CN111757743A - 用于调节代谢的方法 - Google Patents

Abstract

提供了调节代谢的方法，其包括向有需要的对象提供包含含有式I的化合物的提取物的可消耗组合物的步骤，从而调节所述对象的代谢并解决诸如非酒精性脂肪肝疾病、非酒精性脂肪性肝炎和II型糖尿病等代谢病症的潜在发病机理。

Description

用于调节代谢的方法

引用

本申请要求2018年1月10日提交的美国临时申请第62/615,671号的优先权的权益，其内容通过援引以其整体并入本文。

背景技术

“西方饮食”与诸如肥胖、II型糖尿病(T2DM)、代谢综合征、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、心脏病和中风等代谢病症的全球性上升有关。诸如饮食和生活方式(特别是营养过剩和久坐行为)等遗传和环境因素之间的相互作用促进了这些多基因饮食相关疾病的进展和发病机制。他们目前的患病率正急剧上升到流行病的比例。营养可能是调节与代谢途径有关的基因的表达以及与肥胖、代谢综合征和II型糖尿病相关的多种表型的最重要的环境因素。此外，可以通过遗传变异来调节营养素的健康影响。

已提出蒺藜(Tribulus terrestris)的70％乙醇提取物通过抑制氧化应激在I型糖尿病模型(即，链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠)中提供保护作用(Amin等人(2006)Ann.NYAcad.Sci.1084:391-401)。

US 8,481,593和US 9,089,499公开了用于抑制人酪氨酸酶以及用于治疗过度色素沉着的局部用组合物和化妆品组合物中的对香豆酸衍生物如N-反式-阿魏酰酪胺(N-trans-feruloyltyramine)。

已提出将来自富含N-反式-阿魏酰酪胺的墨西哥菝葜(Smilaxaristolochiifolia)根的丙酮提取物可用于在与代谢综合征相关的损伤模型中消除某些症状(例如高甘油三酯血症、胰岛素抵抗、血压和炎症)(Amaro等人(2014)Molecules 19:11366-84)。

US 2008/0132544提出了来自胡椒(Piper nigrum)的分离的N-反式-阿魏酰酪胺在用于治疗内脏脂肪型肥胖症、T2DM、胰岛素抵抗综合征和代谢综合征的组合物中的使用。

发明内容

本发明提供了通过向有需要的对象提供可消耗组合物调节代谢的方法，所述可消耗组合物包含至少一种载体和有效量的提取物，所述提取物包含式I的化合物、或其异构体、盐、同二聚体、异二聚体或缀合物：

其中

R¹存在或不存在，并且当存在时是在一个或多个环原子上的取代基，并且对于每个环原子R¹独立地是羟基、卤素基团、取代或未取代的低级烷基、或者取代或未取代的低级烷氧基；并且

虚线键是存在或不存在。

在一些实施方案中，化合物具有式II的结构：

其中，R²存在或不存在，当存在时是羟基或甲氧基；R³存在或不存在、当存在时是羟基；并且R⁴存在或不存在，当存在时是羟基或甲氧基。

优选地，提取物是葱属(Allium)、辣根属(Amoracia)、藜属(Chenopodium)、荞麦属(Fagopyrum)、番荔枝属(Annona)、胡椒属(Piper)、画眉草属(Eragrostis)、玉蜀黍属(Zea)、大麻属(Cannabis)、甘薯属(Ipomea)、辣椒属(Capsicum)、枸杞属(Lycium)、茄属(Solanum)或蒺藜属(Tribulus)中的成员的乙醇提取物。在一些实施方案中、所述可消耗组合物被配制为膳食补充剂、食品成分或添加剂、医疗食品、保健品或药物组合物。理想地，有效量的所述组合物提供对HNF4α活性、胰岛素样生长因子水平、血糖水平、胰岛素水平、HbA1C水平、C肽水平、甘油三酯水平、游离脂肪酸水平、血尿酸水平、微量白蛋白尿水平、葡萄糖转运体表达、脂联素水平、总血清胆固醇水平、高密度脂蛋白水平、低密度脂蛋白水平或其组合的改善。在一些实施方案中，所述对象患有代谢病症或处于发展代谢病症的风险中，所述代谢病症例如是胰岛素抵抗、高血糖症、II型糖尿病、肥胖症、葡萄糖耐受不良、高胆固醇血症、高脂蛋白血症、血脂异常、高胰岛素血症、动脉粥样硬化疾病、冠状动脉疾病、代谢综合征或高血压。

附图说明

图1示出了在测量胰岛素启动子活性的测定中对N-反式-咖啡酰酪胺(N-transcaffeoyltyramine)、N-反式-阿魏酰酪胺和香豆酰酪胺的剂量反应分析。二甲亚砜(DMSO)和阿尔维林(20μM)分别用作阴性对照和阳性对照。

图2示出了通过定量PCR确定的N-反式-咖啡酰酪胺、N-反式-阿魏酰酪胺和对香豆酰酪胺对胰岛素mRNA水平的影响。DMSO和阿尔维林(20μM)分别用作阴性对照和阳性对照。

图3示出了通过定量PCR确定的N-反式-咖啡酰酪胺、N-反式-阿魏酰酪胺和对香豆酰酪胺对HNF4αmRNA水平的影响。DMSO和阿尔维林(20μM)分别用作阴性对照和阳性对照。

图4示出了通过已知的HNF4α拮抗剂BI-6015抑制N-反式-咖啡酰酪胺介导的胰岛素表达的增加。

图5示出了N-反式-咖啡酰酪胺和N-反式-阿魏酰酪胺对雌激素活性的影响。在存在(1μM)或不存在(0μM)他莫昔芬(Tam)下进行测定，使用阿尔维林和7005(CAS No.380336-90-3)(已知的HNF4α转录激活因子)作为阳性对照，顺式-阿魏酰酪胺和DMSO作为阴性对照。

图6证明N-反式-咖啡酰酪胺和N-反式-阿魏酰酪胺可以逆转脂肪积累。将T6PNE细胞用0.06mM、0.12mM或0.25mM的棕榈酸酯(palmitate)预处理1天，此时添加15μM的N-反式-咖啡酰酪胺或对照(DMSO)。在第3天、6天和8天收获细胞，并用尼罗红和油红O进行染色。结果表示为尼罗红染色的倍数变化：+棕榈酸酯/10％FBS培养基(无棕榈酸酯)。

图7示出了N-反式-咖啡酰酪胺增加肝中HNF4α的核表达。

图8示出了通过用N-反式-咖啡酰酪胺治疗减小了肝中脂滴的尺寸。

图9示出了用N-反式-咖啡酰酪胺或对照(DMSO)治疗的小鼠中包括碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸转氨酶(ALT)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、胆道闭锁(biliary artresia)、总胆红素、白蛋白、血尿素氮(尿素)和胆固醇在内的血液分析物的水平。

图10示出了饲喂高脂饮食并用N-反式-咖啡酰酪胺或对照(DMSO)治疗的小鼠的肝中的甘油三酯水平。

图11示出了与对照(DMSO)相比，N-反式-咖啡酰酪胺对饲喂高脂饮食的小鼠的胰腺中HNF4α表达的影响。

图12示出了与对照(DMSO)相比，N-反式-咖啡酰酪胺对饲喂高脂饮食的小鼠的肠中HNF4α表达的影响。

图13示出了来自各种来源的乙醇提取物中存在的N-反式-咖啡酰酪胺、N-反式-阿魏酰酪胺和p-香豆酰酪胺的量(提取物的％，重量/重量)，所述多种来源包括：蒺藜(Tribulus terrestris)种子(1)、大麻(Cannabis)(大麻(hemp))种子壳(2)、番荔枝属(Annona spp.)(杂交番荔枝(atemoya))种子(3)、刺果番荔枝(Annona muricata)(刺果番荔枝(Guanabana))种子(4)、毛叶番荔枝(A.cherimola)(毛叶番荔枝(Cherimoya))叶(5)、玉蜀黍(Zea mays)秆(6)、蒺藜(山羊头(Goat Head))种子(7)、毛叶番荔枝硬枝(树皮和芯)(8)、番茄(Solanum lycopersicum)研磨果渣(9)、马铃薯(S.tuberosum)(黄土豆(yellowpotato))皮(10)、胡椒(黑胡椒籽(black peppercorn))果实(11)、马铃薯(紫土豆(purplepotato))皮(12)、马铃薯(红土豆(red potato))皮(13)、番茄(S.lycopersicum)果渣(14)、番茄挤出的果渣(15)、刺果番荔枝(A.muricata)(刺果番荔枝(Guanabana))叶(16)、葱属植物大蒜(Allium sativum)(大蒜(garlic))球茎(17)、马铃薯(紫土豆)皮(18)、山刺番荔枝(A.montana)(山刺番荔枝(Mountain soursop))叶(19)、玉蜀黍(Z.mays)叶(20)、马铃薯(紫土豆)芽(21)、毛叶番荔枝(毛叶番荔枝(Cherimoya))种子(22)、葱(Alliumfistulosum)(青葱(green onion))全株(23)、马铃薯(白土豆(white potato))皮(24)、毛叶番荔枝(毛叶番荔枝(Cherimoya))绿枝(25)、大麻(大麻(hemp))叶(26)、马铃薯(白土豆)皮(27)、番茄种子(28)、番茄(牛番茄(Beefsteak))全果(29)、刺果番荔枝(刺果番荔枝(Guarabana))未成熟果实的皮(30)、刺果番荔枝(刺果番荔枝(Guanabana))成熟新鲜果实(31)、番荔枝(A.squamosa)(番荔枝(sweetsop))全果(32)、辣椒(Capsicum annuum)(塞拉诺辣椒(serrano pepper))果实(33)、马铃薯(褐色土豆(Russet potato))皮(34)、宁夏枸杞(Lycium barbarum)(枸杞/枸杞子(goji/wolf berry))果实(35)、马铃薯(紫土豆)芯(36)、藜麦(Chenopodium quinoa)(藜麦(quinoa))种子(37)、甘薯(Ipomoea batatas)(甘薯(sweet potato))整薯(38)、甘薯皮(39)、辣根(Armoracia rusticana)(辣根(horseradish))根(40)、马铃薯(科罗拉多土豆(Colorado potato))皮(41)、荞麦(Fagopyrum esculentum)(荞麦(buckwheat))壳(42)、尖椒(Capsicum frutescens)(葡萄牙霹雳辣椒(piri piri pepper))果实(43)、马铃薯(紫土豆)芯(44)、辣椒(C.annuum)(泰国椒(Thai chili))茎和叶(45)、刺果番荔枝(刺果番荔枝(Guanabana))未成熟果肉(46)、马铃薯(黄土豆)芯(47)和苔麸(Eragrostis tef)(苔麸(teff))种子(48)。

