CN111771722A - 一种藜麦纯种繁育的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种藜麦纯种繁育的方法。本发明提供了一种藜麦繁殖培养基,包括诱导培养基、增殖培养基和生根培养基;所述诱导培养基包括用于组培的基本培养基、6‑苄氨基腺嘌呤、激动素、水解酪蛋白和麦芽糖;所述增殖培养基包括用于组培的基本培养基、硝酸钾、磷酸二氢钠、6‑苄氨基腺嘌呤、激动素和麦芽糖;所述生根培养基包括用于组培的基本培养基、α‑萘乙酸和蔗糖。本发明的实验证明了本发明的方法实现了藜麦单一品种的快速大量繁殖,能够满足市场对藜麦纯种的大量需求,摆脱了藜麦种质资源逐年退化的限制。
Description
技术领域
本发明属于生物技术育种领域,涉及一种藜麦纯种繁育的方法,特别涉及一种利用组织培养快速繁殖单一基因型的藜麦育种技术。
背景技术
藜麦(Chenopodium quinoa)是一种拥有7000年历史的古老作物,原产于安第斯山脉,兴盛于印加文明,是一种耐寒耐旱的、能够适应于不能纬度和海拔的植物。其藜麦种子中的蛋白质含量高达14%,其中48%的氨基酸为人体必需氨基酸。联合国粮农组织(FAO)认为藜麦是唯一一种能够满足人体基本营养需求的单体植物。被誉为人类完美的“全营养品”、人类移民太空的“理想粮食”。
藜麦的人工杂交育种相对困难,而常规种每年有15%以上的异交率,1粒种子1种基因型,品种退化比较严重。利用植物组织培养技术,无性繁殖产生的植株,在遗传上才能与亲本植物完全相同,并且在无菌条件下的体培养能够在短期内获得大量脱毒植物。
发明内容
本发明一个目的是提供一种藜麦繁殖培养基。
本发明提供的藜麦繁殖培养基,包括诱导培养基、增殖培养基和生根培养基;
所述诱导培养基包括用于组培的基本培养基、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、激动素、水解酪蛋白和麦芽糖;
所述增殖培养基包括用于组培的基本培养基、硝酸钾、磷酸二氢钠、6-苄氨基腺嘌呤、激动素和麦芽糖;
所述生根培养基包括用于组培的基本培养基、α-萘乙酸和蔗糖。
上述培养基中,所述诱导培养基包括用于组培的基本培养基、0-5mg/L的6-BA、0-5mg/L的激动素、0-2g/L的水解酪蛋白和10-40g/L的麦芽糖;
所述增殖培养基包括用于组培的基本培养基、0-5g/L的硝酸钾、0-0.5g/L的磷酸二氢钠、0-0.5mg/L的6-BA、0-0.05mg/L的激动素和10-40g/L的麦芽糖;
所述生根培养基包括用于组培的基本培养基、0-5μM的α-萘乙酸和0-30g/L的蔗糖。
上述培养基中,所述诱导培养基包括用于组培的基本培养基、1mg/L的6-BA、1mg/L的激动素、1g/L的水解酪蛋白和30g/L的麦芽糖;
所述增殖培养基包括用于组培的基本培养基、2.7g/L的硝酸钾、0.315g/L的磷酸二氢钠、0.22mg/L的6-BA、0.018mg/L的激动素和30g/L的麦芽糖;
所述生根培养基包括用于组培的基本培养基、3μM的α-萘乙酸和15g/L的蔗糖。
上述各个培养基还包括凝固剂。
上述培养基中,所述用于组培的基本培养基为用于组培的液体基本培养基;
或,所述用于组培的基本培养基为MS培养基、B5培养基或1/2MS培养基。
上述的培养基在藜麦繁殖或扩繁中的应用也是本发明保护的范围。
上述培养基在提高藜麦繁殖系数中的应用也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供一种藜麦繁殖的方法。
本发明提供的方法,包括如下步骤:
1)将藜麦种子在上述诱导培养基进行诱导培养,得到丛生芽;
2)将所述丛生芽在上述增殖培养基进行增殖培养,得到增殖苗;其中所述丛生芽长度为2-6cm;
3)将所述增殖苗在上述生根培养基进行生根培养,得到生根苗,即实现藜麦纯种繁殖。
上述方法中,所述步骤3)后还包括如下步骤:将所述生根苗进行驯化移栽,实现藜麦繁殖。
上述方法中,步骤1)中,所述诱导培养为先将所述种子在所述诱导培养基中诱导培养,得到出侧芽的外植体;再将取带有单个侧芽的外植体段在所述诱导培养基中再次诱导培养,得到丛生芽;
或,所述再次诱导培养的次数为1-2次;每次再次诱导培养的对象为前一次再次诱导培养长出的丛生芽。每次诱导培养前所用的丛生芽长度为2-6cm。
上述方法中,步骤1)中,所述诱导培养的条件为:培养温度23-27℃,每天16h光照/8小时黑暗,培养光照强度5000-6000lx;
