CN111771727A - 一种盖亚规模化无性繁殖种苗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种盖亚规模化无性繁殖种苗方法，通过步骤(1)盖亚外植体培育；(2)盖亚组培无菌材料诱导；(3)驯化与继代增殖扩繁；(4)壮苗生根；(5)种苗温室种植，可实现盖亚组培苗的产业化培育，最终可在短期内获得批量优质种苗。
Description
技术领域
本发明涉及植物无性繁殖技术领域，特别是涉及一种盖亚[Nepenthes St.'Gaya’]种苗规模化组培生产快速繁殖技术。
背景技术
盖亚(Gaya)属猪笼草科(Nepenthaceae)多年生半木质化藤本植物，属食虫植物系列；盖亚它是通过杂交育种选育而成，雌雄异株，总状花序，叶互生，叶色绿色，中脉延长为卷须，末端有一小直笼，叶笼小瓶状，瓶口边缘厚，上有小盖，成长时盖张开，不能再闭合，笼色红色间明显条纹，笼内壁光滑，笼底能分泌粘液和消化液，有气味引诱昆虫、动物，一旦其落入笼内，很难逸出，终被消化和吸收作为其营养供给。
盖亚喜光，喜温暖湿润的环境，适宜富含腐殖质、排水透气性好的土壤，常用扦插法或播种繁殖。盖亚是新培育品种市场上对种苗需求急增，常规扦插、播种育苗短期内无法获得批量种苗。如何使盖亚优良性状在后代个体中遗传性稳定，是实现盖亚种苗产业开发、生产关键技术。
有鉴于此，本案发明人进行深入研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可在短期内获得批量优质种苗的盖亚规模化无性繁殖种苗方法。
为了达成上述目的，本发明的技术方案是：
一种盖亚规模化无性繁殖种苗方法，包括如下步骤：
(1)母株的先择、预处理与外植体培育、采集
选择健壮、具有母本性状的多年生盖亚为母株，经去顶处理后，培育至其萌发新芽，再经特定培养后，待新芽带2-5个节长度30-80mm时，取新枝顶芽节段作为外植体；
(2)无菌材料获得
将采集好的外植体，切去基部过长部分保证顶芽15～25mm，茎段含节15～20mm，先消毒，再用无菌水漂洗3-4次，将漂洗好的外植体切去截面变色部分，按带茎段或顶芽接种于经灭菌后的1/4MS改良培养基，于特定培育条件下，培养6～8周，得到第一代无菌材料，第一代无菌材料的获得率高达45％以上；
(3)无菌材料的驯化
第一代无菌材料培养后，当新芽抽出长度大于15～25mm时，去顶留10～15mm，侧芽分化时以2-3芽/团方向性切割，接种于经灭菌好的1/4MS改良培养基，于特定培育条件下，培养6-8周，得到第二代无菌材料，经上述4～5代培养后驯化完成；
(4)无菌材料的继代扩繁
驯化完成后培育材料进入扩繁阶段，扩繁阶段的材料每团有3-5个芽，按2-3芽/团切割，当新芽抽出长度大于20mm时，去顶留8-10mm，或带节茎段10～20mm增殖，接种于1/4MS改良培养基，于特定培育条件下，培养5-7周；
(5)壮苗培养
将经扩繁培养后的芽团按2-3芽/团方向性切割后，接种到壮苗培养基1/4MS改良培养基，于特定培育条件下，培养4～6周；
(6)生根培养
当团块上的芽20-30mm、具有3.5片叶片且叶片平展时，按单芽切割切下来接种到生根培养基1/6MS改良培养基，于特定培育条件下，培养20天后开始生根，4～6周后生根率达99％，根数3～8条，植株高度30～50mm；
(7)温室种植
将生根培养后的植株移植至基质上，每7天浇灌花多多肥料4000倍液一次，种植2.5～4.0月，种植条件为：温度15～28℃、RH70～90％、光强前3周50～80μmol·m-2·s-1，3周后80～180mol·m-2·s-1。
进一步地，步骤(2)、(3)(4)和(5)中所用1/4MS改良培养基：1/4MS添加VC30～100mg·L-1,、柠檬酸10-60mg·L-1，、6-苄基腺嘌呤1.0～8.0mg·L-1、a-萘乙酸0.1-0.5mg·L-1，、蔗糖15-35g·L-1和卡拉胶8.0～12.0g·L-1，pH值5.6～6.0。