具体实施方案

本发明提供了含羟基肉桂酰胺的酪胺(tyramine)，其调节代谢，特别是HNF4α活性，从而缓解肝细胞和胰腺β-细胞二者中游离脂肪酸的不良反应。本发明的含羟基肉桂酰胺的酪胺是在对调节已知信号通路的试剂的传统筛选实验中鉴定出的先导化合物的类似物。如在T6PNE工程化的胰腺细胞中最初测定的，含羟基肉桂酰胺的酪胺展现出剂量反应的HNF4α活性，并上调胰岛素基因表达。此外，这些化合物在脂肪肝疾病的肝细胞(hepG2)脂质激发模型(challenge model)中显示出强的脂质清除活性。尽管不希望受到理论的束缚，但据信本发明的含羟基肉桂酰胺的酪胺调节HNF4α活性，这是因为其对HNF4α结合位点的亲和力高于天然配体棕榈酸，棕榈酸下调HNF4α的活性。遗传、功能基因组、转录组学和临床上的证据表明，HNF4α激动剂可以通过使身体保持糖和脂质的稳态来改善整体代谢健康。因此，本文的化合物用于促进和/或恢复健康的HNF4α功能，缓解游离脂肪酸的不良反应，调节代谢并解决诸如NAFLD、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和T2DM等代谢病症的潜在发病机理的方法中。使用本发明的组合物改善并提升了健康和幸福。

活性化合物

本发明提供了具有一个或多个与芳族芳烃连接的酸性羟基的植物来源的芳族代谢物，及其在调节代谢中的用途。在一个实施方案中，植物来源的芳族代谢物是化合物1的结构类似物：

特别地，本发明包含具有式I的结构的含羟基肉桂酰胺的酪胺、或其异构体、盐、同二聚体、异二聚体或缀合物：

其中

R¹存在或不存在，并且当存在时是在一个或多个环原子上(例如，2、3和/或4位)的取代基，并且对于每个环原子R¹独立地是羟基、卤素基团、取代或未取代的低级烷基、或者取代或未取代的低级烷氧基；并且

虚线键是存在或不存在。

对于本文的基团，以下带括号的下标进一步将基团定义如下：“(C_n)”定义基团中碳原子的确切数目(n)。例如，“C₁-C₆-烷基”表示具有1至6个碳原子(例如1、2、3、4、5或6个，或其中可衍生的任何范围(例如3-6个碳原子))的那些烷基。

术语“低级烷基”意指包含1至6个碳原子的支链或无支链的饱和一价烃基(即C₁-C₆-烷基)，如甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、丁基、正己基等。

类似地，低级烷氧基是具有结构-OR的C₁-C₆-烷氧基，其中R是如上进一步定义的“烷基”。具体的烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、1,2-二甲基丁氧基等。

本文使用的术语“卤代”是指氯(Cl)、氟(F)、溴(Br)和碘(I)基团。在特定的实施方案中，卤素基团是氟基团。

在本文所述的任何基团中，可用的氢可以被以下基团取代：烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、烷芳基、杂芳烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、烷基杂芳基、羟基、羟烷基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷氧基烷氧基、酰基、卤素、硝基、氰基、羧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、杂芳基磺酰基、烷硫基、芳硫基、杂芳硫基、芳烷硫基、杂芳烷硫基、环烷基、或杂环基。

在本申请中示出的结构的原子上的任何未定义化合价均暗含表示与该原子键合的氢原子。

在一些实施方案中，R¹存在并且优选代表在对位和间位的独立取代基。在特定的实施方案中，R¹存在并且代表在对位的羟基以及在间位的羟基或低级烷氧基。在某些实施方案中，具有式I的结构的含羟基肉桂酰胺的酪胺是反式构型。

在特定的实施方案中，含羟基肉桂酰胺的酪胺具有式II的结构：

其中，

R²存在或不存在，并且当存在时是羟基或甲氧基；

R³存在或不存在，并且当存在时是羟基；并且

R⁴存在或不存在，当存在时是羟基或甲氧基。

“异构体”尤其是指旋光异构体(例如，基本上纯的对映异构体、基本上纯的非对映异构体及其混合物)以及构象异构体(即，仅在其至少一个化学键的角度上不同的异构体)，位置异构体(特别是互变异构体)，以及几何异构体(例如，顺式-反式异构体)。

在某些实施方案中，含羟基肉桂酰胺的酪胺是以下化合物中的一种：

本公开内容的化合物的盐是指具有母体化合物的期望的药理活性的化合物，并且包括：(1)与无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成的酸加成盐；或与有机酸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羟乙基磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、黏康酸等形成的酸加成盐；或者(2)当母体化合物中存在的酸性质子被取代时形成的盐。

如本领域中已知的，同二聚体是由两个相同的包含羟肉桂酰胺亚基的酪胺组成的分子。相比之下，异二聚体是由两个不同的含羟基肉桂酰胺亚基的酪胺组成的分子。本发明的同二聚体的实例包括但不限于交联的N-反式-阿魏酰酪胺二聚体，交联的N-反式-咖啡酰酪胺二聚体和交联的对香豆酰酪胺二聚体。参见例如，King&Calhoun(2005)Phytochemistry66(20):2468-73，其教导了从马铃薯常见的疮痂病变(scab lesions)中分离出交联的N-反式-阿魏酰酪胺二聚体。含羟基肉桂酰胺的酪胺的单体和其他化合物(如木脂素酰胺)的缀合物。缀合物的实例包括但不限于大麻酰胺A、大麻酰胺B、大麻酰胺C、大麻酰胺D、大麻酰胺E和大麻酰胺F。

活性化合物的来源

本发明的化合物可以从已知具有式I的化合物的任何合适的植物物种和/或植物原料获得。优选地，所述化合物以包含所述化合物或基本上纯的化合物的提取物的形式提供。

“提取物”是指包含式I化合物的组合物，其与存在于从其中获得提取物的天然原料中的其他不需要的物质分离。在一些实施方案中，天然来源材料是植物。植物提取物可以从任何植物组织获得，包括整个植物；植物部分，如芽营养器官/结构(例如叶、茎和块茎)，根，花和花器官/结构(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)，种子(包括胚胎、胚乳和种皮)或果实(成熟子房)；植物组织(例如，维管组织、基本组织等)；细胞(例如，保卫细胞、卵细胞等)或渗出物，及其后代和培养物或细胞系。优选地，提取物包含将被发现对于人食用是公认安全(GRAS)的化合物。因此，在某些实施方案中，提取物来自可食用来源。在这方面，提取物是可食用提取物。

提取物可通过冷冻、研磨、浸软、粉碎、发酵、渗滤、煎煮、溶剂提取(例如分配)或沉淀、用活性炭处理、蒸发、过滤和/或对目标原料进行色谱分离来制备。在这方面，本发明的“提取物”可以是粗品、分馏的、亚分馏的、分离的、离析的(isolated)、富集的或纯化的，但不限于此。术语“粗品”是指尚未与存在其的原始组合物的组分完全分离的化合物或分子。在关于馏分或亚馏分的实施方案中，可以使粗提物中的分子进行部分分离以提供较少的含有其他物质的粗提物。在一些实施方案中，化合物是被离析的。术语“离析的”是指化合物或分子或分子相对于天然存在其的复杂细胞环境基本上被富集或纯化例如在粗提物中。当离析的分子被富集或纯化时，纯度的绝对水平不是关键的，并且本领域技术人员可以根据材料所要应用的用途容易地确定适当的纯度水平。在某些情况下，离析的分子形成组合物(例如或多或少的含有许多其他物质的粗提物)的一部分，其可以例如含有其他组分。在其他情况下，可以将离析的分子纯化至例如，如通过分光光度法、通过NMR或通过色谱(例如LC-MS)所测定的基本均质。

用于制备提取物的合适的溶剂包括，例如，正戊烷、己烷、丁烷、氯仿、二氯甲烷、二乙醚、乙腈、水、丁醇、异丙醇、乙醇、甲醇、冰醋酸、丙酮、诺氟烷(HFA134a)、乙酸乙酯、二甲亚砜、七氟丙烷(HFA227)和亚临界或超临界流体(如液态二氧化碳和水)或其任意比例的组合。当使用如上面列出的那些溶剂时，所得提取物通常包含非特异性脂溶性物质。可以通过各种方法将其去除，包括“冬化(winterization)”，其包括冷却至特定温度(通常地为-20℃)，随后过滤或离心去除蜡状压载物(ballast)，用亚临界或超临界二氧化碳或非极性溶剂(例如，己烷)提取，随后蒸馏。

通过色谱分馏法理想地获得富含本发明化合物的提取物。色谱分馏法通常包括柱色谱法，并且可以基于分子大小、电荷、溶解度和/或极性。取决于色谱方法的类型，可以使用基质材料进行柱色谱法，基质材料由例如葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、二氧化硅、C18、C8、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯乙烯、硅藻土和苯基-己基组成，并且可以包含溶剂，如二甲亚砜、吡啶、水、二甲基甲酰胺、甲醇、盐水、二氯乙烷、氯仿、丙醇、乙醇、异丁醇、甲酰胺、二氯甲烷、丁醇、乙腈、异丙醇、四氢呋喃、二噁烷、氯仿/二氯甲烷、甲醇、己烷和乙酸乙酯。

通常，将色谱步骤的产物以多个馏分进行收集，然后可以对其使用任何合适的分析技术(例如薄层色谱法、质谱法和紫外线吸收法)测试所需化合物的存在。然后可以选择富含所需化合物的馏分以进行进一步纯化。

作为替代方案，或与色谱法结合，可进行结晶以获得高纯度的含羟基肉桂酰胺的酪胺。通过改变温度和/或溶液的组成，例如通过去除乙醇，和/或调节pH以促进沉淀，随后将沉淀的晶体或油过滤或离心，来调节含羟基肉桂酰胺的酪胺的溶解度。其他合适的方法包括但不限于液-液萃取、离心分配色谱法或吸附到树脂上或用树脂去除杂质。

