CN102872064A - 枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣中提取α-葡萄糖苷酶活性抑制剂的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明是从枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣中提取α-葡萄糖苷酶活性抑制剂，其提取方法为：枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣经甲醇超声提取3次，合并提取液，减压干燥得甲醇总提取物，将甲醇总提取物加水溶解后，分别用等体积的正己烷、乙酸乙酯萃取3次，减压回收溶剂，得正己烷提取物、乙酸乙酯提取物；剩下的水层经大孔树脂柱处理，甲醇洗脱，得甲醇洗脱物、水洗脱物，采取α-葡萄糖苷酶活性体系追踪，发现正己烷提取物、乙酸乙酯提取物、甲醇洗脱物均表现出一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，将上述三种提取物经硅胶柱色谱，ODS柱色谱以及高效液相制备色谱分离得到14个化合物。

Description

枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣中提取α-葡萄糖苷酶活性抑制剂的方法及其用途

技术领域

本发明涉及一种药物的提取分离方法及应用，特别是一种从枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣中提取α-葡萄糖苷酶活性抑制剂的方法及其应用。 

技术背景

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)是一类能够从含有α-葡萄糖苷键底物的非还原端催化水解α-葡萄糖基的酶的总称，其广泛分布于生物体中，参与食物消化、糖蛋白的生物合成，多糖及糖复合物的合成与分解代谢等许多生物代谢过程。抑制α-葡萄糖苷酶的活性可调节细胞表面的复合糖质，而糖尿病、肥胖症、高血脂、炎症、癌变、免疫反应和病毒感染等都和细胞表面的复合糖质有密切关系，因此，开发出适当的α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物，可以治疗很多疾病。 

枸杞(Lycium)是我国传统的中草药，首载于《神农本草经》，之后历代本草对其都有详尽的记载。果实入药称枸杞子，味甘，性平。有滋补肝肾，益精明目功效。主治肝肾阴虚、头晕目眩、腰膝酸痛等证。现代免疫学和临床医学多项试验表明枸杞果实及枸杞多糖可有效提高机体免疫调节功能，治疗糖尿病及其并发症，具有抗突变、抗肿瘤、抗疲劳、延缓衰老、明目养颜保肝降血糖等功效。而对枸杞籽的研究不多，一般主要用于提取具有医疗保健作用的枸杞油，提取后的残渣则视为废物，但枸杞籽和果是包含在一起的，且籽约占干果的四分之一重量，为了开发利用枸杞籽及其提取枸杞油后废弃的残渣，我们对其进行了化学成分及生物活性的研究。 

发明内容

本发明的目的是提供一种从枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣中提取α-葡萄糖苷酶活性抑制剂的制备方法及其应用。 

本发明的目的按照下述方案实现： 

从枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣中提取α-葡萄糖苷酶活性抑制剂的方法，其步骤为：枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣经甲醇超声提取3次，合并提取 液，减压干燥得甲醇总提取物，将甲醇总提取物加水溶解后，分别用等体积的正己烷、乙酸乙酯萃取3次，减压回收溶剂，得正己烷提取物、乙酸乙酯提取物；剩下的水层经大孔树脂柱处理，甲醇洗脱，得甲醇洗脱物、水洗脱物，采取α-葡萄糖苷酶活性体系追踪，发现正己烷提取物、乙酸乙酯提取物、甲醇洗脱物均表现出一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，将上述三种提取物经硅胶柱色谱，ODS柱色谱以及高效液相制备色谱分离得到14个化合物，结构和名称见附图1。 

所述抑制剂的用途，是将其用作临床治疗II型糖尿病治疗的首选药和I型糖尿病的胰岛素治疗的辅助药物； 

所述抑制剂的用途，是将其用作预防艾滋病的辅助药物； 

所述抑制剂的用途，是将其用作阻止肿瘤血管生长的抗肿瘤药物。 

α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定 

本发明以4-硝基酚-2-D-吡喃葡萄糖苷(缩写PNPG)为反应底物，具体的反应体系为25μL PNPG，加入25μL各种浓度的样品溶液后，加入25μL α-葡萄糖苷酶，再加入175μL磷酸盐缓冲液，在混合器上混合10分钟后。在37℃反应15分钟，加入1M Na₂CO₃ 50μL终止反应，在405nm波长处测定吸收值。通过不加样品测定样品空白，不加α-葡萄糖苷酶测定阴性对照。样品的抑制率通过以下公式计算：抑制率(％)=(OD_{Negative control}-OD_Blank)-(OD_Sample-OD_{Sample blank})/(OD_{Negative control}-OD_Blank) 