进一步地，步骤(6)中所用1/6MS改良培养基：1/6MS改良添加VC10～30mg·L-1,、柠檬酸10-30mg·L-1、吲哚丁酸(IBA)0.5-3mg·L-1、a-萘乙酸(NAA)0.1-0.5mg·L-1、活性炭300-1000mg·L-1、蔗糖15～35g·L-1和卡拉胶8.0-16.0g·L-1，pH值5.6～6.0。
进一步地，步骤(1)的特定培养的条件为通风、弱光5～10μmol·m-2·s-1，，光照5～8H/D，RH60～75％，温度18～25℃。
进一步地，步骤(2)的特定培育条件为温度25±1.5℃，光照12±1H/D,光强25.75-55.25μmol·m-2·s-1，RH30-60％；
步骤(3)的特定培育条件为温度25±1.5℃，光照12±1H/D,光强35.75-55.5μmol·m-2·s-1，RH30-65％；
步骤(4)的特定培育条件为温度25±1.5℃，光照12±1H/D,光强38.75-60.5μmol·m-2·s-1，RH30-65％。
进一步地，步骤(5)的特定培育条件为温度26±1℃，光强12±1H/D，光照45-75.5μmol·m-2·s-1，湿度30-65％。
进一步地，步骤(6)的特定培育条件为温度26±1℃，光照时间12±1D，光强55.0-85.25μmol·m-2·s-1，RH30-60％。
进一步地，步骤(7)中，按体积比计，基质包括椰糠4份和泥炭土3份。
进一步地，步骤(7)中，所用花多多肥料有两种，分别为含氮、磷、钾为30︰10︰10的花多多，以及含氮、磷、钾为20︰20︰20的花多多，两种花多多肥料交替使用。
进一步地，步骤(7)中，种植2.5～4.0月后即可出货，出货前1～2周，光强增加到200～250mol·m-2·s-1，施肥频率一次/周。
采用上述技术方案后，本发明一种盖亚规模化无性繁殖种苗方法，具有以下有益效果：
1、外植体的培育
本发明采用优良、健壮的盖亚为母株，通特定环境培养育，待新芽带2-5个节长度30-80mm时，取新枝顶芽节段作为外植体。保证母株枝条产生新芽25-45mm时即可采集作为外植体，这样保证母株遗传性状稳定，内含的引起褐化少、污染低，内生菌也相对少，提高无菌外植体获得率，有利于后期的产业化生产的稳定。经过多次重复，无菌获得率可达到45％以上。
2、切割方法
本发明得出继代团块切割方法，决定了后期材料的长势与扩繁系数，团块过小时易出现褐化导致死亡，芽数过少或过高不去顶则培养后主芽顶端优势明显，无法提升扩繁系数。
进一步地，
3、诱导、驯化、增殖及壮苗生根培养基工艺的确认。
通过缩短驯化周期，本发明对诱导、扩繁、壮苗、生根的培养基优化改过，1/4MS为基本培养基并对其改良，添加维生素C(VC)10～60mg·L-1,、柠檬酸10-60mg·L-1加入保证外植体褐化程度降低，保证芽的稳定生长，芽减轻组培褐化现象，保证组培苗的健壮，重复性强，驯化周期短，继代周期稳定。壮苗及生根1/6MS好，保证组培苗种植种成活率满足产业化生产需要。
4、组培苗各阶段的培养条件优化，保证其培养能够稳定生长，尤其是诱导、驯化生根苗培养光照度值确认，培养基的确认及各阶段激素的变化、抗褐化剂的用量不同，保证组培苗的品质，同时保证组培苗和均一性和稳定性，成活率和商品率均达到产业化要求。
5、组培苗的种植工艺
栽培无土基质的配方、栽培水肥管理，光温、温度及生产周期的控制，保证其产业化需求。
具体实施方式
为了进一步解释本发明的技术方案，下面通过具体实施例来对本发明进行详细阐述。
一种盖亚规模化无性繁殖种苗方法，包括如下步骤：
(1)母株的先择、预处理与外植体培育、采集
选择健壮、无病虫害、具有母本性状的多年生盖亚为母株。
将藤本枝条株高/长500～800mm的母株，从茎基部留3～5节去顶，在茎基部埋入栽培土(品氏泥炭土0～30mm)，保证切口露出基质约10mm，在通风、温度24～26℃、RH70～80％、LED植物生长灯颜色比为2红:3白，光强40～60μmol·m-2·s-1，的条件下，培养2～3月后萌发新芽，待新芽长出5～10mm时将母株放置在通风、弱光5～10μmol·m-2·s-1，，光照5～8H/D，RH60～75％，温度18～25℃的条件下，培养1～3W后新芽长度40-90mm时，取新枝顶芽、节段作为外植体。