将化合物的“基本上纯的”的制剂定义为，如通过HPLC图谱的面积归一化确定的，制剂的(所需化合物的)色谱纯度大于95％，更优选大于96％，更优选大于97％，更优选大于98％，更优选大于99％，最优选大于99.5％。

术语“包含化合物的提取物”涵盖具有所需化合物的色谱纯度为至少2％，优选大于5％，更优选大于10％的制剂。与“基本上纯的”制剂相比，这种提取物通常将包含更大比例的杂质、非目标物质和其他分子。

在特定的实施方案中，“包含化合物的提取物”是“植物”产品或物质。在本文中，“植物”是指“包括植物材料、藻类、宏观真菌及其组合在内的产品”。植物药(botanicals)通过用于制备提取物(例如通过粉碎、煎煮、压榨(expression)、水提取和/或乙醇提取)并提供定量的一种或多种目标化合物的工艺步骤来定义。

理想地，本发明的化合物是从植物中提取和/或纯化的。示例性植物来源包括但不限于表1中所列的属类(genera)、科、目、属(genus)、种的植物。

表1

通过举例说明，通过研磨或粉碎蒺藜的干燥果实，使经粉碎的物质在室温下经受80％乙醇处理，过滤并浓缩该80％乙醇提取物，将经浓缩的提取物重悬于水中，用己烷分配该水溶液，向水层中添加氯仿，并使氯仿层进行用硅胶的液相色谱，从而获得含有N-反式-咖啡酰酪胺的提取物。参见例如，Ko等人(2015)Internatl.J.Mol.Med.36(4):1042-8。

可以使用常规技术如高效液相色谱法(HPLC)或高效薄层色谱法(HPTLC)将含有含羟基肉桂酰胺的酪胺的提取物标准化。术语“标准化提取物”是指通过鉴定提取物中存在的特征成分或生物活性标记而标准化的提取物。表征可以是例如通过分析诸如质谱(MS)、红外(IR)、紫外(UV)和核磁共振(NMR)光谱数据的频谱数据。

生物活性

化合物和/或提取物的生物活性可以使用以下更详细描述的一种或多种众所周知的生物体外测定、体内测定和动物模型来确定。这些测定的每一种都将提供对本发明化合物的活性的测量，以提供对与代谢病症有关的细胞终点的有益效果，所述代谢病症包括但不限于肥胖、T2DM、心脏病、中风、脂肪肝疾病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

培养的肝细胞中的甘油三酯测定。为了测量培养的原代肝细胞中的甘油三酯合成，在存在或不存在单不饱和脂肪酸和/或饱和脂肪酸(例如，棕榈酸酯(C16:0)或油酸酯(C18:1)，或两者的2:1混合物)，并且在存在或不存在本发明的提取物或化合物的情况下，将新鲜分离的肝细胞(例如，来自大鼠)用标准培养基(含0.25％牛血清白蛋白的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM))培养24小时。通过使用氯仿/甲醇(2:1)从细胞匀浆中提取肝脂质并使用ENZYCHROM^TM甘油三酯测定试剂盒(Bioassay Systems，Hayward，CA)进行甘油三酯质量的酶测定来进行肝甘油三酯积累的定量测定。

脂肪细胞葡萄糖消耗测定。在95％空气和5％CO₂的潮湿气氛中，于37℃下，在普通的D-葡萄糖、含10％胎牛血清(FBS)的DMEM、青霉素-链霉素中接种并培养等量(5x10⁵个细胞)的3T3-L1前脂肪细胞。当细胞达到100％融合时，通过用450mg/dL D-葡萄糖、0.32μM胰岛素、0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和1μM地塞米松处理培养物2天，诱导3T3-L1前脂肪细胞分化。随后，在有或没有施用本发明的化合物或提取物的情况下，将分化的脂肪细胞的培养基改变为含450mg/dL D-葡萄糖的DMEM。24小时后，使用胰岛素作为阳性对照通过测量培养基葡萄糖浓度来确定葡萄糖消耗活性。葡萄糖吸收进入细胞的方案和测定可商购获得(例如，ABCAM；Cambridge，MA；Promega：Madison，WI)。

胰岛素分泌活性。将胰岛素分泌细胞例如大鼠RIN-m5F细胞接种到96孔板中，并在孵育24小时后亚融合(subconfluence)时使用。将细胞暴露于100μl亚毒性浓度的本发明的化合物或提取物，并在37℃和5％CO₂下孵育3小时。处理后，将板以1000g离心10分钟，并使用固相两点酶免疫测定法例如DRG超灵敏大鼠胰岛素ELISA试剂盒(DRG International,Inc.)测定上清液的胰岛素浓度。

胰岛素启动子活性。在1μM他莫昔芬和0.03mM棕榈酸酯的存在下，将T6PNE细胞(Kiselyuk等人(2012)Chem.Biol.19(7):806-818；Kiselyuk等人(2010)J.Biomol.Screen15(6):663-70)以2000个细胞/孔接种在384孔组织培养板中。孵育24小时之后，将本发明的化合物或提取物添加至细胞。添加化合物或提取物四十八小时之后，将细胞固定在4％多聚甲醛中并用DAPI染色。对蓝色(DAPI)和绿色(驱动GFP的人胰岛素启动子)通道成像。

肝中甘油三酯测定。对小鼠提供本发明的化合物或提取物。通过在具有1mmol/LEDTA的0.25％蔗糖中进行均化制备肝提取物，并且使用氯仿/甲醇(2:1v/v)提取脂质，并用5％不含脂肪酸的牛血清白蛋白将其悬浮。使用甘油三酯测定试剂(Sigma Chemical Co.)测量甘油三酯水平。

体内肝甘油三酯分泌。该测定使用TRITON WR1339的用途，其抑制所有脂蛋白脂肪酶并因此抑制甘油三酯从血液中的清除(Millar等人，2005.J.Lipid Res.46:2023-2028)。对小鼠提供了本发明的化合物或提取物。随后，通过静脉内(IV)注射对小鼠注射了每只动物10％TRITON WR1339，并在0分钟、1小时和2小时收集血液以评估甘油三酯。分离血浆并测定甘油三酯。甘油三酯分泌率表示为以其肝重量归一化后的毫克每千克每小时。

脂肪从头合成(De Novo Lipogenesis)测定。脂肪从头合成被认为与NAFLD的发病机理有关(Sanders and Griffin.2016.Biol.Rev.Camb.Philos.Soc.91(2):452-468)。将来自用本发明化合物或提取物处理过的动物的原代肝细胞用含有胰岛素(100nM)和地塞米松(1μM)的10％DMEM培养过夜。随后将细胞与74KBq/ml(2-14℃)乙酸钠(2.07GBq/mmol)孵育1小时。将细胞用1N NaOH裂解、酸化、并用石油醚提取脂质。通过液体闪烁计数器测量放射性。

T2DM的动物模型。T2DM的模型包括但不限于瘦素缺乏型小鼠(ob/ob；Drel等人(2006)Diabetes 55(12):3335-43；Curr.Diabetes Rev.10(2):131-145)，Wang等人(2014)瘦素受体缺乏型小鼠(db/db；Wang等人(2014)Curr.Diabetes Rev.10(2):131-145)、肥胖Zucker大鼠(fa/fa；Shiota&Printz(2012)Methods Mol.Biol.933:103-23)、Wistar Kyoto大鼠(fa/fa；Figlewicz等人(1986)Peptides 7:61-65)、阿黑皮素原缺乏型小鼠(POMC^-/-；Yaswen等人(1999)Nat.Med.5:1066-1070)、黑皮质素3和4受体敲除动物(Huszar等人(1997)Cell 88:131-141；Butler等人(2000)Endocrinology 141(9):3518-21；Mul等人(2011)Obesity(Silver Spring)20(3):612-21；Chen等人(2000)Nat.Genet.26(1):97-102)、过表达葡萄糖转运体亚型4的动物(Shepard等人(1993)J.Biol.Chem.268:22243-22246)和神经元特异性胰岛素受体敲除小鼠(NIRKO小鼠；Bruning等人(2000)Science289:2122-2125)。使用这类动物模型的综述是可获得的(例如，Chatzigeorgiou等人2009.In Vivo 28:345-258；King，A.J.K.2012.Br.J.Pharmacol.166:877-894)。这些模型的特征是胰岛素抵抗、高血糖症和高胰岛素血症，这是人T2DM中反映的症状。对动物提供本发明的化合物或提取物并评估最大耐受剂量和代谢改善。

脂肪营养不良的动物模型。完全缺乏脂肪组织(脂肪营养不良)导致与严重肥胖症相似的代谢变化，并且与胰岛素抵抗相关。缺乏脂肪组织的基因修饰小鼠的特征是摄食过量、肝脂肪变性、高甘油三酯血症、胰岛素抵抗和T2DM(Savage(2009)Dis.Model Mech.2(1112):554 62)。由于缺乏功能性脂肪组织，这些小鼠是瘦素缺乏的，具有评价本发明的化合物或提取物对代谢失调的影响的用途。此类模型可用于证明对于本发明化合物的体内反应并探索如剂量反应等关键概念。

饮食诱导肥胖的大鼠模型。已将远交系SD大鼠用作肥胖的多基因模型(Levin等人(1997)Am.J.Physiol.273:R725-30)。同样，给大鼠提供了多种美味的饮食，模仿了所谓的西方人饮食(自助饮食)，大鼠由于摄食过量而变得肥胖(Rogers&Blundell(1984)Neurosci.Biobehav.Rev.8(4):441-53)。同样，暴露于高脂(HF)饮食的动物也发展肥胖，并且表现出胰岛素和瘦素敏感性降低(Clegg等人(2011)Physiol.Behav.103(1):10-6；Hariri&Thibault(2010)Nutr.Res.Rev.23(2):270-99)。此类模型可用于证明对于本发明化合物的体内反应并探索如剂量反应等关键概念。