附图说明

附图1是本发明从枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣中提取得到的14个化合物的名称及结构示意图。 

附图2是本发明枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣提取工艺流程图，图中，LB代表枸杞；M为甲醇；N为乙腈；T为0.06％三氟乙酸；HAc为3％的醋酸；例如：12％NT是12％的乙腈溶液(包含0.06％三氟乙酸)；IC50为半数致死率；HPLC为制备高效液相色谱法。 

单体化合物的IC50(半数致死率)单位：Mm 

具体实施方式：

下面通过具体实施例对本发明进行描述。但本发明的范围并不仅限于此。 

1、提取与分离 

枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣各1.00kg经甲醇超声提取3次，合并提取 液，减压干燥得甲醇总提取物8.97g，该提取物具有抗α-葡萄糖苷酶活性，IC50为2.33mg/mL。将甲醇总提取物加水溶解后，分别用等体积的正己烷、乙酸乙酯萃取3次，减压回收溶剂，得正己烷提取物1.90g、乙酸乙酯提取物1.30g。剩下的水层经大孔树脂柱处理，甲醇洗脱，得甲醇洗脱物0.52g、水洗脱物4.61g。采取α-葡萄糖苷酶活性体系追踪，发现正己烷提取物、乙酸乙酯提取物、甲醇洗脱物均表现出一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50分别为2.11mg/mL，1.57mg/mL，1.89mg/mL。因此将上述三部分经硅胶柱色谱，ODS柱色谱以及高效液相制备色谱等方法，分离得到14个化合物，其分离流程图如附图2所示。 

2、14种化合物化学成分的结构鉴定 

化合物1：白色固体(甲醇)，在254nm下有暗斑，分子式为C₁₇H₁₇NO₃。氢谱的低场区给出两组AA′BB′偶合系统的芳香质子信号δ7.39(1H，d，J=8.6Hz，H-2，6)，6.72(1H，d，J=8.6Hz，H-3，5)和δ7.05(1H，d，J=8.6Hz，H-2′，6′)，6.75(1H，d，J=8.6Hz，H-3′，5′)，推测该化合物中应有两个1，4二取代的苯基片段；一组反式双键质子信号δ7.44(1H，d，J=15.7Hz，H-7)，6.38(1H，d，J=15.7，Hz，H-8)；高场区给出一组A₂M₂偶合系统的质子信号δ3.46(2H，t，J=7.2Hz，H-8′)，2.75(2H，t，J=7.2Hz，H-7′)。碳谱给出17个碳信号，其中包括1个羰基碳信号δ169.3(C=O)，两个孤立的连氧芳香碳信号δ160.5(C-4)，157.0(C-4′)；两个反式烯碳信号δ141.8(C-7)，118.6(C-8)；一个连氮碳信号δ42.6(C-8′)；进一步说明该化合物为对羟基桂皮酸与对羟基苯乙胺酰化脱水而成的酰胺。根据以上数据将该化合物鉴定为N-反式-香豆酰酪胺(N-(p-trans-coumaroyl)tyramine)^[。 

化合物2：白色固体(甲醇)，在254nm下有暗斑，分子式为C₁₇H₁₇NO₃，氢谱的低场区给出两组AA′BB′偶合系统的芳香质子信号δ7.36(1H，d，J=8.6Hz，H-2，6)，6.69(1H，d，J=8.6Hz，H-3，5)和δ7.01(1H，d，J=8.6Hz，H-2′，6′)，6.72(1H，d，J=8.6Hz，H-3′，5′)，推测该化合物中应有两个1，4二取代的苯基片段；一组顺式双键质子信号δ6.61(1H，d，J=12.5Hz，H-7)，5.79(1H，d，J=12.5，Hz，H-8)；高场区给出一组A₂M₂偶合系统的质子信号δ3.39(2H，t，J=8.1Hz，H-8′)，2.69(2H，t，J=8.1Hz，H-7′)。化合物2与化合物1的氢谱和碳谱数据很相似，差别在于化合物2的双键为顺式双键。通过与化合物1比较，将该化合物鉴定为N-顺式-香豆酰酪胺(N-(p-cis-coumaroyl)tyramine)。 

