CN111759810B - 一种非诺贝特纳米冻干组合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种非诺贝特纳米冻干组合物及其制备方法。该制备方法包括：制备纳米混悬剂，将该混悬剂冷冻干燥。本发明提供的制备方法，无需预先将原料药进行微粉化处理，大大降低了实验所需耗能；本发明实验条件温和可控，制备时间短，大大缩短了生产周期；无需使用高压均质或机械研磨等方法，对设备要求较低，能耗低、不易出现碎屑污染；操作简单，重现性较好，成本低廉，易于实现工业化放大生产。本发明制备的纳米混悬液，混悬液中药物纳米粒粒径控制在150～350nm，溶出释放快，大大提高非诺贝特的胃肠道跨膜转运能力，促进非诺贝特的吸收。

Description

一种非诺贝特纳米冻干组合物的制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种难溶性药物非诺贝特纳米冻干组合物的制备方法，尤其涉及一种非诺贝特纳米冻干组合物的制备方法。
背景技术
非诺贝特(Fenofibrate；分子式：C20H21ClO4；分子量：360.83；化学名：2-甲基-2-[4-(4-氯苯甲酰基)苯氧基]丙酸异丙酯)。非诺贝特为第三代苯氧乙酸类调血脂药物，药理作用类同于氯贝丁酯，具有疗效好，不良反应较小等特点，临床上非诺贝特是降低甘油三酯的首选药物之一，同时还可以降低血尿酸水平，对II型糖尿病和代谢综合征的治疗也有较好作用，市场前景良好。
非诺贝特一般以口服给药，但由于其属于亲脂性化合物，几乎不溶于水，是生物药剂学分类系统中典型的II类药物(低溶解性，高渗透性)，其普通制剂溶出慢、口服生物利用度低，单次给药后4～7小时血药浓度才达到峰值(20～30μg/mL)，且一般需随餐服用以达到最佳效果。严重限制了其进一步的临床应用，因此需采取制剂技术来增加其溶解度、提高溶解速度，促进其在体内的吸收，制备出溶出快、生物利用度高、稳定性好的非诺贝特制剂。
研究表明，将难溶性药物制成纳米混悬剂时，其粒度达到纳米级别，药物颗粒依靠表面活性剂的电荷效应或(和)立体效应混悬在溶液中，可以增加其溶出速率和溶解度，从而提高制剂的生物利用度，减少用药剂量、降低毒副反应。但药物纳米混悬剂在储存过程中，药物易发生降解以及奥氏熟化(Ostwald ripening)，粒子团聚，进而导致粒径增大，为了保持药物纳米结晶的稳定性，通常将纳米混悬剂转化成固体形式。
目前，国内外已上市的非诺贝特剂型主要为胶囊和片剂，有调查显示，非诺贝特制剂在国内市场中以进口产品占绝对优势，法国Laboratories Fournier公司生产的Lipanthyl(力平之，微粉化非诺贝特胶囊)占据了国内约90％的市场份额。Lipanthyl主要采用微粉化技术，通过气流粉粹机将非诺贝特与少量表面活性剂混合在一起粉碎，得到微米级混合物，但是这种技术的成本高，且容易出现机械碎屑污染，并且提高生物利用度程度有限，大大限制了非诺贝特的推广使用。