饮食诱导肥胖的小鼠模型。饮食诱导肥胖(DIO)小鼠是研究体内脂毒性的标准(Kennedy等人(2010)Disease Models&Mechanisms 3(3-4):156-66)。高脂饲喂的小鼠在肝和胰腺二者中均出现异常。取决于遗传背景，在高脂饮食下，它们会发展成胰岛素抵抗，伴有或不伴有β-细胞萎缩和明显的糖尿病(Leiter&Reifsnyder(2004)Diabetes 53Suppl.1:S4-11；Tschop&Heiman(2001)Exp.Clin.Endocrinol.Diabetes 109(6):307-19)。在倾向于发展出β-细胞萎缩方面不同的小鼠品种包括例如发展出β-细胞萎缩的NONcNZ010/LtJ(The Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)以及没有表现出β-细胞损失的C57BL/6J(The Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)。使用这些模型，可以分析正常饮食相对于高脂饮食±测试化合物的影响。在高脂饮食下，大约一半的NONcNZ0l0/LtJ雄性小鼠患上了糖尿病并且通常发展出胰岛萎缩(Leiter(2009)Methods Mol.Biol.560:1-17)。可以研究的其他品种包括C57Bl/6背景下的DIO小鼠，其不太倾向于β-细胞损失，但却是伴随血糖升高和糖耐量受损的T2D前期和肥胖症的好模型(Leiter(2009)MethodsMol.Biol.560:1-17)。C57Bl/6KsJ db/db小鼠发展出与β-细胞衰竭相关的糖尿病(Hummel等人(1972)Biochem.Genet.7(1):1-13)，已经显示出其可以通过MafA过表达纠正(Matsuoka等人(2015)J.Biol.Chem.290:7647-7657)，这表明它们在疗效试验中的用途。此类模型可用于证明对于本发明化合物的体内反应并探索如剂量反应等关键概念。

代谢综合征的动物模型。新西兰肥胖(NZO)小鼠是肥胖的并且患有严重的T2DM。在NZO小鼠中已经发现了许多有助于肥胖和高血糖发展的遗传易感基因座。除瘦素受体基因外，转录因子的几个基因被鉴定为潜在的候选基因，其中这些基因中的一些的直系同源与人代谢综合征有关(Joost(2010)Results Probl.Cell Differ.52():1-11)。此类模型可用于证明对于本发明化合物的体内反应并探索如剂量反应等关键概念。

反筛选(Counter Screens)。反筛选通常用于在化合物库中进行选择，以避免脱靶效应。在本发明中，即使可能发生其他脱靶效应，作为HNF4α活性调节剂的化合物的活性也是期望的靶标。基于除HNF4α以外的靶标效应的已销售用于人的药物随后被证实具有作为HNF4α激活剂的活性(Alverine and Benfluorex；Lee等人(2013)ACS Chem.Biol.8(8):1730-6)。阿尔维林已作为胃肠病的平滑肌松弛剂销售，而苯氟雷司作为厌食剂销售。已知苯氟雷司可通过将酯部分裂解为芬氟拉明来代谢，芬氟拉明是血清素5-羟色胺2(5-HT₂)受体的强效激动剂，其作用被认为与其作为厌食剂的活性有关(Porter等人(1999)Br.J.Pharmacol.128(1):13-20)。然而，苯氟雷司对5-HT₂受体的调节与不良的心肺副作用有关。因此，基于这些合成化合物的经验，将使用例如萦光成像板读取器(FLIPR)测定法测试本发明的化合物和提取物对5-羟色胺受体活化的脱靶效应，该测定法能够快速检测CHO-K1细胞中表达人5-HT_2A、5-HT_2B或5-HT_2c受体的细胞中细胞内钙水平的升高。参见例如，Porter等人(1999)Br.J.Pharmacol.128(1):13-20。可以基于最初的研究来选择其他反筛选，其中毒性作用可能与其他脱靶作用有关。

制剂

可以将基本上纯的化合物或包含本发明化合物的提取物与载体组合，并以任何合适的形式提供，以供对象消耗或施用于对象。在这方面，将化合物或提取物作为外源成分或添加剂添加到消耗品中。合适的消耗形式包括但不限于膳食补充剂、食品成分或添加剂、医疗食品、保健品或药物组合物。

食品成分或添加剂是旨在直接或间接导致其成为任何食品的成分的或影响任何食品的特性的可食用物质(包括旨在用于生产、制造、封装、加工、制备、处理、包装、运输或盛装食物的任何物质)。食品，特别是功能食品，是在加工过程中被强化或浓缩以包含另外的补充营养素和/或有益成分的食品。根据本发明的食品可以是以下形式，例如黄油、人造黄油、甜酱或咸酱、调味品、饼干、健康棒(health bar)、面包、蛋糕、谷物、糖果、甜食(confectionery)、汤、牛奶、酸奶或发酵的奶制品、奶酪、基于果汁和基于蔬菜的饮料、发酵饮料、奶昔、调味水、茶、油或任何其他合适的食物。

膳食补充剂是经口摄取的产品，其包含本发明的化合物或提取物，并且旨在补充饮食。保健品是源自食物来源的产品，除了在食品中发现的基本营养价值外，还提供了额外的健康益处。药物组合物被定义为旨在在疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防中提供药理活性或其他直接影响的，或者旨在影响人或其他动物的身体的结构或任何功能的药品的任何成分。可以发现膳食补充剂、保健品和药物组合物的很多形式，如片剂、包衣片剂、丸剂、胶囊、微丸剂、颗粒剂、软胶囊、软明胶胶囊、液体、粉剂、乳剂、混悬剂、酏剂、糖浆和任何其他适合使用的形式。

如本文所用，术语“载体”意指材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸)或溶剂包封材料，其参与将主题化合物从身体的一个器官或部分携带或运输到身体的另一器官或部分。每种载体应与制剂的其他成分相容，并且对对象无害。可以用作载体的材料的一些实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、醋酸纤维素和羟基丙基甲基纤维素；(4)粉状黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；以及(22)常规制剂中使用的其他无毒相容性物质。

为了制备固体组合物，如片剂或胶囊，将化合物或提取物与载体(例如，常规的压片成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)以及其他稀释剂(例如，水)混合以形成固体组合物。然后将该固体组合物细分为含有有效量的本发明化合物的单位剂型。可以将含有化合物或提取物的片剂或丸剂包衣或以其他方式复合以提供剂型，该剂型提供了延长的作用的优点。

在本发明的特定的实施方案中，可消耗组合物包含所述化合物或提取物、载体和用于降低或延迟微生物生长的防腐剂。防腐剂以至多膜重量的约5％，优选约0.01％至1％的量添加。优选的防腐剂包括苯甲酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、亚硝酸钠、二氧化硫、山梨酸钠和山梨酸钾。其他合适的防腐剂包括但不限于乙二胺四乙酸盐(也称为乙二胺四乙酸或EDTA的盐，如EDTA二钠)。

掺入本发明化合物或提取物的用于口服或肠胃外施用的液体形式包括水溶液、适当调味的糖浆、水性悬浮液或油悬浮液和具有可食用油的调味乳液以及酏剂和类似的媒介物。用于水性悬浮液的合适的分散剂或悬浮剂包括合成的天然树胶、如黄芪胶、阿拉伯树胶、藻酸盐、右旋糖酐、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或明胶。用于口服的液体制剂可以采取例如溶液剂、糖浆剂或混悬剂的形式、或者它们可以以干燥产品的形式存在，以在使用前用水或其他合适的媒介物重构。这样的液体制剂可以使用可接受的添加剂通过常规方式制备，所述可接受的添加剂例如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、甲基纤维素或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水性媒介物(例如，杏仁油、油酯或乙醇)；防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)；以及人造或天然色素和/或甜味剂。

制备本发明的制剂或组合物的方法包括使本发明的化合物或提取物与载体和任选的一种或多种辅料和/或活性成分结合的步骤。通常，通过将本发明的化合物或提取物与液体载体或细分的固体载体或两者均匀且紧密地结合，然后如果需要，将产品成型，来制备制剂。因此，所公开的制剂可以由或基本上由本文所述的化合物或提取物与合适的载体组合组成。

当本发明的化合物或提取物作为药物、保健品或膳食补充剂施用至人和动物时，它们可以本身或作为含有与可接受的载体组合的例如0.1％至99％(更优选10％至30％)的活性成分的组合物被给予。

可以被对象消耗的可消耗产品提供每天少于100mg的本文公开的化合物。在某些实施方案中，消耗品提供10mg/天至60mg/天的含羟基肉桂酰胺的酪胺。有效量可以通过本领域研究中已知的方法来确定并取决于生物利用度、毒性等。

尽管可以预期在本发明的消耗品中可以使用单独的含羟基肉桂酰胺的酪胺，但是可以进一步考虑的是，可以以任何相对量将两种或更多种化合物或提取物组合以产生包含所需比例的两种或更多种含羟基肉桂酰胺的酪胺的成分的定制组合，以增强产品功效、改善感官特性或对产品最终使用重要的一些其他质量量度。

分子靶标

HNF4α(肝细胞核因子4α)是一种全局核转录因子，调节许多与维持平衡代谢(稳态)有关的基因的表达。值得注意的是，HNF4α在肝(肝细胞)和胰腺(β-细胞)中均表达。在人肝细胞和人胰腺β-细胞中，HNF4α在NAFLD和T2DM中的表达和转录活性均降低。HNF4α在糖尿病的常染色体显性单基因形式MODY1中发生突变，为在糖尿病发病机制中的直接作用提供了人类遗传证据。HNF4α基因表达在T2D中被下调。另外，在超重和肥胖个体中升高的游离脂肪酸抑制HNF4α活性。鉴于HNF4α单纯性不足导致糖尿病并且HNF4α在T2D中被下调的事实，将HNF4α活性恢复或增加至正常野生型状态将提供整体的健康和治疗益处。

HNF4α敲除的啮齿动物模型表现出脂肪肝表型，以及降低的脂肪生成，降低的胆固醇从头合成，降低的超低密度脂蛋白(VLDL)分泌和高密度脂蛋白(HDL)生物生成(biogenesis)以及增加的胰岛素耐受不良。另外，敲除的小鼠显示出提高的FFA摄取和降低的经由β-氧化的降解。这会导致低胆固醇血症、低的血液甘油三酯水平和肝脂肪变性。所有这些都代表由HNF4α缺乏导致的脂质代谢的严重失调(Yin等人(2011))ArteriosclerThromb.Vase.Biol.31(2)：328-336；Hayhurst等人(2001)Mol.Cell Biol.21(4)1393-1403；Martinez-Jimenez(2010)Mol.Cell.Biol.30(3)；565-577)。相比之下，HNF4α在肝中的增加表达可能会增加促进肝FFA氧化、生酮作用(ketogenesis)和超低密度脂蛋白(VLDL)分泌的基因的转录，作为应对过度FFA积累的一种手段(Martinez-Jimenez(2010)Mol.Cell.Biol.30(3):565-577)。因此，HNF4α为缓解在NAFLD中典型升高的FFA的不良反应提供了靶标。