需要说明的是，盖亚母株是半木质化藤本、其藤本枝条含有酚类物质多，内生菌多，直接做外植体很难获得成功。
(2)无菌材料获得
将步骤(1)采集好的外植体，先擦去表现的灰尘、切去基部过长部分保证顶芽的长度为15～25mm，茎段含节的长度为15～20mm，先用75％酒精消毒8～10S后，立即放入事先备好的0.1％升汞消毒8-12min，再快速用无菌水漂洗3-4次，每次1-3分钟。
将漂洗好的外植体切去截面变色部分，按带茎段或顶芽接种，1个外植体/杯，接种于经灭菌好的1/4MS改良培养基，进行外植体诱导。
1/4MS改良培养基是在1/4MS培养基的基础上添加维生素C(VC)30～100mg·L-1,、柠檬酸10-60mg·L-1，、6-苄基腺嘌呤(6-BA)1.0～8.0mg·L-1、a-萘乙酸(NAA)0.1-0.5mg·L-1，、蔗糖15-35g·L-1和卡拉胶8.0～12.0g·L-1，pH值5.6～6.0。
诱导培养条件为：温度25±1.5℃，光照12±1H/D，光强25.75-55.25μmol·m-2·s-1，RH30-60％，培养周期6～8周，得到第一代无菌材料。本发明中，外植体诱导后其第一代无菌材料获得率高达45％以上。
(3)无菌材料的驯化
第一代无菌材料培养后，当新芽抽出长度大于15～25mm时，去顶留10～15mm，侧芽分化时以2-3芽/团方向性切割。将切割好的芽团接种于经灭菌好的1/4MS改良培养基进行驯化。
1/4MS改良培养基是在1/4MS培养基的基础上添加VC30～100mg·L-1,、柠檬酸10-60mg·L-1、6-BA 0.1～4.0mg·L-1、NAA0.01-0.3mg·L-1、蔗糖20-40g·L-1和卡拉胶8.0-12.0g·L-1，pH值5.6～6.0。
驯化培养条件为：温度25±1.5℃，光照12±1H/D,光强35.75-55.5μmol·m-2·s-1，RH30-65％，培养周期6-8周，培育后得到第二代无菌材料。
经上述4～5次(代)培养后即驯化完成，得到的培育材料进入扩繁阶段。
经过多次论证，经过步骤(1)特定培养的新抽或侧顶芽作为外植体，其褐化程度低，缩短了驯化周期近3代(常规需要6代，每代周期6～8W)。
(4)无菌材料的继代扩繁
进入扩繁阶段的培育材料每团有3-5个芽，按2-3芽/团切割，当新芽抽出长度大于20mm时，去顶留8-10mm，或带节茎段10～20mm增殖，接种于1/4MS改良培养基，进行扩繁。
1/4MS改良培养基是在1/4MS培养基的基础上添加VC30～100mg·L-1,、柠檬酸10-60mg·L-1、6-BA0.1～4.0mg·L-1、NAA0.01-0.3mg·L-1、蔗糖20-40g·L-1和卡拉胶8.0-12.0g·L-1，pH值5.6～6.0。
扩繁培养条件为：温度25±1.5℃，光照12±1H/D,光强38.75-60.5μmol·m-2·s-1，RH30-65％，培养周期5-7周。
需要说明的是，继代团块切割方法，影响后期材料的长势与扩繁系数，团块单、过细弱均不利于芽团增殖；如不去顶则培养后主芽顶端优势明显，扩繁系数也会降低。本发明的扩繁倍率达到2.5-4.2。
(5)壮苗培养
将经扩繁培养后的芽团按2-3芽/团方向性切割后，接种到壮苗培养基，进行壮苗培养。壮苗培养基即为1/4MS改良培养基，
1/4MS改良培养基是在1/4MS培养基的基础上添加VC10～60mg·L-1,、柠檬酸10-50mg·L-1、6-BA 0.01～1.0mg·L-1、NAA 0.01-0.3mg·L-1、蔗糖20-40g·L-1和卡拉胶8.0-12.0g·L-1，pH值5.6～6.0。
壮苗培养条件为：温度26±1℃，光强12±1H/D，光照45-75.5μmol·m-2·s-1，湿度30-65％，培养周期4-6周。
(6)生根培养
当团块上的芽20-30mm、具有3.5片叶片且叶片平展时，按单芽切割切下来接种到生根培养基，生根培养基为1/6MS改良培养基。