至今为止，国内还没有纳米级的非诺贝特制剂上市，国外已上市的非诺贝特纳米制剂只有美国Abbott公司生产的Tricor和英国Skyepharma公司生产的Triglide。这两种已上市的非诺贝特纳米晶片剂所采用的NanoCrystals技术和DissocubesIDD-P技术均属于“Top-down”范畴。Top-down技术是指利用如研磨或均质等的机械力来减少药物粒径，主要包括湿法介质研磨和高压均质技术。但是这种技术存在制备成本非常高、制备时间长、产品黏附造成药物损失、且易出现机械碎屑造成产品污染等缺点，限制了非诺贝特纳米制剂的进一步推广使用。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种非诺贝特纳米冻干组合物的制备方法，通过以下步骤实现：
(1)非诺贝特纳米混悬剂的制备：非诺贝特的乙醇溶液为有机相，在低温搅拌条件下，将有机相迅速注入含稳定剂的水相中，得到混合溶液，混合溶液经高速剪切，即得非诺贝特纳米混悬剂。
(2)非诺贝特冻干组合物的制备：采用冷冻干燥法，向步骤(1)得到的纳米混悬液中加入冻干保护剂后，置于冷冻干燥机中进行冻干，即得非诺贝特纳米冻干组合物。
步骤(1)所述的搅拌条件为低温搅拌，温度控制在0～5℃，搅拌下迅速将有机相注入水相中，继续搅拌0～30s。
步骤(1)所述的高速剪切的速度为0～5000rpm/min，优选3000rpm/min；所述的高速剪切的时间为0～3min，优选1min。
步骤(1)所述的稳定剂为阴离子型表面活性剂，如羟丙甲基纤维素、十二烷基硫酸钠、去氧胆酸钠等，优选羟丙甲基纤维素与十二烷基硫酸钠联合使用。非诺贝特：羟丙甲基纤维素：十二烷基硫酸钠的质量比为4～1:1～4:1～4，优选4:1:1。
步骤(1)所述的纳米混悬剂中非诺贝特的浓度为1～10mg/mL，优选1～4mg/mL。
步骤(1)所述的纳米混悬剂中非诺贝特纳米粒平均粒径在150～350nm。
步骤(2)所述的冻干保护剂选用蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、甘氨酸、PEG4000、PEG 6000中的任意一种或几种，优选单独使用PEG 6000或甘氨酸。
本发明方法以溶剂扩散法为基础，使用阴离子型表面活性剂作为稳定剂，目的在于提供一种操作简单、成本低廉、重复性高、易于实现工业化放大生产的非诺贝特纳米混悬剂制备方法。通过加入常用的冻干保护剂，采用冷冻干燥法将纳米混悬剂转化成固体形式，提供长期稳定的一种非诺贝特纳米冻干组合物。
本发明提供的制备方法，无需预先将原料药进行微粉化处理，大大降低了实验所需耗能；本发明实验条件温和可控，制备时间短，大大缩短了生产周期；无需使用高压均质或机械研磨等方法，对设备要求较低，能耗低、不易出现碎屑污染；操作简单，重现性较好，成本低廉，易于实现工业化放大生产。本发明制备的纳米混悬液，溶出释放快，大大提高非诺贝特的胃肠道跨膜转运能力，促进非诺贝特的吸收。
附图说明
图1是非诺贝特纳米冻干粉与微粉化非诺贝特(市售力平之)的体外溶出曲线。
图2是不同给药浓度下的细胞存活曲线。
图3是非诺贝特原料药、市售力平之微粉及非诺贝特纳米冻干粉的跨膜药量百分比。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1改变温度、搅拌速度及搅拌时间制备纳米混悬液及粒径电位测定