在T2DM中，HNF4α负责直接调节涉及葡萄糖转运和糖酵解的基因。在β-细胞中没有HNF4α的情况下，啮齿动物表现出在β-细胞中葡萄糖刺激的胰岛素分泌不足，这意味着胰岛素分泌降低(Gupta等人(2005)J.Clin.Invest.115(4)1006-15)。已经观察到具有T2DM个体中HNF4α基因表达下调，这可能是由于暴露于慢性升高的FFA引起的。特别地，已经显示出游离棕榈酸(C16饱和FA)损害胰腺β-细胞功能和生存能力，并由于对HNF4α的作用而抑制正常的胰岛素产生(Lee等人(2013)ACS Chem.Biol.8(8):1730-1736)。因此，HNF4α提供了减轻T2DM症状的靶标。

代谢病症

术语“代谢病症”是指当身体不能适当地代谢碳水化合物、脂质、蛋白质和/或核酸时发生的病症或病况。因此，在本发明的上下文中，与代谢异常有关的病症包括在术语“代谢病症”中。术语代谢病症包括但不限于胰岛素抵抗、高血糖症、糖尿病(特别是T2DM)、肥胖症、葡萄糖耐受不良、高胆固醇血症、高脂蛋白血症、血脂异常、高胰岛素血症、动脉粥样硬化疾病、冠状动脉疾病、代谢综合征、高血压、或与异常的血浆脂蛋白、甘油三酯有关的相关病症或者与葡萄糖水平相关的病症(如胰岛β-细胞再生)。

T2DM是指慢性疾病或病况，其发生在胰腺无法产生足够的胰岛素或身体不能有效使用其产生的胰岛素时。这导致血液中葡萄糖的浓度增加(高血糖症)。基于已经建立的血浆葡萄糖浓度、血糖暴露量度与糖尿病性视网膜病变风险之间关系的研究，已采用以下标准诊断糖尿病：空腹血浆葡萄糖大于或等于126mg/dL(7.0mmol/L)；在口服葡萄糖耐量试验中摄入75g无水葡萄糖后2小时，血浆葡萄糖大于或等于200mg/dL(11.1mmol/L)；或具有糖尿病症状的人的随机血浆葡萄糖大于200mg/dL(11.1mmol/L)。其他重要的定义包括：口服葡萄糖耐量试验中2小时血浆葡萄糖等于或大于140mg/dL(7.8mmol/L)但小于200mg/dL(11.1mmol/L)的糖耐量受损；空腹血浆葡萄糖(FPG)等于或大于100mg/dL(5.6mmol/L)但小于126mg/dL的空腹血糖受损。据信本发明的化合物或提取物通过将空腹血浆葡萄糖、摄入75g无水葡萄糖后的血浆葡萄糖或随机血浆葡萄糖水平中的一种或多种降低至低于本文所参考的那些标准来调节代谢。可以作为代谢活动评价的一部分被监测的另一个终点是HbA1C的血液水平；HbA1c是过去两到三个月内血液中平均葡萄糖水平的量度。HbA1c的水平被用作糖尿病风险的临床指标，其中水平升高表明T2DM的风险增加。因此，HbA1c的降低也可用于支持血糖控制的指示。

肥胖是一种慢性、复发性的健康风险，其定义为体脂过多。可以使用水下称重法和双能X射线吸收法(DEXA)准确测量总体脂。由于以千克体重除以身高的平方米(kg/m²)表示的体重指数(BMI)，计算起来既简单又便宜，并且与非老年人的总体脂有很强的相关性，因此其通常用作总体脂的替代。美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)将肥胖定义为BMI为30kg/m²或更高。BMI与死亡风险和主要合并症之间的关系随年龄、性别、种族和吸烟状况变化，但总体而言，在BMI为18.5kg/m²至24.9kg/m²的个体中最低，并且BMI为25kg/m²至大约40kg/m²时以曲线或线性方式增加。据信本发明的化合物或提取物通过降低平均和/或分类体重来调节代谢。平均体重定义为活性物质治疗组与安慰剂治疗组中基线体重的平均百分比减少上的差异。分类体重定义为在活性产品治疗组与安慰剂治疗组中损失至少5％的基线体重的对象的比例。次要疗效终点包括但不限于血压和脉搏、脂蛋白脂质、空腹血糖和胰岛素、HbA1c(在T2DM中)、腰围和生活质量上的改善。

NAFLD或“脂肪肝”是一种代谢性疾病，其特征是脂肪在肝中的过度积累。NAFLD的特征是主要为大泡性脂肪变性，在>5％的肝细胞中存在可见脂肪变性通常被认为是脂肪肝的惯用定义(Kleiner等人(2005)Hepatology 41:1313-1321)。非酒精性脂肪性肝炎或NASH是NAFLD的最极端形式，被认为是病因不明的肝硬化的主要原因。诊断NASH的最低标准包括存在>5％的大泡性脂肪变性、炎症和肝细胞膨胀，通常在成年人中主要在小叶中心(腺泡3区)分布。脂肪性肝炎不仅是存在炎症和脂肪变性，而且是特定的组织学实体(Kleiner等人(2005)Hepatology 41(6):1313-21；Brunt等人(1999)Am.J.Gastroenterol.94:2467-2474；Ludwig等人(1980)Mayo Clin.Proc.55:434-438；Neuschwander-Tetri&Caldwell(2003)Hepatology 37:1202-1219)。据信本发明的化合物或提取物通过可测定地降低肝中脂肪的积累从而改善肝功能来调节新陈代谢。

术语代谢综合征表示作为患冠心病、中风、周围血管疾病和/或T2DM的风险增加的标志的一系列实验室和临床发现。与代谢综合征相关的风险因素包括腹部肥胖(即腹部及周围有过多的脂肪组织)，动脉粥样硬化血脂异常，包括但不限于高甘油三酯、低HDL胆固醇和高LDL胆固醇、血压升高、胰岛素抵抗或葡萄糖耐受不良，血栓前状态(例如，血液中高的纤维蛋白原或纤溶酶原激活抑制剂1)，和/或促炎状态(例如血液中升高的C反应蛋白)。据信本发明的化合物或提取物通过改善代谢综合征的组成来调节代谢，并最终显示出预防T2DM的发展并降低心血管的发病率和死亡率。

代谢调节

本发明还提供了用于调节代谢以减轻、预防或治疗代谢病症的方法。根据这样的方法，向需要治疗的对象施用有效量的本发明的化合物或提取物，以调节对象的代谢，从而解决一种或多种代谢病症的潜在发病机理并促进对象的健康、幸福和生活质量。如本文所用，术语“对象”是指动物，优选哺乳动物。在一些实施方案中，对象是兽医的动物、伴侣动物、农场动物、实验室动物或动物园动物。在其他实施方案中，对象是人。

需要治疗的对象包括具有可观察到的代谢病症症状的对象(例如，具有异常葡萄糖或脂质代谢的对象)，以及没有可观察到的代谢病症症状但已经确定易发展为代谢病症的对象(即，有发展为代谢病症的风险的对象)。例如，根据美国心脏协会(American HeartAssociation)，当出现以下五种风险因素中的任何三种时，则诊断出代谢综合征(其增加心脏病、糖尿病、中风和其他健康问题的风险)：高血葡萄糖(糖)；血液中低水平的HDL(“好”)胆固醇；血液中高水平的甘油三酯；大腰围或“苹果形”身材；或高血压。

通过进一步说明，对胰岛素的自身抗体(IAA)、谷氨酸脱羧酶(GAD)和称为IA-2的酪氨酸磷酸酯家族的受体类型的胰岛细胞成员已被鉴定为T2DM临床发作之前的标志物。参见，例如，US 6,391,651和US 6,316,209。类似地，C-反应蛋白(CRP)、载脂蛋白CIII和血浆同型半胱氨酸水平已被鉴定为用于鉴定对象处于高胆固醇风险(或高胆固醇血症或高脂血症)的标志物，参见，例如，US 2004/0198656；Yeh(2004)Can.J.Cardiol.20(增刊B):93-96B；和Geisel等人(2003)Clin.Chem.Lab.Med.41(11):1513-7。可以单独或组合使用来确定对象是否处于发展高胆固醇血症的风险或易发展高胆固醇血症的风险的额外的因素包括但不限于遗传(即家族性高胆固醇血症)、高血压、吸烟史、饮酒、糖尿病、肥胖、缺乏运动、年龄和性别(即50岁以上的绝经后妇女)和压力。

如本文所用，术语“有效量”是指化合物、提取物或含有该化合物或提取物的制剂的足以显著改善病症的量。当确定待用于人的有效量时，还需要关注的是平衡期望效果(益处)和与使用化合物相关的风险。进行此类风险/益处评价的关键是观察到的不良反应的类型及其发生的可能性。还应考虑以下事实：有效量可能随所被治疗的特定病症(例如糖尿病或肥胖)、最终用户的年龄和身体状况、病况的严重程度、治疗的持续时间、所用的具体载体等因素而变化。

一般而言，本发明的化合物或提取物的合适的日剂量应为化合物或提取物有效产生期望益处的最低剂量的量，在这种情况下，效果是改善脂肪和糖的代谢，因此支持整体健康和幸福。这样的有效剂量通常将取决于本文所述的因素。对于口服施用，剂量可以是约0.0001mg至约10g/千克体重/天、约5mg至约5g/千克体重/天，约10g至约2g/千克体重/天，或任何其他合适的剂量。如果需要，化合物或提取物的有效日剂量可以以全天以适当的间隔分别施用的两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量进行施用，优选以单位剂型的形式。优选的剂量是每天一次施用。

本发明的化合物或提取物可以单独使用或与特定饮食(例如，具有低血糖指数的食物)或护理标准组合使用。

施用本发明的化合物或提取物调节对象的代谢，从而解决一种或多种代谢病症的潜在发病机理和/或促进该对象的健康、幸福和生活质量。理想地，有效量的化合物或提取物提供一种或多种代谢化合物的水平或活性的可测量的改善。实例包括HNF4α活性、胰岛素样生长因子水平(如胰岛素样生长因子1或IGF-1)、血糖水平、胰岛素水平、C肽水平、甘油三酯水平、游离脂肪酸水平、血尿酸水平、微量白蛋白尿水平、葡萄糖转运体表达、脂联素水平、总血清胆固醇水平，高密度脂蛋白(HDL)水平和/或低密度脂蛋白(LDL)水平。