1/6MS改良培养基是在1/6MS培养基的基础上添加VC 10～30mg·L-1,、柠檬酸10-30mg·L-1、IBA 0.5-3mg·L-1、NAA 0.1-0.5mg·L-1、活性炭300-1000mg·L-1、蔗糖15～35g·L-1和卡拉胶8.0-16.0g·L-1，pH值5.6～6.0。
生根培养条件为：温度26±1℃，光照时间12±1D，光强55.0-85.25μmol·m-2·s-1，RH30-60％。
生根培养20D后开始长根，4-6周后长根率达99.00％，根数3～8条，植株高度30～50mm，5片完整叶的组培苗即可种植或直接对外出售。
(7)温室种植
容器：选择72目穴盘，按体积比计，基质是椰糠4份+泥炭土3份(品氏0～10mm),先用50％的多菌灵800倍液浸泡消毒组培苗3-5分钟，捞起后稍晾再种植；先将基质浇透水，种植深度以埋住苗的根茎部为准。移植后加盖70％遮阴率的荫网2～3周后移网。晴天25℃以上早上9点和下午2点各喷一次叶面水。每7天浇灌花多多(氮磷钾含量为30︰10︰10和氮磷钾含量为20︰20︰20)4000倍液一次，2种肥料轮流使用。种植2.5～4.0月后可出售。
管理要点:温度15～28℃、RH70～90％、光强前三周50～80μmol·m-2·s-1、3周后80～180mol·m-2·s-1，出货前1～2周可适当增加光强200～250mol·m-2·s-1，施肥频率一次/周。
本发明建立一套完整成熟的规模化组培繁殖技术体系，可应用于盖亚组培苗产业化生产，其优点如下：
1、外植体的培育
本发明采用优良、健壮、无病虫害、具有母本性状的盖亚为母株，通过去顶处理，增加新的基质，特定环境培养育2～3月其新萌发新芽，通风、弱光5～10μmol·m-2·s-1，，短光照5～8H/D，特定湿RH60～70％，恒温22～25℃，特定培养1～3W后，待新芽带2-5个节长度30-80mm时，取新枝顶芽节段作为外植体。
保证母株枝条产生新芽25-45mm时即可采集作为外植体，这样保证母株遗传性状稳定，内含的引起褐化少、污染低，内生菌也相对少，提高无菌外植体获得率，有利于后期的产业化生产的稳定。经过多次重复，无菌获得率可达到45％以上。
2、诱导、驯化、增殖及壮苗生根培养基工艺的确认。
通过缩短驯化周期，本发明对诱导、扩繁、壮苗、生根的培养基优化改过，1/4MS为基本培养基并对其改良，添加VC10～60mg·L-1,、柠檬酸10-60mg·L-1加入保证外植体褐化程度降低，保证芽的稳定生长，芽减轻组培褐化现象，保证组培苗的健壮，重复性强，驯化周期短，继代周期稳定。壮苗及生根1/6MS好，保证组培苗种植种成活率满足产业化生产需要。
3、切割方法
本发明得出继代团块切割方法，决定了后期材料的长势与扩繁系数，团块过小时易出现褐化导致死亡，芽数过少或过高不去顶则培养后主芽顶端优势明显，无法提升扩繁系数。
4、组培苗各阶段的培养条件优化，保证其培养能够稳定生长，尤其是诱导、驯化生根苗培养光照度值确认，培养基的确认及各阶段激素的变化、抗褐化剂的用量不同，保证组培苗的品质，同时保证组培苗和均一性和稳定性，成活率和商品率均达到产业化要求。
5、组培苗的种植工艺
栽培无土基质的配方、栽培水肥管理，光温、温度及生产周期的控制，保证其产业化需求。
上述实施例并非限定本发明的种苗方法，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。
Claims (10)
1.一种盖亚规模化无性繁殖种苗方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)母株的先择、预处理与外植体培育、采集
选择健壮、具有母本性状的多年生盖亚为母株，经去顶处理后，培育至其萌发新芽，再经特定培养后，待新芽带2-5个节长度30-80mm时，取新枝顶芽节段作为外植体；
(2)无菌材料获得
将采集好的外植体，切去基部过长部分保证顶芽15～25mm，茎段含节15～20mm，先消毒，再用无菌水漂洗3-4次，将漂洗好的外植体切去截面变色部分，按带茎段或顶芽接种于经灭菌后的1/4MS改良培养基，于特定培育条件下，培养6～8周，得到第一代无菌材料，第一代无菌材料的获得率高达45％以上；
(3)无菌材料的驯化
