途。
本申请的第四方面提供一种药物组合物,其包含二氢欧山芹醇当归酸酯。
本申请的第五方面提供本申请第四方面的药物组合物在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的用途。
本申请的第六方面提供本申请第四方面的药物组合物在制备抑制破骨细胞分化的药物中的用途。
二氢欧山芹醇当归酸酯能够增加骨密度,改善骨微结构,抑制破骨细胞分化,从而能够预防和/或治疗骨质疏松,进而用于制备预防和/或治疗骨质疏松药物。进一步的,包含二氢欧山芹醇当归酸酯的植物提取物、药物组合物,同样能够用于制备预防和/或治疗骨质疏松药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的实施例。
图1显示了术后15天时假手术组和手术组小鼠的体重和雌二醇的含量变化。
图2显示了二氢欧山芹醇当归酸酯对小鼠的体重和食物摄入量的影响。
图3显示了二氢欧山芹醇当归酸酯对小鼠骨密度的影响。
图4显示了二氢欧山芹醇当归酸酯对小鼠股骨骨微结构的影响。
图5显示了二氢欧山芹醇当归酸酯对小鼠各脏器指数的影响。
图6显示了二氢欧山芹醇当归酸酯对破骨前体细胞活性的影响。
图7显示了二氢欧山芹醇当归酸酯对破骨细胞分化的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员基于本申请所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本申请的第一方面提供二氢欧山芹醇当归酸酯在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的用途。
本申请的二氢欧山芹醇当归酸酯能够增加骨密度,改善骨微结构,抑制破骨细胞分化,从而能够预防和/或治疗骨质疏松,进而用于制备预防和/或治疗骨质疏松药物。
本申请所述骨质疏松,包括但不限于老年性骨质疏松、特发性骨质疏松或绝经后骨质疏松。本申请中,术语“治疗”具有其一般含义,并且在本文特别地是指对已经罹患骨质疏松的哺乳动物个体(优选为人)采用本申请的药物进行处理,以期对所述疾病产生治疗、治愈、缓解、减轻等作用。类似地,如本文使用的,术语“预防”具有其一般含义,并且在本文特别地是指对可能罹患骨质疏松或者对骨质疏松具有罹患风险的哺乳动物个体采用本申请的药物进行处理,以期对所述疾病产生防止、预防、阻止、隔断等作用。
本申请的第二方面提供包含二氢欧山芹醇当归酸酯的植物提取物在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的用途,其中,所述植物提取物选自独活提取物、当归提取物、紫花前胡提取物、竹叶防风提取物和花椒提取物中的至少一种。独活提取物、当归提取物、紫花前胡提取物、竹叶防风提取物或花椒提取物的提取方式现有技术中多有报道,本申请对各药物提取物的提取方式没有特别限制,本领域技术人员可以通过现有的任意方式获取包含二氢欧山芹醇当归酸酯的独活提取物、当归提取物、紫花前胡提取物、竹叶防风提取物或花椒提取物。在一种实施方式中,示例性地,可以将当归用70-80%乙醇溶液进行加热回流提取,得到包含二氢欧山芹醇当归酸酯的当归提取物。
本申请的第三方面提供二氢欧山芹醇当归酸酯在制备抑制破骨细胞分化的药物中的用途。
本申请的二氢欧山芹醇当归酸酯能够抑制破骨细胞分化,从而用于制备抑制破骨细胞分化的药物。发明人在研究中发现,破骨细胞分化增多导致骨吸收功能亢进,会引起如骨质疏松症等各种骨代谢性疾病,本申请的二氢欧山芹醇当归酸酯能够抑制破骨细胞分化,从而可以用于制备抑制破骨细胞分化的药物。
本申请的第四方面提供一种药物组合物,其包含二氢欧山芹醇当归酸酯。
在本申请第四方面的一些实施方式中,所述二氢欧山芹醇当归酸酯是以单体的形式提供,或以包含其的植物提取物的形式提供。优选地,所述植物提取物选自独活提取物、当归提取物、紫花前胡提取物、竹叶防风提取物和花椒提取物中的至少一种。
在本申请第四方面的一些实施方式中,所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。