(1)称取10mg非诺贝特，溶于1mL无水乙醇中，60℃水浴加热溶解形成有机相，约5℃冷水浴中将有机相迅速注入10mL水中，50rpm继续搅拌5秒，即得透明、有淡蓝色乳光的非诺贝特纳米混悬剂，非诺贝特浓度为1mg/mL，测得平均粒径为299nm(PDI＝0.134)，平均zeta电位趋于零。室温放置半小时后絮凝。
(2)称取10mg非诺贝特，溶于1mL无水乙醇中，60℃水浴加热溶解形成有机相，约5℃冷水浴中将有机相迅速注入10mL水中，100rpm继续搅拌5秒，即得透明、有淡蓝色乳光的非诺贝特纳米混悬剂，非诺贝特浓度为1mg/mL，测得平均粒径为310nm(PDI＝0.156)，室温放置半小时后絮凝。
(3)称取10mg非诺贝特，溶于1mL无水乙醇中，60℃水浴加热溶解形成有机相，约2℃冷水浴中将有机相迅速注入10mL水中，50rpm继续搅拌5秒，即得透明、有淡蓝色乳光的非诺贝特纳米混悬剂，非诺贝特浓度为1mg/mL，测得平均粒径为304nm(PDI＝0.178)，室温放置半小时后絮凝。
(4)称取10mg非诺贝特，溶于1mL无水乙醇中，60℃水浴加热溶解形成有机相，冰-水浴(约0℃)中下将有机相迅速注入10mL水中，50rpm继续搅拌约10秒，即得透明、有淡蓝色乳光的非诺贝特纳米混悬剂，非诺贝特浓度为1mg/mL，测得平均粒径为280nm(PDI＝0.098)，室温放置半小时后絮凝。
实施例二 增加高速剪切制备纳米混悬液及粒径电位测定
(1)称取10mg非诺贝特，溶于1mL无水乙醇中，60℃水浴加热溶解形成有机相，冰-水浴(约0℃)中下将有机相迅速注入10mL水中，50rpm继续搅拌约10秒，该混悬液转入高速剪切机，3000rpm剪切3min，得透明、有淡蓝色乳光的非诺贝特纳米混悬剂，非诺贝特浓度为1mg/mL，测得平均粒径为168nm(PDI＝0.098)，室温放置约1小时后絮凝。
(2)称取10mg非诺贝特，溶于1mL无水乙醇中，60℃水浴加热溶解形成有机相，冰-水浴(约0℃)中下将有机相迅速注入10mL水中，50rpm继续搅拌约10秒，该混悬液转入高速剪切机，3000rpm剪切1min，得透明、有淡蓝色乳光的非诺贝特纳米混悬剂，非诺贝特浓度为1mg/mL，测得平均粒径为154nm(PDI＝0.032)，室温放置约1小时后絮凝。
(3)称取10mg非诺贝特，溶于1mL无水乙醇中，60℃水浴加热溶解形成有机相，冰-水浴(约0℃)中下将有机相迅速注入10mL水中，50rpm继续搅拌约10秒，该混悬液转入高速剪切机，3000rpm剪切30s，得透明、有淡蓝色乳光的非诺贝特纳米混悬剂，非诺贝特浓度为1mg/mL，测得平均粒径为205nm(PDI＝0.145)，室温放置约1小时后絮凝。
(4)称取10mg非诺贝特，溶于1mL无水乙醇中，60℃水浴加热溶解形成有机相，冰-水浴(约0℃)中下将有机相迅速注入10mL水中，50rpm继续搅拌约10秒，该混悬液转入高速剪切机，5000rpm剪切1min，得透明、有淡蓝色乳光的非诺贝特纳米混悬剂，非诺贝特浓度为1mg/mL，测得平均粒径为184nm(PDI＝0.108)，室温放置约1小时后絮凝。
实施例三 增加水相稳定剂制备纳米混悬液及粒径电位测定