或,步骤2)中,所述增殖培养的条件为:培养温度23-27℃,每天16h光照/8小时黑暗,培养光照强度5000-6000lx;
或,步骤3)中,所述生根培养的条件为:培养温度23-27℃,每天16h光照/8小时黑暗,培养光照强度5000-6000lx。
解释说明:
1、本发明中出现在培养基之后的“+”(例如B5培养基+6-BA)表示该培养基(例如上述B5培养基)包含、包括或含有该“+”之后所列举的一种或多种物质(例如上述6-BA);例如“B5培养基+6-BA”指该B5培养基包含、包括或含有6-BA。本领域技术人员应当理解的是,本发明中的“B5培养基+6-BA+蔗糖+植物凝胶”指该MS培养基包含、包括或含有6-BA、蔗糖和植物凝胶。
2、在本发明中,6-BA是细胞分裂素6-卞氨基腺嘌呤的简称。
3、在本发明中,NAA是生长素类似物萘乙酸的简称。
4、在本发明中,“0.1%的H2SO4”中的0.1%是指质量体积百分比。
本发明提供一种快速获得大量均一藜麦单一基因型纯种的方法。随着藜麦育种的迫切需求,一套完整、快速的、适应于工厂化生产的纯种技术成为了急需解决的技术瓶颈。该方法能够周年育苗,不受季节和气候的限制。一般20-45天为一个周期,能够提供源源不断的材料来源。种苗均为脱毒无菌苗,品质均一可控,方便于后期田间管理,适用于现代化育苗的生产线管理。
与现有技术相比,本发明具有的优点如下:
(1)本发明的方法实现了藜麦单一品种的快速大量繁殖,能够满足市场对藜麦纯种的大量需求,摆脱了藜麦种质资源逐年退化的限制。
(2)在植物品种选择上,可适用于全部的藜麦基因型品种。
(3)在藜麦种植的方法上,常规的种子播种难免会有病毒的积累,但是快繁技术可以实现脱毒苗的获得。
(4)随着藜麦基因组测序的完成,这个生物胁迫和非生物胁迫极强抗性的植物,其遗传转化、基因编辑和分子育种技术已经在世界范围展开,而这些技术的基础就是快速高效的纯种繁育技术。本发明通过对藜麦进行组织培养,经过继代培养一次性获得了大量的植株幼苗,提高了藜麦的繁殖效率。
(5)时间短
选择无菌的藜麦种子为外植体,7天左右诱导出侧芽,14-20天诱导出第一代丛生芽,再过14-20天诱导出第二代丛生芽,再过7天增殖苗,再练苗3天,再移栽养护7天;一共培养60-80天就能够获得大量单一基因型出的苗子,扩繁时间短。
附图说明
图1为藜麦幼苗生长在诱导培养基上状态图。
图2为藜麦幼苗生长在增殖培养基上状态图。
图3为藜麦幼苗生长在生根培养基上状态图。
图4为生根后的藜麦幼苗生长在大棚中状态图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中陇藜1号,记载在如下文献中:杨发荣.藜麦新品种陇藜1号的选育及应用前景.甘肃农业科技,2015年第12期.公众可从天津吉诺沃生物科技有限公司获得。
下述实施例中陇藜3号,记载在如下文献中:梅丽,郭自军,王立臣,石春梅,周吉红,周继华,王俊英.15份藜麦资源在北京地区的生态适应性评价.中国农业大学学报,2019年第09期.公众可从天津吉诺沃生物科技有限公司获得。
下述实施例中台湾红藜记载在如下文献中:曹宁,高旭,丁延庆,程斌,陈天青,何庆才,张立异.藜麦组织培养快速繁殖体系建立研究.种子,2018年第10期.公众可从天津吉诺沃生物科技有限公司获得。
下述实施例中所用的MS基本培养基的溶剂为水,溶质及其浓度如表1所示。
下述实施例中所用的1/2的MS基本培养基为将表1所示的培养基中的各个溶质减半,溶于水,得到的培养基。
表1为MS基本培养基配方
大量元素 | 培养基中浓度(g·L<sup>-1</sup>) |
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub> | 1.65 |
KNO<sub>3</sub> | 1.9 |
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 0.17 |
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 0.37 |
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O | 0.44 |
微量元素 | 培养基中浓度(mg·L<sup>-1</sup>) |