在本申请第四方面的一些实施方式中,所述药学上可接受的载体或赋形剂选自稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂、分散剂、助悬剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂和包衣材料中的至少一种。
本申请所述药学上可接受的载体或赋形剂,可以包括但不限于单硬脂酸铝、硬脂酸铝、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、交聚维酮、异硬脂酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、羟基乙基纤维素、羟基甲基纤维素、羟基硬脂酸羟基二十八酯、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、乳糖、乳糖一水合物、硬脂酸镁、甘露醇或微晶纤维素等以及它们的任意组合。
本文中,“药学上可接受的”表示当以通常用药剂量使用时没有实质的毒性作用,从而可被政府或与其相当的国际组织批准或者已被批准用于动物,更特别地用于人,或者被登录在药典上。
本申请药物组合物中可用的“药学上可接受的载体或赋形剂”可以是药物制剂领域中任何常规的载体,特定载体的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。
如本文使用的,术语“药物组合物”具有其一般含义。此外,本申请的“药物组合物”还可以以保健品、功能性食品、食品、食品添加剂等形式存在或提供。可采用制药领域特别是制剂领域中的常规技术,通过药品生产中常用的提取分离纯化手段得到本申请的药物组合物的原料的有效成分,任选地与一种或更多种药学可接受的载体或赋形剂混合,然后形成所需的剂型,来制备本申请的药物组合物。根据本申请的药物组合物,其为可以适用于口服给药的药物制剂、适用于胃肠外注射(例如静脉注射、皮下注射)的药物制剂(例如溶液剂)、适用于表面给药的药物制剂(例如软膏剂、贴剂或乳膏剂)、或适用于直肠给药的药物制剂(例如栓剂)等。用于口服施用的剂型可包括例如片剂、丸剂、硬或软胶囊剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、散剂、粉剂、细粒剂、颗粒剂、小丸剂、酏剂等,并不限于此。除了活性成分外,这些制剂还可包含稀释剂(例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和甘氨酸)、润滑剂(例如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其镁盐、钙盐和聚乙二醇)。片剂还可包含粘合剂,例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷。必要时,其还可包含药用添加剂,例如崩解剂(如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐)、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂等。片剂可根据常用的混合、造粒或包衣的方法制备。
本申请的第五方面提供本申请第四方面的药物组合物在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的用途。
本申请的第六方面提供本申请第四方面的药物组合物在制备抑制破骨细胞分化的药物中的用途。
材料:二氢欧山芹醇当归酸酯(CBN):成都化纯生物技术有限公司;结合雌激素片:红丽来,新疆新资源生物制药有限责任公司生产;8周龄C57BL/6J雌性小鼠,体重18-20g,由北京斯贝福实验动物技术有限公司提供;4-6周龄C57BL/6雌性小鼠:北京斯贝福实验动物技术有限公司;磷酸盐缓冲液(PBS):BI;α-MEM完全培养基:Gibico;淋巴细胞分离液(ficoll细胞分离液):GE Life;CCK-8试剂盒:同仁;抗酒石酸酸性磷酸酶试剂盒(TRAP试剂盒):碧云天;巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF):RD;核因子κB受体活化因子配体(RANKL):RD。仪器:双能X射线骨密度仪:美国Faxtiron Bioptics,LLC;Micro-CT扫描设备:瑞士SCANCOMEDICAL;倒置显微镜:NIKON。