(1)称取10mg非诺贝特，溶于1mL无水乙醇中，60℃水浴加热溶解形成有机相，冰-水浴(约0℃)中下将有机相迅速注入10mL含药量400％HPMC-E5和400％SDS的水相中水中，50rpm继续搅拌约10秒，该混悬液转入高速剪切机，3000rpm剪切1min，得透明、有淡蓝色乳光的非诺贝特纳米混悬剂，非诺贝特浓度为1mg/mL，测得平均粒径为208nm(PDI＝0.210)，平均zeta电位为-10.1mV，室温放置可以稳定3小时，无明显絮凝现象。
(2)称取10mg非诺贝特，溶于1mL无水乙醇中，60℃水浴加热溶解形成有机相，冰-水浴(约0℃)中下将有机相迅速注入10mL含药量200％HPMC-E5和200％SDS的水相中水中，50rpm继续搅拌约10秒，该混悬液转入高速剪切机，3000rpm剪切1min，得透明、有淡蓝色乳光的非诺贝特纳米混悬剂，非诺贝特浓度为1mg/mL，测得平均粒径为184nm(PDI＝0.120)，平均zeta电位为-14.4mV，室温放置可以稳定3小时，无明显絮凝现象。
(3)称取10mg非诺贝特，溶于1mL无水乙醇中，60℃水浴加热溶解形成有机相，冰-水浴(约0℃)中下将有机相迅速注入10mL含药量100％HPMC-E5和100％SDS的水相中水中，50rpm继续搅拌约10秒，该混悬液转入高速剪切机，3000rpm剪切1min，得透明、有淡蓝色乳光的非诺贝特纳米混悬剂，非诺贝特浓度为1mg/mL，测得平均粒径为154nm(PDI＝0.032)，平均zeta电位为-18.2mV，室温放置可以稳定3小时，无明显絮凝现象。
(4)称取10mg非诺贝特，溶于1mL无水乙醇中，60℃水浴加热溶解形成有机相，冰-水浴(约0℃)中下将有机相迅速注入10mL含药量50％HPMC-E5和100％SDS的水相中水中，50rpm继续搅拌约10秒，该混悬液转入高速剪切机，3000rpm剪切1min，得透明、有淡蓝色乳光的非诺贝特纳米混悬剂，非诺贝特浓度为1mg/mL，测得平均粒径为168nm(PDI＝0.045)，平均zeta电位为-16.3mV，室温放置可以稳定3小时，无明显絮凝现象。
(5)称取10mg非诺贝特，溶于1mL无水乙醇中，60℃水浴加热溶解形成有机相，冰-水浴(约0℃)中下将有机相迅速注入10mL含药量100％HPMC-E5和50％SDS的水相中水中，50rpm继续搅拌约10秒，该混悬液转入高速剪切机，3000rpm剪切1min，得透明、有淡蓝色乳光的非诺贝特纳米混悬剂，非诺贝特浓度为1mg/mL，测得平均粒径为210nm(PDI＝0.046)，平均zeta电位为-10.8mV，纳米混悬剂在5小时内可以保持稳定，无明显絮凝.
(6)称取10mg非诺贝特，溶于1mL无水乙醇中，60℃水浴加热溶解形成有机相，冰-水浴(约0℃)中下将有机相迅速注入10mL含药量50％HPMC-E5和50％SDS的水相中水中，50rpm继续搅拌约10秒，该混悬液转入高速剪切机，3000rpm剪切1min，得透明、有淡蓝色乳光的非诺贝特纳米混悬剂，非诺贝特浓度为1mg/mL，测得平均粒径为167nm(PDI＝0.038)，平均zeta电位为-20.4mV，纳米混悬剂在5小时内可以保持稳定.