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 27.8 |
Na<sub>2</sub>EDTA | 37.3 |
MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O | 22.3 |
ZnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O | 8.6 |
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub> | 6.2 |
KI | 0.83 |
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O | 0.25 |
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O | 0.025 |
CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O | 0.025 |
有机成分 | 培养基中浓度(mg·L<sup>-1</sup>) |
甘氨酸 | 2.0 |
盐酸硫胺素 | 0.1 |
盐酸吡哆素 | 0.5 |
烟酸VB5 | 0.5 |
肌醇 | 100 |
表2为B5基本培养基配方
大量元素 | 培养基中浓度(g·L<sup>-1</sup>) |
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> | 0.134 |
KNO<sub>3</sub> | 2.5 |
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O | 0.15 |
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 0.25 |
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O | 0.15 |
微量元素 | 培养基中浓度(mg·L<sup>-1</sup>) |
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 27.8 |
Na<sub>2</sub>EDTA | 37.3 |
MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O | 10 |
ZnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O | 2 |
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub> | 3 |
KI | 0.75 |
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O | 0.25 |
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O | 0.04 |
CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O | 0.025 |
有机成分 | 培养基中浓度(mg·L<sup>-1</sup>) |
盐酸硫胺素 | 10 |
盐酸吡哆素 | 1 |
烟酸VB5 | 1 |
肌醇 | 100 |
实施例1、藜麦纯种繁育所需培养基的制备
1、诱导培养基
诱导培养基为在MS基本培养基中添加终浓度为1mg/L的6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)、终浓度为1mg/L的KT(激动素)、终浓度为1g/L的水解酪蛋白(生工A100851),终浓度为30g/L的麦芽糖,用KOH调pH至5.8,再添加终浓度为8g/L的琼脂,121℃高压灭菌20min,制成固体培养基即为诱导培养基。
2、增殖培养基
增殖培养基(B5盐)为在B5基本培养基中添加终浓度为2.7g/L的硝酸钾,终浓度为0.315g/L的磷酸二氢钠,终浓度为0.22mg/L的6-BA,终浓度为0.018mg/L的KT,终浓度为30g/L的麦芽糖,用KOH调pH至5.8,再添加终浓度为8g/L的琼脂,121℃高压灭菌20min,制成固体培养基即为增殖培养基。
3、生根培养基