下述实施例中所用实验材料和方法,如无特别说明,均为常规材料和方法。
实验动物模型的建立与分组
二氢欧山芹醇当归酸酯,用0.2%羧甲基纤维素钠分别制备成浓度为5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml的二氢欧山芹醇当归酸酯混悬液。结合雌激素片,用0.2%羧甲基纤维素钠制备成浓度为0.0039mg/ml的结合雌激素溶液。
卵巢切除术(OVX)模型是目前使用最广泛的实验用骨质疏松症动物模型。选用健康8周龄C57BL/6J雌性小鼠80只,体重18-20g,随机取12只作为假手术组,其余为手术组。手术组结扎并摘除双侧卵巢,假手术组摘取卵巢周围与手术组摘除的双侧卵巢体积大致相等的脂肪组织。术后15天后将去卵巢小鼠随机分为模型组、结合雌激素组、低剂量组、中剂量组和高剂量组,每组各12只。各组小鼠每天按体重给药,其中假手术组和模型组小鼠给予10ml/kg的0.2%羧甲基纤维素钠;结合雌激素组(0.039mg/kg),给予0.0039mg/ml的结合雌激素溶液,给药量为10ml/kg;低剂量组(12.5mg/kg),给予1.25mg/ml的二氢欧山芹醇当归酸酯混悬液,给药量为10ml/kg;中剂量组(25mg/kg),给予2.5mg/ml的二氢欧山芹醇当归酸酯混悬液,给药量为10ml/kg;高剂量组(50mg/kg),给予5mg/ml的二氢欧山芹醇当归酸酯混悬液,给药量为10ml/kg;连续给药10周。其中,结合雌激素是现有的预防骨质疏松的常用药物,在本申请中作为阳性对照。
实施例1二氢欧山芹醇当归酸酯对去卵巢小鼠体重和食物摄入量的影响
采用上述实验动物模型与分组,监测术后15天时,假手术组和手术组小鼠的体重和血浆中雌二醇的变化情况,结果如图1所示,与假手术组比,手术组小鼠的体重明显升高(n=12,#P<0.05,与假手术组比),血浆中雌二醇的水平明显降低(n=12,#P<0.05,与假手术组比),说明造模成功。
监测连续给药10周各组小鼠的体重和饮食(食物摄入量)情况,结果如图2所示,从图2可以看出,模型组和低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠的体重和饮食情况没有明显差异,表明二氢欧山芹醇当归酸酯对去卵巢小鼠的体重和饮食情况没有明显影响。
实施例2二氢欧山芹醇当归酸酯对去卵巢小鼠骨密度的影响
采用上述实验动物模型与分组,连续给药10周后检测二氢欧山芹醇当归酸酯对去卵巢小鼠骨密度的影响,用双能X射线骨密度仪检测各组小鼠的全身骨密度、腰椎、后腿胫骨和股骨的骨密度,结果如图3所示,从图中可以看出,与假手术组相比,模型组小鼠的全身骨密度、腰椎、后腿胫骨和股骨的骨密度明显降低(n=12,#P<0.05,与假手术组比)。与模型组相比,结合雌激素组和高剂量组小鼠的全身骨密度、腰椎、后腿胫骨和股骨的骨密度都有明显升高(n=12,*P<0.05,与模型组比)。表明二氢欧山芹醇当归酸酯能有效的减缓去卵巢所致的骨流失,从而能够用于预防和/或治疗骨质疏松。
实施例3二氢欧山芹醇当归酸酯对去卵巢小鼠股骨骨微结构的影响
采用上述实验动物模型与分组,采用双能X射线骨密度仪进行骨密度检测后取材,用Micro-CT扫描设备扫描各组小鼠股骨骨微结构,检测得到股骨远端骨小梁连接度、骨小梁数量、骨小梁分离度和各向异性指数结果如图4所示,与假手术组相比,模型组小鼠的股骨远端骨小梁连接度和骨小梁数量明显降低(n=12,#P<0.05,与假手术组比),骨小梁分离度和各向异性指数明显增加(n=12,#P<0.05,与假手术组比),表明模型组小鼠出现了股骨骨微结构退化;与模型组相比,低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠的股骨远端骨小梁连接度和骨小梁数量明显增加(n=12,*P<0.05,与模型组比),骨小梁分离度和各向异性指数明显降低(n=12,*P<0.05,与模型组比),表明二氢欧山芹醇当归酸酯能够明显改善股骨骨微结构,从而能够用于预防和/或治疗骨质疏松。