化合物3：白色固体(甲醇)，在254nm下有暗斑，分子式为C₁₈H₁₉NO₄。 氢谱的低场区给出一组AA′BB′偶合系统的芳香质子信号δ7.05(1H，d，J=8.5Hz，H-2′，6′)，6.72(1H，d，J=8.5Hz，H-3′，5′)，推测该化合物中应有一个1，4二取代的苯基片段；一组ABX偶合系统的芳香质子信号δ7.12(1H，s，H-2)，7.02(1H，d，J=8.0Hz，H-6)，6.79(1H，d，J=8.0Hz，H-5)，推测该化合物中应有一个1，3，4三取代的苯基片段；一组反式双键质子信号δ7.43(1H，d，J=15.6Hz，H-7)，6.40(1H，d，J=15.6，Hz，H-8)。高场区给出一个甲氧基质子信号δ3.88(3H，s，3-OCH₃)；一组A₂M₂偶合系统的质子信号δ3.47(2H，t，J=7.1Hz，H-8′)，2.75(2H，t，J=7.1Hz，H-7′)。化合物3与化合物1的碳谱数据很相似，差别在于化合物3比化合物1多了一个甲氧基碳信号δ56.5(3-OCH₃)。通过与化合物1比较，将该化合物鉴定为N-反式-对羟基苯乙基阿魏酰胺(N-p-trans-hydroxyphenethyl ferolamine)^[3]。 

化合物4：白色固体(甲醇)，在254nm下有暗斑，分子式为C₃₆H₃₆N₂O₈。氢谱的低场区给出两组AA′BB′偶合系统的芳香质子信号δ7.05(1H，d，J=8.5Hz，H-2′，6′)，6.71(1H，d，J=8.5Hz，H-3′，5′)和δ6.84(1H，d，J=8.4Hz，H-2″′，6″′)，6.59(1H，d，J=8.4Hz，H-3″′，5″′)，推测该化合物中应有两个1，4二取代的苯基片段；两组ABX偶合系统的芳香质子信号δ7.29(1H，d，J=2.1Hz，H-2″)，7.04(1H，dd，J=8.3，2.1Hz，H-6″)，6.72(1H，d，J=8.3Hz，H-5″)和δ7.23(1H，d，J=1.8Hz，H-2)，7.01(1H，dd，J=8.4，1.8Hz，H-6)，6.71(1H，d，J=8.4Hz，H-5)，推测该化合物中应有两个1，3，4三取代的苯基片段；一组反式双键质子信号δ7.45(1H，d，J=15.9Hz，H-7″)，6.49(1H，d，J=15.9Hz，H-8″)；一个孤立的烯氢信号δ7.23(1H，s，H-7)。高场区给出两个甲氧基质子信号δ3.92(3H，s，3″-OCH₃)，3.66(3H，s，3-OCH₃)；两组A₂M₂偶合系统的质子信号δ3.47(2H，t，J=7.6Hz，H-8″′)，2.75(2H，t，J=7.6Hz，H-7″′)和3.46(2H，t，J=6.9Hz，H-8′)，2.64(2H，t，J=6.9Hz，H-7′)(T。碳谱给出36个碳信号。低场区给出2个羰基碳信号δ168.9(C=O)，δ165.6(C=O)；两个孤立的连氧芳香碳信号δ157.0(C-4′)，156.9(C-4″′)；两对邻二连氧取代的芳香碳信号δ150.6(C-3″)，147.6(C-4″)和149.6(C-4)，149.0(C-3)；4个烯键碳信号δ141.7(C-8)，141.1(C-7″)，125.4(C-7)，121.1(C-8″)；高场区给出4个亚甲基碳信号δ42.6，42.2，35.8，35.6。从氢谱、碳谱和分子量进一步说明化合物4应为化合物3的二倍体。并且化合物4中只有3个烯氢信号，推测两分子化合物3应该在其中一组反式双键处连接而成二倍体， 这在HMBC相关谱中得到了证明。HMBC谱中，δ_H δ7.23(H-7)与δ_C 141.7(C-8)，168.9(C-9)，122.3(C-6)有远程相关，证明一分子化合物3的C-4″-OH与另一分子化合物3得8-H脱水而成醚。根据以上数据将该化合物鉴定为大麻酰胺己(cannabisin F)，其推测结构如下所示： 