生根培养基为在1/2的MS基本培养基中添加终浓度为3μM的α-萘乙酸,15g/L的蔗糖,调pH至5.8,添加终浓度为8g/L的琼脂,121℃高压灭菌20min,制成固体培养基。
实施例2、藜麦纯种快速繁殖方法
1、外植体消毒
挑选干净健康饱满的台湾红藜的种子,先用酒精棉轻轻擦拭外植体表面的灰尘,再置于无菌玻璃瓶中,在超净工作台上用0.1%(质量体积比mg:ml)H2SO4水溶液和5%(质量体积比mg:ml)NaClO水溶液消毒;0.1%H2SO4水溶液消毒1min,5%NaClO水溶液消毒30min,无菌水冲洗4~5次,得到消毒后的种子。
2、诱导出芽
1)诱导出侧芽
将200粒上述1消毒后的种子(每粒种子进行标记,用于后期纯种苗的溯源)接种至装有25ml实施例1制备的诱导培养基的培养皿上进行诱导培养,待7天左右共得到出侧芽的181个外植体,诱导率为90.5%;
每个培养基中接入25粒种子。
2)诱导出丛生芽
将181个出侧芽的外植体,每个分别切成2cm的含有单个侧芽茎段,大约289个含有单个侧芽茎段,每25个含有单个侧芽茎段接种于装有25ml新鲜的诱导培养基的培养皿中进行继续诱导培养,直至长出丛生芽,记作第一代丛生芽(继续诱导培养长出丛生芽的培养时间大约14-20天),如图1中所示。
继续将每个第一代丛生芽切成2cm的丛生芽段,大约967个,每25个丛生芽段接种于装有25ml诱导培养基的培养皿中进行再次继续诱导培养,14-20天长出3182个第二代丛生芽。
如此循环往复,得到第n代丛生芽。
上述每次诱导培养条件如下:温度23-27℃,每天16h光照/8小时黑暗,光照强度5000~6000lx。
3、增殖培养
将上述2得到的3182个第二代丛生芽切成长度为2cm的丛生芽段,接种于增殖培养基(B5盐)中进行增殖培养,培养7天,得到2984株增殖苗。如图2所示。
上述增殖培养基配制15瓶,每瓶50ml增殖培养基,每瓶接种8个丛生芽段。
上述增殖培养的条件为培养温度23-27℃,光照时间16h/天(16h光照/8小时黑暗),光照强度5000~6000lx。
4、生根培养
将步骤3得到的2984株5cm左右的增殖苗接种到生根培养基上进行生根培养7天,得到2842株10cm左右的生根幼苗。如图3所示。
上述生根培养基配制5瓶,每瓶50ml生根培养基,每瓶接种12小株。
上述生根培养的条件为培养温度23-27℃,光照时间12h/天(16h光照/8小时黑暗),光照强度5000~6000lx。
检测生根率,生根率=(生根幼苗数/增殖苗数)100%
结果生根率均为95.2%左右。
5、驯化移栽
将步骤4得到的2842株生根率达到95%以上、根长1cm以上、形态健壮的生根幼苗进行驯化炼苗(罐装在2-5cm松树皮:蛭石=1:1的32穴盘中,加盖高度为19cm的透明盖子,暗处练苗3天),得到2773株炼苗后的幼苗;
再2773株炼苗后的幼苗取出放于平筛中,在清水下冲洗干净附着在根上的培养基,再将洗净的幼苗浸泡于0.5g/L多菌灵水溶液中10-50s,之后将幼苗移栽至移栽基质(将2-5cm消毒后的松树皮添加10g/L复合肥(奥绿肥1号)制备获得)中,再置于具有水帘风机温室中移栽养护7天,得到2643株藜麦纯种苗,如图4所示。
根据种子标记溯源,2643株藜麦纯种苗分别来源于181粒台湾红藜种子;平均每个种子扩繁得到14.6株藜麦纯种苗。
统计繁殖系数=藜麦纯种苗数量/出侧芽的种子数,本发明繁殖系数=2643/181=14.6倍。
实施例3、藜麦纯种快速繁殖方法中增殖培养基的选择
增殖培养基(MS盐):在MS基本培养基中添加终浓度为0.22mg/L的6-BA、终浓度为0.018mg/L的KT和终浓度为30g/L的麦芽糖,用KOH调pH至5.8,再添加终浓度为8g/L的琼脂,121℃高压灭菌20min,制成固体培养基即为增殖培养基(MS盐)。
按照实施例2的方法进行步骤1-3,得到增殖苗;其中仅将增殖培养中的增殖培养基(B5盐)替换为增殖培养基(MS盐)。
计算黄化率=(7天后增殖苗的黄化数/接种于增殖培养基的含有单个丛生芽的外植体段数)*100%
结果如下表3所示:采用增殖培养基(MS盐)得到的藜麦纯种苗黄化严重,不足以苗子快速生长。
表3不同基础盐的对藜麦幼苗增殖的影响
实施例4、藜麦纯种快速繁殖方法的广泛适用性
按照实施例2的方法,将陇藜1号和陇藜3号按实施例2的方法进行培养,得到不同品种的藜麦纯种苗。
200粒陇藜1号出侧芽的种子数为179粒,且得到的藜麦纯种苗数量为3186株。