实施例4二氢欧山芹醇当归酸酯对去卵巢小鼠各脏器指数的影响
采用上述实验动物模型与分组,连续给药10周后取材,各组小鼠处死,取肝、心、脾、肺、肾、子宫,称重,与体重相比计算各脏器指数,各脏器指数为各脏器重量与体重的比值,结果如图5所示,可以看出,二氢欧山芹醇当归酸酯对去卵巢小鼠的肝脏指数、心脏指数、脾脏指数、肺脏指数、肾脏指数没有明显影响;而对于子宫指数,与假手术组相比,模型组小鼠的子宫指数有明显降低(n=12,#P<0.05,与假手术组比);给药后中剂量组小鼠的子宫指数较模型组有显著升高(n=12,*P<0.05,与模型组比);结果表明二氢欧山芹醇当归酸酯对各脏器没有明显的毒副作用。
实施例5二氢欧山芹醇当归酸酯对破骨前体细胞活性的影响
破骨细胞是骨细胞的一种,行使骨吸收的功能。发明人在研究中发现,破骨细胞过度分化,会引起如骨质疏松症等各种骨代谢性疾病。破骨前体细胞是由骨髓中的造血干细胞生成,许多细胞因子或生长因子可直接或间接地诱导破骨前体细胞分化为破骨细胞,介导骨吸收。本申请中,破骨细胞分化,是指破骨前体细胞向破骨细胞分化的过程。本实施例研究了二氢欧山芹醇当归酸酯对破骨前体细胞活性的影响。
获得破骨前体细胞:取一只4-6周龄C57BL/6雌性小鼠,处死后浸泡于75%乙醇中;分离小鼠后腿双侧股骨与胫骨,置含10%双抗的PBS中;在含10%双抗的PBS中进一步分离肌肉组织;在含1%双抗的PBS中,用1mL注射器吹打骨腔至无色,然后用1mL移液枪吹散骨髓细胞;将细胞悬液用200目细胞筛过滤到15mL离心管中;取一只新的15mL离心管,避光加入3mL淋巴细胞分离液(ficoll细胞分离液),将细胞悬液沿管壁缓缓加至离心管中,不足12mL的用PBS补齐;25℃、2150RPM离心20min,升降速为2;取出离心管,观察分离情况,从下至上分别为红细胞及粒细胞层、分离液层、骨髓来源单核细胞层、血小板层;用1mL移液枪吸弃部分血小板层溶液,然后沿骨髓来源单核细胞层底部吸取骨髓来源单核细胞至新的15mL离心管;加PBS至14mL,4℃、2450RPM离心5min;吸弃上清,去除残余分离液;加1ml PBS吹散细胞;加PBS至5mL,4℃、1300RPM离心5min;吸弃上清,去除血小板,加入1ml PBS吹散细胞,然后加入4mL红细胞裂解液,4℃孵育10min;加PBS至14mL,4℃、1400RPM离心15min;吸弃上清,加入5mLα-MEM完全培养基,混匀细胞;将细胞种于25cm2培养瓶中,置37℃、5%CO2培养箱中过夜。将培养瓶从孵箱中取出,轻轻摇晃使细胞分散均匀;取10μL单核细胞悬液至含90μLα-MEM完全培养基的0.2mL EP管中,混匀;用75%乙醇擦净细胞计数板,并盖上盖玻片;取10μL稀释后的单核细胞悬液,缓慢从盖玻片边缘打入,使单核细胞悬液充满计数板与盖玻片之间的空隙,几分钟后在倒置显微镜下观察,并记录4个大格中的细胞数目;按照公式计算单核细胞悬液密度:单核细胞数/mL=(4个大格中单核细胞数目/4)×104×稀释倍数10。用含25ng/mL M-CSF的α-MEM完全培养基调整细胞密度至3×105个/mL,然后接种于96孔板中(100μL/孔)。在37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养72h诱导形成破骨前体细胞。
将生长状态良好的破骨前体细胞分为对照组(25ng/mL M-CSF+α-MEM完全培养基)与不同剂量二氢欧山芹醇当归酸酯组(25ng/mL M-CSF+不同浓度的二氢欧山芹醇当归酸酯+α-MEM完全培养基),其中二氢欧山芹醇当归酸酯的终浓度分别为10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L,每组6个复孔,重复3次。在37℃、5%CO2浓度条件下培养5天后用CCK-8试剂盒检测,第三天时换一次液。CCK-8检测按照试剂盒使用说明进行,即从培养箱中取出细胞板,吸弃上清,每孔加入预先配制的CCK-8溶液100μL(CCK-8溶液:α-MEM培养基=1:10),37℃孵育2h后,在450nm下测各孔的吸光度值(OD)。通过测得的OD值,比较求得二氢欧山芹醇当归酸酯对破骨前体细胞活性的影响,以对照组细胞存活率为1.0,各组细胞存活率结果如图6所示,结果显示,10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L的二氢欧山芹醇当归酸酯(CBN)均不影响破骨前体细胞的活性。