化合物5：白色固体(甲醇)，在254nm下有暗斑，分子式为C₃₆H₃₆N₂O₈，与化合物4是同分异构体。氢谱的低场区给出两组AA′BB′偶合系统的芳香质子信号δ7.05(1H，d，J=8.5Hz，H-2′，6′)，6.73(1H，d，J=8.5Hz，H-3′，5′)和δ7.01(1H，d，J=8.7Hz，H-2″′，6″′)，6.71(1H，d，J=8.7Hz，H-3″′，5″′)，推测该化合物中应有两个1，4二取代的苯基片段；一组ABX偶合系统的芳香质子信号δ6.91(1H，d，J=1.9Hz，H-2)，6.80(1H，d，J=8.0Hz，H-5)，6.76(1H，dd，J=8.0，1.9Hz，H-6)，推测该化合物中应有一个1，3，4三取代的苯基片段；δ7.10(1H，d，J=1.2Hz，H-2″)，6.74(1H，s，H-6″)，推测该化合物中应有一个1，3，4，5四取代的苯基片段；一组反式双键质子信号δ7.43(1H，d，J=15.8Hz，H-7″)，6.38(1H，d，J=15.8，Hz，H-8″)。高场区给出一个连氧次甲基质子信号δ5.89(1H，d，J=8.2Hz，H-7)；两个甲氧基质子信号δ3.92(3H，s，3″-OCH₃)，3.66(3H，s，3-OCH₃)；两组A₂M₂偶合系统的质子信号δ3.52(2H，m，H-8′)，2.76(2H，t，J=7.3Hz，H-7′)和3.44(2H，m，H-8″′)，2.74(2H，t，J=7.1Hz，H-7″′)。碳谱给出36个碳信号。低场区给出2个羰基碳信号δ173.0(C=O)，δ169.1(C=O)；两个孤立的连氧芳香碳信号δ157.0(C-4′)，156.9(C-4″′)，两对邻二连氧取代的芳香碳信号δ151.3(C-4″)，146.1(C-3″)和149.3(C-4)，148.2(C-3)；两个烯键碳信号δ141.8(C-7″)，119.6(C-8″)。高场区给出一 个连氧次甲基碳信号δ90.0(C-7)和5个脂肪碳信号δ58.8，42.6，42.3，35.8，35.4，其中第1个为次甲基碳信号，后4个为亚甲基碳信号。从氢谱、碳谱和分子量进一步说明化合物5应为化合物3的二倍体。并且化合物5中只有一组反式双键，推测两分子化合物3应该在其中一组反式双键处连接而成二倍体，这在HMBC相关谱中得到了证明。HMBC谱中，δ_H δ5.89(H-7)与δ_C 151.3(C-4″)，132.7(C-1)有远程相关，δ_H 4.15(H-8)与δ_C 132.7(C-1)，173.0(C-9)，129.5(C-3″)有远程相关，证明一分子化合物3的C-4″-OH与C-5″与另一分子化合物3的C-7与C-8骈合而成呋喃环。NOESY谱中，δ_H 4.15(H-8)分别与6.74(H-6″)，6.91(H-2)有相关；而与δ_H 5.89(H-7)无NOE效应；说明H-7与H-8相对构型为反式。根据以上数据将该化合物鉴定为大海米酰胺(grossamide)，其推测结构式如下： 

化合物6：淡黄色油状物(甲醇)，在254nm下有暗斑，分子式为C₁₁H₁₂O₄。在氢谱的低场区给出两个孤立的芳香质子信号δ6.99(2H，s，H-2′，6′)，推测该化合物中应有一个1，3，4，5四取代的苯基片段；一组反式双键质子信号δ7.59(1H，d，J=15.6Hz，H-3)，6.68(1H，dd，J=15.6，7.8Hz，H-2)；一个醛基质子信号δ9.18(1H，d，J=7.8Hz，H-1)。氢谱的高区给出两个甲氧基质子信号δ3.93(6H，s)。碳谱给出11个碳信号，δ196.1(CHO)，156.4(C-3)，127.2(C-2)进一步说明该化合物为芳基烯醛类化合物。根据以上数据该化合物鉴定为芥子醛(sinapaldehyde)。 

化合物7：淡黄色油状物(甲醇)，在254nm下有暗斑，分子式为C₁₀H₁₀O₃。氢谱的低场区给出一组ABX偶合系统的芳香质子信号δ7.26(1H，d，J=1.9Hz，H-2′)，7.17(1H，dd，J=8.0，1.9Hz，H-6′)，6.86(1H，d，J=8.0Hz，H-5′)，推测该化合物中应有一个1，3，4三取代的苯基片段；一组反式双键质子信号δ7.58(1H，d，J=15.6Hz，H-3)，6.65(1H，dd，J=15.6，7.8Hz，H-2)；一个醛基质子信号δ9.57(1H，d，J=7.8Hz，H-1)。氢谱的高区给出一个甲氧基质子信号δ3.90(3H，s)。碳谱给出10个碳信号，δ196.2(CHO)，156.2(C-3)，126.8(C-2)进一步说明该化合物为芳基烯醛类化合物。根据以上数据该化合物鉴定为阿魏醛(ferulaldehyde)^]。 