更特别地，施用本发明的化合物或提取物改善代谢、肝功能、空腹血浆葡萄糖水平、餐后血浆葡萄糖水平、糖基化血红蛋白HbA1c、体重、胰岛素敏感性、通过改善脂质清除来改善血脂谱、或其组合。在特定的实施方案中，本发明化合物或提取物的使用优选预防、减缓代谢病症进展、延迟或治疗代谢病症，所述代谢病症例如是T2DM、糖耐量受损、空腹血糖受损、高血糖、餐后高血糖、高胰岛素血症、NASH、NAFLD或代谢综合征；减缓糖尿病前期的进展、延迟或治疗糖尿病前期；改善血糖控制和/或降低空腹血浆葡萄糖、餐后血浆葡萄糖和/或糖基化血红蛋白HbA1c；预防、减缓、延迟或逆转糖耐量受损、空腹血糖受损、胰岛素抵抗或代谢综合征向T2DM的进展；预防糖尿病并发症、减缓糖尿病并发症的进展、延迟、预防或治疗糖尿病并发症，所述糖尿病并发症例如是白内障或微血管或大血管疾病，如肾病、视网膜病、神经病、组织缺血、糖尿病足、血脂异常、动脉硬化、心肌梗塞、急性冠状动脉综合征、不稳定型心绞痛、稳定型心绞痛、中风、周动脉阻塞疾病、心肌病、心力衰竭、心律异常或血管再狭窄；降低体重和/或体脂，或预防体重和/或体脂增加，或促进体重和/或体脂降低；预防、减缓、延迟或治疗归因于异位脂肪(特别是肝脂肪)的异常积累的疾病或病况；维持和/或改善胰岛素敏感性和/或治疗或预防高胰岛素血症和/或胰岛素抵抗；降低脂肪沉积；预防、减缓、延迟或逆转脂肪肝向NASH的进展；和/或预防、减缓、延迟或逆转NASH向肝硬化、晚期肝病和/或肝细胞癌的进展。

提供以下非限制性实施例以进一步说明本发明。

实施例1：评价代谢活性的指标：材料和方法

胰岛素和HNF4α的表达。使用

色谱分离和分离试剂盒(Qiagen)纯化RNA，并使用qScript^TM cDNA SuperMix(Quanta Biosciences)将其转化为cDNA。使用Opticon实时系统(MJ Research)和QPCR SuperMix(BioPioneer)，用相当于2μg RNA的cDNA进行Q-PCR。将所有mRNA值均归一化为18S rRNA值，并表示为相对于媒介物处理的对照的倍数变化。

对雌激素活性的反筛选。通过将含有融合至萤火虫萦光素酶基因(4RTK-luc)的最小启动子的多聚化(multimerized)E盒子5’的报告质粒与野生型E47或E47MER共转染来监测雌激素活性(Kiselyuk等人(2010)J.Biomol.Screen 15(6):663-70)。用聚乙烯亚胺、0.2μg 4RTK-Luc质粒以及0.3μg人E47、E47MER或pMSCVhph载体在50μl无血清的Dulbecco改良的Eagle培养基/孔中转染HeLa细胞。转染包括海肾(Renilla)萦光素酶(pRL-TK)质粒作为转染效率的对照。转染条件如Kiselyuk等人((2010)J.Biomol.Screen 15(6):663-70)的PPRE-Luc报告检测中所述。转染之后16小时，更换培养基并且用他莫昔芬和/或化合物或媒介物(DMSO)维持48小时。然后裂解细胞，并使用Promega

报告基因检测试剂盒(Promega Corp.，Madison，WI)测定萦光素酶活性，并使用Veritas^TM微孔板发光计(Turner Biosystems，Sunnyvale，CA)测量发光。将数据归一化为海肾萦光素酶(pRL-TK)，并表示为相对于单独媒介物的倍数变化。

HNF4αGFP表达的抑制。使用本文所述的胰岛素启动子测定法，在与N-反式-咖啡酰酪胺(0、5、10、20μM)组合的BI-6015(0、2.5、5μM)的存在下，评价HNF4α的活性，所述BI-6015是一种已知的HNF4α的拮抗剂(Kiselyuk等人(2012)Chem.Biol.19(7):806-818)。

肝微粒体测定。根据已知方法(Peddibhotla等人(2013)ACS Med.Chem.Lett.4:846-851)进行肝微粒体稳定性测定。简言之，将3μL的25μM化合物的乙腈溶液与123μL小鼠、人或大鼠肝微粒体(Xenotech，Kansas City，KS)一起孵育。在37℃下预孵育10分钟后，在100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)的存在下通过添加120μL NADPH生成体系(2mM NADP⁺、10mM葡糖-6-磷酸、0.4U/ml葡糖-6-磷酸脱氢酶和5mM MgCl₂)引发酶反应。使用的每种化合物的最终浓度为1μM。使用的微粒体浓度为1.0mg/mL。将化合物在微粒体内孵育0、5、15、30和60分钟。通过添加冰冷ACN来终止反应，并且将反应混合物在10,000g下离心10分钟，然后去除上清液用于分析。使用Thermo Scientific Accucore C18(2.6μM，2.1x50mm)柱，将10μL所得提取物的部分注入配备有PAL CTC板采样器(96孔板)、Dionex Ultimate 3000二元泵(流速为0.600mL/min)、Dionex Ultimate 3000恒温柱室(温度为40℃)、Thermo Endura质谱仪(ESI源)的Thermo HPLC系统中。在最初的0.5分钟期间，以95％H₂O(0.1％甲酸)和5％ACN(0.1％甲酸)开始进行梯度，然后从0.5至3.5分钟在5％-100％ACN(0.1％甲酸)的梯度条件下，以95％H₂O(0.1％甲酸)和5％ACN(0.1％甲酸)结束历时0.5分钟，再以95:5进行1分钟以重新平衡。

HepG2和T6PNE细胞中的脂质清除(脂肪变性测定)。脂肪变性测定按照(Kiselyuk等人(2012)Chem.Biol.19(7):806-818)所述进行，除了药物浓度，在HepG2细胞系中为20μMN-反式-咖啡酰酪胺，含0.25mM棕榈酸酯，并且在T6PNE细胞系中为10μM N-反式-咖啡酰酪胺、N-反式-咖啡酰酪胺或对香豆酰酪胺，含0.25mM棕榈酸酯。根据制造商的指南，使用用于脂肪试剂盒(Poly Scientific；Warrington，PA)的油红O法评估脂肪变性。简言之，将冷冻的组织载玻片或固定的细胞在纯丙二醇中孵育2分钟，并且对于载玻片，在油红O溶液中孵育15小时，或者对于固定的细胞在油红O溶液中孵育1小时，在85％丙二醇溶液中分化1分钟，然后用蒸馏水洗涤两次并在苏木精中染色10秒钟。载玻片用甘油凝胶封固剂封固。

碱性磷酸酶(ALP)定量。血液中ALP水平升高被认为是肝功能异常的指标。因此，根据已知方法测定ALP(Kiselyuk等人(2012)Chem.Biol.19(7):806-818)。简言之，在处死之前，抽血并使用VetScan血液分析仪进行分析，测量碱性磷酸酶(ALP，IU/L)、丙氨酸氨基转移酶(ALT，IU/L)、γ-谷酰基转移酶(GGT，IU/L)、胆汁酸(BA，μmol/L)、总胆红素(TBIL，mg/dL)、白蛋白(ALB，g/dL)、血尿素氮(BUN，mg/dL)和胆固醇(CHOL，mg/dL)。

甘油三酯(TG)定量。根据制造商的说明，使用甘油三酯比色测定试剂盒(CaymanChemicals；Ann Arbor，MI)测定TG量。

脂滴尺寸分析。使用Aperio Scanscope FL系统(Aperio Technologies Inc.；Vista，CA)以20倍放大率扫描所有载玻片。指定合适的染料，并使用预设程序校准照明水平；保存参数并应用于所有载玻片。所获取的数字图像代表整个组织切片。评估切片的图像质量。随后将所有获取的图像放置在专用项目文件夹中，并存储在指定的本地服务器上。使用Aperio Imagescope(第12版Aperio Technologies Inc.)选择载玻片的选定区域。为了进行分析，观察载玻片，选择整个组织区域并使用基于网络的Image Scope Viewer进行分析。使用用于油红O染色的“Color Deconvolution v9’算法(11版Aperio TechnologiesInc.)对载玻片进行定量。使用预设程序优化算法，以使强红色正油滴信噪比最大化，随后的宏(macro)被保存并应用于所有载玻片。

器官样品中的HNF4α免疫染色。从小鼠收集样品，固定在4％多聚甲醛中并包埋在石蜡或O.C.T.冷冻介质中(Sakura Finetek；Torrance，CA)。厚度为5μm的载玻片用PBS洗涤四次，并用0.3％Triton^TM的PBS溶液处理10分钟。在亚沸温度下，用CitriSolv^TM(FisherScientific；Waltham，MA)进行抗原修复10分钟。用PBS洗涤10分钟之后，将载玻片在含有5％正常驴血清的封闭液中(Jackson Immuno Research；West Grove，PA)在室温下孵育60分钟。将细胞在4℃下在4％多聚甲醛中固定15分钟，并用PBS洗涤，用0.3％Triton^TM的PBS溶液处理10分钟，然后如先前对载玻片样品所述进行封闭。

原发性抗体。使用HNF4α抗体(#sc-6556，Santa Cruz Biotechnology；SantaCruz，CA和#3113，Cell Signaling Technology；Danvers，MA)。对于萦光成像，将样品与ALEXA

488绿色萦光染料或罗丹明标记的抗小鼠、兔或山羊一起孵育，并用DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)对细胞核进行复染(counterstained)。仅使用二抗的对照用于确保免疫染色的特异性。用常规倒置显微镜(Olympus，PlanFl 40x/0.60)或配备有氪/氩激光的共聚焦显微镜分析萦光标记的切片。