(7)称取10mg非诺贝特，溶于1mL无水乙醇中，60℃水浴加热溶解形成有机相，冰-水浴(约0℃)中搅拌下将有机相迅速注入10mL含药量25％HPMC-E5和25％SDS的水相中，50rpm继续搅拌约10秒，该混悬液转入高速剪切机，3000rpm剪切1min,即得透明、有淡蓝色乳光的非诺贝特纳米混悬剂，非诺贝特浓度为2mg/mL，测得平均粒径为182nm(PDI＝0.123)，平均zeta电位为-20.5mV，纳米混悬剂在5小时内保持稳定，所用稳定剂的量最少，药物比例最高。
实施例四 提高非诺贝特的浓度制备纳米混悬液及粒径电位测定实施例
(1)称取20mg非诺贝特，溶于1mL无水乙醇中，60℃水浴加热溶解形成有机相，冰-水浴(约0℃)中下将有机相迅速注入10mL含药量25％HPMC-E5和25％SDS的水相中水中，50rpm继续搅拌约10秒，该混悬液转入高速剪切机，3000rpm剪切1min，得透明、有淡蓝色乳光的非诺贝特纳米混悬剂，非诺贝特浓度为2mg/mL，测得平均粒径为178nm(PDI＝0.098)，平均zeta电位为-21.2mV。纳米混悬剂在5小时内保持稳定。
(2)称取40mg非诺贝特，溶于1mL无水乙醇中，60℃水浴加热溶解形成有机相，冰-水浴(约0℃)中下将有机相迅速注入10mL含药量25％HPMC-E5和25％SDS的水相中水中，50rpm继续搅拌约10秒，该混悬液转入高速剪切机，3000rpm剪切1min，得透明、有淡蓝色乳光的非诺贝特纳米混悬剂，非诺贝特浓度为4mg/mL，测得平均粒径为184nm(PDI＝0.118)，平均zeta电位为-27.4mV。纳米混悬剂在5小时内保持稳定。
(3)称取60mg非诺贝特，溶于1mL无水乙醇中，60℃水浴加热溶解形成有机相，冰-水浴(约0℃)中下将有机相迅速注入10mL含药量25％HPMC-E5和25％SDS的水相中水中，50rpm继续搅拌约10秒，该混悬液转入高速剪切机，3000rpm剪切1min，得透明、有淡蓝色乳光的非诺贝特纳米混悬剂，非诺贝特浓度为6mg/mL，测得平均粒径为324nm(PDI＝0.201)，平均zeta电位为-13.2mV，纳米混悬剂在3小时内保持稳定。
(4)称取100mg非诺贝特，溶于1mL无水乙醇中，60℃水浴加热溶解形成有机相，冰-水浴(约0℃)中下将有机相迅速注入10mL含药量25％HPMC-E5和25％SDS的水相中水中，50rpm继续搅拌约10秒，该混悬液转入高速剪切机，3000rpm剪切1min，得透明、有淡蓝色乳光的非诺贝特纳米混悬剂，非诺贝特浓度为10mg/mL，测得平均粒径为348nm(PDI＝0.224)，平均zeta电位为-18.5mV。纳米混悬剂在2小时内保持稳定，浓度越高，越容易絮凝。
实施例五 非诺贝特冻干粉的制备
(1)据实施例四的方法制备浓度为4mg/mL的非诺贝特纳米混悬液置于西林瓶中，加入冻干保护剂甘氨酸，溶解、混匀，使固体含量达到1％，置于-80℃冰箱中预冻12h后，于-46℃冷凝温度、13.0Pa真空度下进行冷冻干燥72小时，即得非诺贝特纳米冻干粉。冻干粉外观完整，无塌陷，表面光滑细腻。复溶再分散后粒度均匀。
(2)据实施例四的方法制备浓度为4mg/mL的非诺贝特纳米混悬液置于西林瓶中，加入冻干保护剂PEG6000，溶解、混匀，使固体含量达到1％，置于-80℃冰箱中预冻12h后，于-46℃冷凝温度、13.0Pa真空度下进行冷冻干燥72小时，即得非诺贝特纳米冻干粉。冻干粉外观完整，无塌陷，表面光滑细腻。复溶再分散后粒度均匀。
实施例六 非诺贝特冻干粉的体外溶出度测定
体外溶出度考察参照中国药典2010年版二部附录X C第一法，考察非诺贝特纳米冻干粉与微粉化非诺贝特(市售力平之胶囊)的体外溶出特性。溶出条件为：浆法，转速100r/min，溶出温度(37±0.5)℃，溶出介质为1％SDS溶液900mL。分别于5、10、15、20、30、45、60、120、180min等时间点取样5mL，同时补加等体积同温的溶出介质，样品经0.45μm微孔滤膜过滤，以1％SDS为空白介质，于最大紫外吸收波长处测定溶出药物含量，根据标准曲线计算药物累积溶出量及体外溶出度，非诺贝特溶出数据如表1所示，溶出曲线结果如图1所示。纳米冻干粉的溶出速度快于市售的微粉化非诺贝特制剂。