第一代无菌材料培养后，当新芽抽出长度大于15～25mm时，去顶留10～15mm，侧芽分化时以2-3芽/团方向性切割，接种于经灭菌好的1/4MS改良培养基，于特定培育条件下，培养6-8周，得到第二代无菌材料，经上述4～5代培养后驯化完成；
(4)无菌材料的继代扩繁
驯化完成后培育材料进入扩繁阶段，扩繁阶段的材料每团有3-5个芽，按2-3芽/团切割，当新芽抽出长度大于20mm时，去顶留8-10mm，或带节茎段10～20mm增殖，接种于1/4MS改良培养基，于特定培育条件下，培养5-7周；
(5)壮苗培养
将经扩繁培养后的芽团按2-3芽/团方向性切割后，接种到壮苗培养基1/4MS改良培养基，于特定培育条件下，培养4～6周；
(6)生根培养
当团块上的芽20-30mm、具有3.5片叶片且叶片平展时，按单芽切割切下来接种到生根培养基1/6MS改良培养基，于特定培育条件下，培养20天后开始生根，4～6周后生根率达99％，根数3～8条，植株高度30～50mm；
(7)温室种植
将生根培养后的植株移植至基质上，每7天浇灌花多多肥料4000倍液一次，种植2.5～4.0月，种植条件为：温度15～28℃、RH70～90％、光强前3周50～80μmol·m-2·s-1，3周后80～180mol·m-2·s-1。
2.如权利要求1所述的一种盖亚规模化无性繁殖种苗方法，其特征在于：步骤(2)、(3)(4)和(5)中所用1/4MS改良培养基：1/4MS添加VC30～100mg·L-1’、柠檬酸10-60mg·L-1’、6-苄基腺嘌呤1.0～8.0mg·L-1、a-萘乙酸0.1-0.5mg·L-1’、蔗糖15-35g·L-1和卡拉胶8.0～12.0g·L-1，pH值5.6～6.0。
3.如权利要求1所述的一种盖亚规模化无性繁殖种苗方法，其特征在于：步骤(6)中所用1/6MS改良培养基：1/6MS改良添加VC10～30mg·L-1’、柠檬酸10-30mg·L-1、IBA 0.5-3mg·L-1、NAA0.1-0.5mg·L-1、活性炭300-1000mg·L-1、蔗糖15～35g·L-1和卡拉胶8.0-16.0g·L-1，pH值5.6～6.0。
4.如权利要求1所述的一种盖亚规模化无性繁殖种苗方法，其特征在于：步骤(1)的特定培养的条件为通风、弱光5～10μmol·m-2·s-1’，光照5～8H/D，RH60～75％，温度18～25℃。
5.如权利要求1所述的一种盖亚规模化无性繁殖种苗方法，其特征在于：步骤(2)的特定培育条件为温度25±1.5℃，光照12±1H/D,光强25.75-55.25μmol·m-2·s-1，RH30-60％；
步骤(3)的特定培育条件为温度25±1.5℃，光照12±1H/D,光强35.75-55.5μmol·m-2·s-1，RH30-65％；
步骤(4)的特定培育条件为温度25±1.5℃，光照12±1H/D,光强38.75-60.5μmol·m-2·s-1，RH30-65％。
6.如权利要求1所述的一种盖亚规模化无性繁殖种苗方法，其特征在于：步骤(5)的特定培育条件为温度26±1℃，光强12±1H/D，光照45-75.5μmol·m-2·s-1，湿度30-65％。
7.如权利要求1所述的一种盖亚规模化无性繁殖种苗方法，其特征在于：步骤(6)的特定培育条件为温度26±1℃，光照时间12±1D，光强55.0-85.25μmol·m-2·s-1，RH30-60％。
8.如权利要求1所述的一种盖亚规模化无性繁殖种苗方法，其特征在于：步骤(7)中，按体积比计，基质包括椰糠4份和泥炭土3份。
9.如权利要求1所述的一种盖亚规模化无性繁殖种苗方法，其特征在于：步骤(7)中，所用花多多肥料有两种，分别为含氮、磷、钾为30︰10︰10的花多多，以及含氮、磷、钾为20︰20︰20的花多多，两种花多多肥料交替使用。
10.如权利要求1所述的一种盖亚规模化无性繁殖种苗方法，其特征在于：步骤(7)中，种植2.5～4.0月后即可出货，出货前1～2周，光强增加到200～250mol·m-2·s-1，施肥频率一次/周。
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