生物利用度测定。经由IV、腹膜内或口服途径向雄性C57BL/6小鼠施用N-反式-咖啡酰酪胺或N-反式-阿魏酰酪胺(每种途径三只小鼠)(表2)。

表2

给药后0.25、0.5、1、2、4、6和24小时从每只小鼠抽取血样。使用8μL血液等分试样进行分析。在添加200μL包含在ACN中的100ng/mL拉贝洛尔、100ng/mL地塞米松、100ng/mL甲苯磺丁脲、100ng/mL维拉帕米、100ng/mL格列本脲和100ng/mL塞来昔布的内标物之后，将混合物涡旋混合并在4℃下以12000rpm离心15分钟以使析出的蛋白质沉淀。进样4μL上清液用于LC-MS/MS分析。使用标称剂量的AUC_0-inf(％AUC_Extra<20％)或AUC_0-last(％AUC_Extra>20％)计算生物利用度(％)。

pH稳定性评价。在DMSO中以10mg/mL的浓度制备单独的储备溶液。制备了四种不同的缓冲溶液，以实现pH值为2、7.4、8.5和10的溶液。对于每种pH测定，将5μL的储备溶液添加到245μL的缓冲溶液中并添加到2mL管中，涡旋振荡并在37℃水浴中孵育。在每个时间点，取50μL等分试样，将其中和，并使用DAD检测器在280nm处通过HPLC分析进行分析。分析了初始时间点和最终时间点(分别为0.5小时和72小时)在280nm处峰面积的倍数变化。

实施例2：评价化合物作为HNF4α激动剂的活性

鉴于HNF4α在维持人类健康代谢中的作用，对于作为HNF4α激动剂的活性(直接或间接作用)对测试化合物进行筛选。使用已知的胰岛素启动子-报告测定法，Kiselyuk及其同事(2010.J.Biomol.Screen 15(6):663-70)对于促进胰岛素活化的活性筛选了化合物库。他们将化合物1鉴定为胰岛素激活剂(Kiselyuk等人(2012)Chem.Biol.19(7):806-18)，随后在鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)启动子测定中显示出该化合物具有HNF4α激动活性。已知在瞬时转染测定中，OTC启动子对HNF4α响应(Inoue等人(2002)J.Biol.Chem.277:25257-65)。

为了鉴定具有与该合成剂(化合物1)相似生物活性的植物化合物，采取生物信息学方法，从所有已知植物化合物的集合中预测具有期望的HNF4α激动活性的目标子集合。使用许多算法结合训练数据(即。阳性数据)，围绕阳性数据的重要特征构建模型，这些特征可预测期望的生物学活性。更具体地，在阳性数据集合中包括一组18种已知具有影响HNF4α活性的能力的合成化合物(例如，化合物1)。这些结构用于在植物化合物数据库中搜索具有相似结构特征的化学结构。基于来自图论和信息论领域的概念，许多度量单独地或结合地用来衡量相似性。

选择与18种目标结构相似的的前10个百分位的植物化合物，并在HNF4α分析中筛选预期具有它们的化学结构特征的潜在的HNF4α活性的激动剂。筛选结果鉴定出一类能够用作HNF4α调节剂的含羟基肉桂酰胺的植物酪胺(即，N-反式-咖啡酰酪胺、N-顺式-咖啡酰酪胺、N-反式-阿魏酰酪胺和对香豆酰酪胺)。值得注意的是，在活化HNF4α方面，N-反式-咖啡酰酪胺被确定为比阿尔维林强约一个数量级(图1)。由于两个苯环的羟基衍生化，N-反式-咖啡酰酪胺的亲脂性更低，因此有望具有更高的生物利用度。总之，增加的效力和预期的提高的生物利用度表明，预期N-反式-咖啡酰酪胺和其他含羟基肉桂酰胺的酪胺是用于本文所公开的方法中更理想的化合物。

进行二次实验以证明这些化合物直接调节HNF4α活性。特别地，证明了在N-反式-咖啡酰酪胺和N-反式-阿魏酰酪胺的存在下胰岛素(图2)和HNF4α(图3)的基因表达被上调(例如，如通过定量PCR分析确定的)。另外，发现对香豆酰酪胺也上调了胰岛素和HNF4α基因的表达；然而，顺式-阿魏酰酪胺、N-香豆酰多巴胺、N-反式-阿魏酰真蛸胺(N-trans-feruloyloctopamine)和对香豆酰真蛸胺(p-coumaroyloctopamine)无活性。此外，使用胰岛素启动子测定法，一种已知的HNF4α拮抗剂BI-6015抑制N-反式-咖啡酰酪胺介导的胰岛素表达的增加(图4)。另外，显示了N-反式-咖啡酰酪胺和N-反式-阿魏酰酪胺没有表现出雌激素活性(图5)。

使用人、大鼠和小鼠的肝微粒体，体外药理学表明N-反式-咖啡酰酪胺是稳定的，并且在人体的更高的生物活性可归功于N-反式-咖啡酰酪胺在人细胞中的半衰期比在小鼠肝微粒体中的更长(表3)。对于人微粒体，明显的主要生物转化途径是左手芳基环的氧化。

表3

*N-反式-咖啡酰酪胺的量

N-反式咖啡酰酪胺(20μM)和N-反式-阿魏酰酪胺(20μM)处理的HepG2肝细胞的分析表明，这些化合物能够从肝清除有害脂肪，如对脂肪的油红O染色所证明，并进一步抑制了用0.25mM棕榈酸酯处理的HepG2肝细胞中的脂肪的积累。在用0.25mM棕榈酸酯和10μM N-反式-咖啡酰酪胺、10μM N-反式-阿魏酰酪胺或10μM对香豆酰酪胺处理的T6PNE细胞中观察到类似的脂肪积累的抑制。当在化合物施用之前添加棕榈酸酯时，N-反式-咖啡酰酪胺降低了脂质积累(图6)。

除了进行证明本发明化合物的有益效果的测定之外，还进行了初始的安全性/毒性测定。表4示出了这些分析的总体结果。

表4

ND，未测定。

实施例3：饮食诱导的肥胖小鼠的功效

除了证明本发明化合物的体外功效外，还在人疾病的动物模型即饮食诱发的肥胖小鼠中进行体内实验。进行实验以建立进食和治疗方案，剂量和施用方案，并提供N-反式-咖啡酰酪胺对葡萄糖和脂质稳态、肝脂肪变性、β-细胞功能和肝细胞功能的有益效果的证据。给十二只小鼠(10周龄)饲喂高脂饮食，持续四周以诱导肥胖。四周后，在高脂饮食的同时，六只小鼠每天两次腹腔注射施用5％DMSO或120mg/kg N-反式-咖啡酰酪胺，持续14天。最后一次i.p.注射DMSO或N-反式咖啡酰酪胺之后一小时，处死动物并收集血液和器官(肝、肾，肠和胰腺)样品。对器官样品进行组织学、RNA、甘油三酯和蛋白质分析。值得注意的是，该研究中的小鼠在任何测试剂量下均未表现出任何毒性作用。接受治疗的小鼠表现出与对照组一致的活动、警觉、理毛行为和食欲水平。与对照组相比，经治疗的小鼠均未表现出体重减轻、疾病或异常行为。

结果显示，N-反式-咖啡酰酪胺治疗降低脂质积累并显著增加肝中的HNF4α表达(P＝0.0042)，特别是HNF4α的细胞核表达(图7)。免疫染色结果表明，N-反式咖啡酰酪胺增加了HNF4α的活性。另外，在用N-反式咖啡酰酪胺治疗的动物中，肝中脂滴的尺寸降低了(图8)。另外，在用N-反式-咖啡酰酪胺治疗的小鼠中，碱性磷酸酶(图9)和甘油三酯(图10)的水平显著降低。肝脂肪和滴尺寸的降低以及碱性磷酸酶的减少证明了增加HNF4α活性的有益效果。鉴于碱性磷酸酶和甘油三酯水平通常是人类血液测试的常规部分，并且升高的水平是肝功能不良、肥胖和代谢综合征的指示，碱性磷酸酶和甘油三酸酯的水平将为评价含羟基肉桂酰胺的酪胺在被施用本发明化合物的人中的效果提供有用的标志物。与DMSO对照小鼠相比，在胰腺中，经N-反式-咖啡酰酪胺治疗的动物中的HNF4α表达增加(图11)。类似地，施用N-反式-咖啡酰酪胺之后肠中HNF4α表达增加(图12)。

这些体内数据证明了HNF4α表达与肝脂肪水平之间的相关性。另外，结果表明，N-反式-咖啡酰酪胺增加了体内HNF4α活性，并对脂质、甘油三酯、碱性磷酸酶和HNF4α的水平产生了有益的效果。

实施例4：化合物相关毒性的评估

鉴于需要平衡本发明化合物的益处和风险，通常在实验室动物(例如，小鼠、大鼠、狗)中进行体内毒性研究。通常按照良好实验室规范(GLP)条例进行此类研究，以确保出于管理目的的可靠性和重复性。如果化合物要在人类中以数周至数月至数年的周期施用，通常进行慢性毒性研究(持续六个月至一年的研究)。对于待在食品中使用的化合物，推荐口服毒性研究。

慢性毒性测试的目的是确定测试化合物的毒理学概况。在测试的初始阶段，将在大鼠中进行研究。将随机选择总共160只约5-7周大的每只重80-100g的SD大鼠(80只雄性和80只雌性)，并按重量分配至治疗组；使得每组的平均体重不会有明显差异。将测试化合物或提取物以每天0.5、1和2g/kg体重的剂量水平口服施用至大鼠，连续180天的周期。每天将观察动物的毒性的任何临床体征(例如，行为改变；皮肤和毛皮外观；进食和饮水等)。实验结束时，将按照标准毒理学方法对动物进行血液学、生化和组织病理学评估。

实施例5：从植物来源分离含羟基肉桂酰胺的酪胺

由各种植物物种及其植物组织制备乙醇提取物。通过用95％乙醇水溶液提取植物干粉材料，在提取物中鉴定出各个化合物。将乙醇提取物浓缩并吸附到硅藻土上，并干燥加载到C18固相提取柱上。通过用两倍柱体积的水洗涤将提取物脱盐，将水收集并丢弃。用两倍柱体积的甲醇洗脱化合物，并将提取物浓缩至干。在分析之前，将提取物重悬于1:1乙腈:水中。在分析之前，使用已知浓度的合成标准品来生成校准曲线。分析中使用的来源列表在下表5中给出。每种化合物的植物按降序显示，其中产生最高量的化合物的植物位于列表的顶部，最低的生产者在列表的底部。

表5

确定了存在于某些乙醇提取物中的N-反式-咖啡酰酪胺、N-反式阿魏酰酪胺和对香豆酰酪胺的量(提取物的％，重量/重量)。通过将结果以乙醇提取物的重量归一化来对化合物进行定量。这些分析的结果在图13中示出。