表1.非诺贝特纳米冻干粉与微粉化非诺贝特(市售力平之)的体外溶出数据
时间(min) 5 10 15 20 30 45 60 120 180
市售力平之(％) 73.5 81.0 82.7 83.7 84.8 85.9 86.9 89.5 90.6
纳米冻干粉(％) 80.6 88.0 89.9 90.6 94.0 95.3 96.4 98.6 100.3
实施例七 非诺贝特冻干粉的体外转运研究
药物在胃肠道的膜渗透能力是药物在体内吸收的重要因素之一，药物在体内的药代动力学特征很大程度取决于其在体内的跨膜转运过程。构建MDCK细胞单层模型来进行药物跨膜转运实验，以高效液相为检测方法，考察非诺贝特的跨膜转运能力，研究非诺贝特纳米粒的肠上皮细胞吸收。
首先采用MTT法考察非诺贝特纳米冻干粉对MDCK细胞的毒性，细胞毒性实验结果如图2所示。非诺贝特在40～300μg/mL浓度范围内对细胞毒性不大，细胞存活率均大于90％，所以非诺贝特的安全给药浓度范围为40～300μg/mL。
收集处于对数生长期的MDCK细胞，调整细胞悬液浓度，以5×104个每孔的密度将细胞接种于12孔Transwell板中，顶侧加入0.5mL细胞悬液，底侧加入1.5mL DMEM培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，从第二天开始每天换液，连续换液培养一周后，用HBSS溶液冲洗1遍，换上HBSS溶液继续培养30min，用Millicell-ERS跨膜电阻仪测定细胞单层跨膜电阻值(TEER)，每孔读数3次，根据TEER值确定细胞单层的完整性，选取TEER>140Ω/cm2的细胞单层用于转运实验。
单层细胞的顶侧加入0.5mL药物混悬液，底侧加入1.5mL HBSS溶液，设置原料药对照组、微粉化药物对照组(市售胶囊力平之)、自制纳米冻干粉组，每组平行给药4孔，置于培养箱中培养。分别于4h后从底侧吸取跨膜液500ul，经0.45μm微孔滤膜过滤后，按2.1.1项色谱条件进样，测定峰面积，根据标准曲线计算跨膜药量及跨膜药量百分比。跨膜转运实验结果如图3所示。非诺贝特原料药组由于其极低的溶解度，药物溶解少，导致其平均累积跨膜百分比几乎为零；非诺贝特纳米冻干粉组与市售力平之组的微粉化非诺贝特相比，因药物纳米化，粒径更小，溶解性增加，纳米冻干粉组的平均累积跨膜百分比是市售力平之微粉组的两倍多。

Claims (2)

1.一种制备非诺贝特纳米冻干组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）非诺贝特纳米混悬剂的制备：非诺贝特的乙醇溶液为有机相，在低温搅拌条件下，将有机相迅速注入含稳定剂的水相中，得到混合溶液；混合溶液经高速剪切，即得非诺贝特纳米混悬剂；
其中温度控制在0~5℃，搅拌下迅速将有机相注入水相中，继续搅拌5~30s；所述的稳定剂为羟丙甲基纤维素与十二烷基硫酸钠联合，其中非诺贝特：羟丙甲基纤维素：十二烷基硫酸钠的质量比为4~1:1~4:1~4；所述的高速剪切速度为3000rpm/min，时间为1min min；所述的纳米混悬剂中非诺贝特的浓度为1~4mg/mL；
（2）非诺贝特冻干组合物的制备：采用冷冻干燥法，向步骤(1)得到的纳米混悬液中加入冻干保护剂后，置于冷冻干燥机中进行冻干，即得非诺贝特纳米冻干组合物；所述的冻干保护剂为PEG 6000或甘氨酸；
其中步骤（1）所述的纳米混悬剂中非诺贝特纳米粒平均粒径在150~350nm。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：非诺贝特：羟丙甲基纤维素：十二烷基硫酸钠的质量比为4:1:1。
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