实施例6二氢欧山芹醇当归酸酯对破骨细胞分化的影响
将生长状态良好的破骨前体细胞分为对照组(25ng/mL M-CSF+α-MEM完全培养基)、模型组(25ng/mL M-CSF+50ng/mL RANKL+α-MEM完全培养基)、不同剂量二氢欧山芹醇当归酸酯组(25ng/mL M-CSF+50ng/mL RANKL+不同浓度的二氢欧山芹醇当归酸酯+α-MEM完全培养基),其中二氢欧山芹醇当归酸酯的终浓度分别为10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L,每组6个复孔,重复3次。在37℃、5%CO2浓度条件下培养5天后用TRAP试剂盒检测,第三天时换一次液。TRAP活性检测按照TRAP试剂盒使用说明进行,TRAP活性检测结果如图7所示,结果显示,10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L的二氢欧山芹醇当归酸酯能够明显抑制RANKL诱导的破骨细胞分化(n=6,*P<0.05,与模型组比)。
综上,二氢欧山芹醇当归酸酯能够增加骨密度,改善骨微结构,抑制破骨细胞分化,从而能够用于预防和/或治疗骨质疏松,进而用于制备预防和/或治疗骨质疏松药物。进一步地,二氢欧山芹醇当归酸酯能够抑制破骨细胞分化,从而可用于制备抑制破骨细胞分化的药物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等,均包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.二氢欧山芹醇当归酸酯在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的用途。
2.包含二氢欧山芹醇当归酸酯的植物提取物在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的用途,其中,所述植物提取物选自独活提取物、当归提取物、紫花前胡提取物、竹叶防风提取物和花椒提取物中的至少一种。
3.二氢欧山芹醇当归酸酯在制备抑制破骨细胞分化的药物中的用途。
4.一种药物组合物,其包含二氢欧山芹醇当归酸酯。
5.根据权利要求4所述的药物组合物,其中,所述二氢欧山芹醇当归酸酯是以单体的形式提供,或以包含其的植物提取物的形式提供。
6.根据权利要求5所述的药物组合物,其中,所述植物提取物选自独活提取物、当归提取物、紫花前胡提取物、竹叶防风提取物和花椒提取物中的至少一种。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的药物组合物,其中,所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。
8.根据权利要求7所述的药物组合物,其中,所述药学上可接受的载体或赋形剂选自稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂、分散剂、助悬剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂和包衣材料中的至少一种。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的药物组合物在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的用途。
10.根据权利要求4-8中任一项所述的药物组合物在制备抑制破骨细胞分化的药物中的用途。
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