200粒陇藜3号出侧芽的种子数为184粒,且得到的藜麦纯种苗数量为3956株。
统计繁殖系数=藜麦纯种苗数量/出侧芽的种子数;
陇藜1号的繁殖系数=3186/179=17.8倍;
陇藜3号的繁殖系数=3956/184=21.5倍。
Claims (10)
1.一种藜麦繁殖培养基,包括诱导培养基、增殖培养基和生根培养基;
所述诱导培养基包括用于组培的基本培养基、6-苄氨基腺嘌呤、激动素、水解酪蛋白和麦芽糖;
所述增殖培养基包括用于组培的基本培养基、硝酸钾、磷酸二氢钠、6-苄氨基腺嘌呤、激动素和麦芽糖;
所述生根培养基包括用于组培的基本培养基、α-萘乙酸和蔗糖。
2.根据权利要求1所述的培养基,其特征在于:
所述诱导培养基包括用于组培的基本培养基、0-5mg/L的6-BA、0-5mg/L的激动素、0-2g/L的水解酪蛋白和10-40g/L的麦芽糖;
所述增殖培养基包括用于组培的基本培养基、0-5g/L的硝酸钾、0-0.5g/L的磷酸二氢钠、0-0.5mg/L的6-BA、0-0.05mg/L的激动素和10-40g/L的麦芽糖;
所述生根培养基包括用于组培的基本培养基、0-5μM的α-萘乙酸和0-30g/L的蔗糖。
3.根据权利要求1或2所述的培养基,其特征在于:
所述诱导培养基包括用于组培的基本培养基、1mg/L的6-BA、1mg/L的激动素、1g/L的水解酪蛋白和30g/L的麦芽糖;
所述增殖培养基包括用于组培的基本培养基、2.7g/L的硝酸钾、0.315g/L的磷酸二氢钠、0.22mg/L的6-BA、0.018mg/L的激动素和30g/L的麦芽糖;
所述生根培养基包括用于组培的基本培养基、3μM的α-萘乙酸和15g/L的蔗糖。
4.根据权利要求1-3中任一所述的培养基,其特征在于:所述各个培养基还包括凝固剂。
5.根据权利要求1-4中任一所述的培养基,其特征在于:
所述用于组培的基本培养基为用于组培的液体基本培养基;
或,所述用于组培的基本培养基为MS培养基、B5培养基或1/2MS培养基。
6.权利要求1-5中任一所述的培养基在藜麦繁殖或扩繁中的应用;
或,权利要求1-5中任一所述的培养基在提高繁殖系数中的应用。
7.一种藜麦繁殖的方法,包括如下步骤:
1)将藜麦种子在权利要求1-5任一中所述诱导培养基进行诱导培养,得到丛生芽;
2)将所述丛生芽在权利要求1-5任一中所述增殖培养基进行增殖培养,得到增殖苗;
3)将所述增殖苗在权利要求1-5任一中所述生根培养基进行生根培养,得到生根苗,即实现藜麦纯种繁殖。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:所述步骤3)后还包括如下步骤:将所述生根苗进行驯化移栽,实现藜麦繁殖。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其特征在于:
步骤1)中,所述诱导培养为先将所述种子在所述诱导培养基中诱导培养,得到出侧芽的外植体;再取带有单个侧芽的外植体段在所述诱导培养基中再次诱导培养,得到丛生芽;
或,所述再次诱导培养的次数为1-2次;每次再次诱导培养的对象为前一次再次诱导培养长出的丛生芽。
10.根据权利要求7-9中任一所述的方法,其特征在于:
步骤1)中,所述诱导培养的条件为:培养温度23-27℃,每天16h光照/8小时黑暗,培养光照强度5000-6000lx;
或,步骤2)中,所述增殖培养的条件为:培养温度23-27℃,每天16h光照/8小时黑暗,培养光照强度5000-6000lx;
或,步骤3)中,所述生根培养的条件为:培养温度23-27℃,每天16h光照/8小时黑暗,培养光照强度5000-6000lx。
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曹宁等: "藜麦组织培养快速繁殖体系建立研究", 《种子》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN110199884A (zh) * | 2019-07-11 | 2019-09-06 | 云南农业大学 | 一种藜麦组培苗无菌条件下的结籽培育方法 |
CN110199884B (zh) * | 2019-07-11 | 2022-03-04 | 云南农业大学 | 一种藜麦组培苗无菌条件下的结籽培育方法 |
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