实施例6：测试化合物在NAFLD的动物模型中的功效

像饮食诱导的肥胖小鼠模型一样，还有用于检测化合物在NAFLD中的益处的其他完善的动物模型。

动物和饮食。将获得成年雄性SD大鼠(250-300克)。定制饮食包括对照、仅高脂饮食以及含有测试化合物或提取物的高脂饮食。对照饮食将是低脂饮食，其中来自脂肪的总卡路里中的12％来自玉米油，而脂肪的大多数是亚油酸。高脂(HF)饮食将包含总卡路里的60％的猪油以及2％的玉米油，并且饮食中将富含油酸和饱和脂肪酸棕榈酸和硬脂酸。这种高脂饮食先前被用于诱导大鼠中的NAFLD(Carmiel-Haggai等人(2005)FASEB J.19:136-138)。将4组中每组的7只大鼠随机分组并饲喂4周的饮食：第一组：控制饮食；第二组：HF饮食，第三组：HF+0.5％化合物/提取饮食；第四组：HF+1％化合物/提取物。将大鼠按12小时日/夜周期安置，并随意获取食物和水。在第4周结束时，使大鼠禁食16-18小时，将其麻醉，并收集血液和肝样本以进行生化和组织学分析。

血清和肝甘油三酯和胆固醇。血清甘油三酯和总胆固醇将通过市售的测定试剂盒(例如，Wako Diagnostics；Richmond，VA)测量。将使用氯仿-甲醇混合物(2:1)从肝样品(约0.25g)中提取总脂质，并用0.73％氯化钠溶液洗涤。有机相和水相将通过以2000rpm离心10分钟进行分离。含有总脂质的有机相将在氮下完全干燥，脂质提取物在异丙醇中重构。使用测定试剂盒(例如，来自Wako Diagnostics)将脂质提取物的等分试样用于测量甘油三酯和总胆固醇。

血清和肝硫代巴比妥酸反应性物质(TBARS)的测量。血清和肝TBARS将作为脂质过氧化产物的指标进行测量。

肝组织学。肝样品将用10％福尔马林固定并包埋在石蜡中。将切片(5μm)用苏木精和曙红染色，并由对实验组和条件不知情的病理学家进行评估。将对切片进行半定量以评价脂肪变性。

统计分析。数据将以平均值+S.E.表示。将使用双尾学生t检验(two-tailedStudent’s t-test)对各组进行统计分析，并且p<0.05将被认为具有统计学意义。

实施例7：测试化合物在治疗患有T2DM的对象的NASH中的安全性和功效的评估

该研究的目标将是评价在患有T2DM和NASH的对象中，与安慰剂相比实施例化合物或提取物是否可以改善肝健康和肝脂肪含量。该研究还将包括评价血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平，以及确定测试化合物或提取物治疗在降低当通过MRI得出的质子密度-脂肪分数(MRI-POFF)测量的肝脂肪含量方面是否比安慰剂治疗更有效。将在第24周(或最后一次基线观察后)对患有NASH和T2DM的成年对象进行化合物或提取物治疗与安慰剂治疗之间的血清ALT水平和肝脂肪含量的比较。

研究的第二目标将是通过评价治疗24周后的血清AST水平评估与安慰剂治疗相比该测试化合物或提取物对肝健康的影响；评估治疗对糖化血红蛋白(HbA1c)的影响；评估治疗对如使用Fibroscan的瞬时弹性成像所测量的肝纤维化的影响。一起考虑，结果将允许评价与安慰剂治疗相比，测试化合物或提取物治疗的总体安全性和耐受性。

此外，研究设计中将包括几个探索性目的。例如，基于以下的各项的测试化合物或提取物对对象免疫概况的影响：1)来自在高灵敏度C-反应蛋白(hsCRP)和红细胞沉降率(ESR)中的基线的变化；2)来自在肿瘤坏死因子α(TNF-α)的血清水平中的基线的变化；3)来自在转化生长因子(TGF)β的水平中的基线的变化；4)来自在白细胞介素(IL)-2、-4、-6、-10和-12的水平以及干扰素(IFN)γ的水平中的基线的变化；以及5)萦光激活细胞分拣术(FACS)分析，其将测量来自在免疫标志物(例如，分化簇3(CD3)、CD4、CD8、CD25、CD40、CD56、CD69、CD127、叉头框蛋白P3(forkhead box P3)(FOXP3+)、IL17和视黄酸有关的孤儿受体-γt(RORγt))中的基线的变化。另一个探索性目标将是评估测试化合物或提取物对以下标志物的影响：血液炎症标志物(TNF-α，成纤维细胞生长因子19(FGF-19))、肝纤维化或细胞死亡标志物(细胞角蛋白-18(CK-18)、可溶性Fas(sFas))、以及氧化应激标志物，如羟基二十碳四烯酸(HETE)、羟基十八碳二烯酸(HODE)、氧代二十碳四烯酸(oxoETE)、氧代十八碳二烯酸(oxoODE)和氧化非酒精性脂肪性肝炎(oxNASH)。此外，该研究将：使用胰岛素抵抗的稳态模型评价(HOMA IR)测量胰岛素来评估测试化合物或提取物的效果；评估该化合物或提取物对血脂谱(甘油三酯、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和总胆固醇)的影响；并且评估该化合物或提取物对GLP1和脂联素的影响。

用测试化合物或提取物治疗24周之后，将评估安全性或耐受性端点。端点将包括对以下各项的评价：任何报告的不良事件的数量和严重性；体格检查结果；从基线到研究完成的临床实验室评估(血清化学、血液学和尿液分析)和12导联心电图(ECG)；以及方案完成前退出研究的对象数。在研究期间的以下时间点，将收集并测量安全实验室测试结果：第1天和第3天以及第1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24周(或提前退出)。

总共80位T2DM和NASH对象将被随机分为两组：一组将每天一次接受安慰剂(n＝40)；并且一组将每天一次接受剂量为80mg的测试化合物或提取物(n＝40)。尽管将以每天80mg的剂量施用测试化合物或提取物，但是可以基于对象的耐受性来调整(titrate)剂量，或可以不考虑耐受性而在研究期间将其设定为固定量。

实施例8：测试化合物在治疗肥胖对象中的NASH的安全性和有效性的评估

将根据实施例7的方法进行研究，其中唯一的不同在于对象纳入标准包括要求对象为如所定义的BMI≥30的肥胖，而不是患有T2DM。

实施例9：测试化合物在治疗患有T2DM的对象的NAFLD中的安全性和有效性的评估。

这项研究的目标是通过评价治疗24周之后磁共振成像得出的质子密度脂肪分数(MRI-PDFF)，来确定与安慰剂相比，测试化合物或提取物是否可以改善患有T2DM和NAFLD两者的对象中的肝脂肪含量和肝健康。

这项研究的第二目标是：1)通过评价治疗24周之后的血清ALT水平，来评估与安慰剂治疗相比，测试化合物或提取物治疗对肝健康的影响；2)通过评价治疗24周之后的血清AST水平，来评估与安慰剂治疗相比，测试化合物或提取物治疗对肝健康的影响；3)评估测试化合物或提取物治疗对糖基化血红蛋白(HbAlc)的影响；4)评估测试化合物或提取物治疗对肝纤维化的影响，如使用Fibroscan的瞬时弹性成像所测量的；以及5)评估与安慰剂治疗相比，测试化合物或提取物治疗的总体安全性和耐受性。这项研究的探索性目标包括实施例7中列出的那些。

总共80位T2DM和NAFLD对象将被随机分为两组：一组将每天一次接受安慰剂(n＝40)，并且一组将每天一次接受剂量为80mg的测试化合物或提取物(n＝40)，如实施例7中所述。将在第-28天至第-2天之间的访视1中对对象进行筛选。筛选时，对象将进行旨在确保符合纳入/排除标准的筛选流程，包括用于定量测量肝脂肪含量的腹部MRI。基于筛选评价的结果符合纳入/排除标准的对象将在第-1天返回研究中心进行基线评价(访视2)。在基线访视时，将进行纳入/排除标准的确认，并且将进行基线实验室值、体格检查结果和ECG结果的评价。

对象需要有经认证的组织学报告，该报告记录并评价了能够确认NAFLD的诊断的脂肪变性、小叶炎症、肝细胞膨胀和纤维化的程度。

在第24周(或提前终止)的访视18时，所有对象都将接受最终治疗评估，包括通过MRI和临床实验室安全评估的肝脂肪含量成像。

Claims (7)

1.调节代谢的方法，包括向有需要的对象施用可消耗组合物，从而调节所述对象的代谢，所述可消耗组合物包含至少一种载体和有效量的提取物，所述提取物包含式I的化合物、或其异构体、盐、同二聚体、异二聚体或缀合物：

其中

R¹存在或不存在，并且当存在时是在一个或多个环原子上的取代基，并且对于每个环原子，R¹独立地是羟基、卤素基团、取代或未取代的低级烷基、或者取代或未取代的低级烷氧基；并且

虚线键存在或不存在。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物具有式II的结构：

其中

R²存在或不存在，并且当存在时是羟基或甲氧基；

R³存在或不存在，并且当存在时是羟基；并且

R⁴存在或不存在，并且当存在时是羟基或甲氧基。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述提取物是葱属、辣根属、藜属、荞麦属、番荔枝属、胡椒属、画眉草属、玉蜀黍属、大麻属、甘薯属、辣椒属、枸杞属、茄属或蒺藜属中的成员的乙醇提取物。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物被配制为膳食补充剂、食品成分或添加剂、医疗食品、保健品或药物组合物。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述有效量的所述组合物改善HNF4α活性、胰岛素样生长因子水平、血糖水平、胰岛素水平、HbA1C水平、C肽水平、甘油三酯水平、游离脂肪酸水平、血尿酸水平、微量白蛋白尿水平、葡萄糖转运体表达、脂联素水平、总血清胆固醇水平、高密度脂蛋白水平、低密度脂蛋白水平或其组合。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述对象患有代谢病症或处于发展代谢病症的风险中。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述代谢病症包括胰岛素抵抗、高血糖症、II型糖尿病、肥胖症、葡萄糖耐受不良、高胆固醇血症、高脂蛋白血症、血脂异常、高胰岛素血症、动脉粥样硬化疾病、冠状动脉疾病、代谢综合征或高血压。

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