化合物8：无色油状物(甲醇)，在254nm下有暗斑，分子式为C₇H₆O₂。氢谱的低场区给出一组AA′BB′偶合系统的芳香质子信号δ7.78(1H，d，J=8.7Hz)，6.92(1H，d，J=8.7)，推测该化合物中应有一个1，4二取代的苯基片段；一个醛基质子信号δ9.77(1H，s)。根据以上数据该化合物鉴定为对羟基苯甲醛(p-hydroxybenzaldehyde)。 

化合物9：白色针晶(甲醇)，在254nm下有暗斑，分子式为C₈H₈O₄。氢谱的低场区给出一组ABX偶合系统的芳香质子信号δ7.56(1H，dd，J=8.0，2.0Hz，H-6′)，7.55(1H，d，J=2.0Hz，H-2′)，6.84(1H，d，J=8.0Hz，H-5′)，推测该化合物中应有一个1，3，4三取代的苯基片段；氢谱的高区给出一个甲氧基质子信号δ3.90(3H，s)。碳谱给出8个碳信号，δ170.1(COOH)，进一步说明该化合物为酚酸类化合物。根据以上数据该化合物鉴定为香草酸(vanillic acid)。 

化合物10：白色针晶(甲醇)，在254nm下有暗斑，分子式为C₉H₈O₃。氢谱的低场区给出一组AA′BB′偶合系统的芳香质子信号δ7.44(1H，d，J=8.5Hz，H-2′，6′)，6.81(1H，d，J=8.5，H-3′，5′)，推测该化合物中应有一个1，4二取代的苯基片段；一组反式双键质子信号δ7.60(1H，d，J=15.9Hz，H-3)，6.28(1H，d，J=15.9，H-2)。根据以上数据将该化合物鉴定为对香豆酸(trans-p-hydroxycinnamic acid)^[11]。 

化合物11：白色固体(甲醇)，在254nm下有暗斑，分子式为C₁₀H₁₂O₄。氢谱的低场区给出一组ABX偶合系统的芳香质子信号δ7.58(1H，dd，J=8.2，2.0Hz，H-6′)，7.55(1H，d，J=2.0Hz，H-2′)，6.86(1H，d，J=8.2Hz，H-5′)，推测该化合物中应有一个1，3，4三取代的苯基片段；高场区给出一组A₂M₂偶合系统的 脂肪质子信号δ3.95(2H，t，J=6.2Hz，H-3)，3.16(2H，t，J=6.2Hz，H-2)；一个甲氧基质子信号δ3.91(3H，s)。碳谱给出9个碳信号，在低场区有6个为芳香碳信号和一个羰基碳信号δ199.8(C=O)，高场区有两个亚甲基碳信号δ59.0(C-3)，41.7(C-2)，推测该化合物为芳基酮类化合物。根据以上数据该化合物鉴定为3-羟基-1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙-1-酮(3-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)propan-1-one)。 

化合物12：白色固体(甲醇)，在254nm下有暗斑，分子式为C₁₀H₁₂O₅。氢谱的低场区给出一组ABX偶合系统的芳香质子信号δ7.58(1H，dd，J=8.5，2.0Hz，H-6′)，7.57(1H，s，H-2′)，6.88(1H，d，J=8.5Hz，H-5′)，推测该化合物中应有一个1，3，4三取代的苯基片段；高场区给出一组AM2偶合系统的连氧质子信号，分别为亚甲基和次甲基质子信号，δ5.11(1H，dd，J=11.7，5.3Hz，H-2)，3.88(1H，dd，J=11.7，4.3Hz，H-3)，3.73(1H，dd，J=11.7，5.3Hz，H-3)；一个甲氧基质子信号δ3.92(3H，s)。碳谱给出10个碳信号，在低场区有6个为芳香碳信号和一个羰基碳信号δ199.7(C=O)，高场区给出一个连氧次甲基碳信号和一个连氧亚甲基碳信号δ76.8(C-2)，66.3(C-3)，推测该化合物为芳基酮类化合物。根据以上数据该化合物鉴定为2,3-二羟基-1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙-1-酮(2，3-dihydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxy phenyl)propan-1-one)。 

化合物13：白色针晶(甲醇)，在365nm下有荧光，暗示该化合物为香豆素类化合物。该化合物分子式为C₁₀H₈O₄。氢谱的低场区给出一组AB偶合系统的烯氢信号δ7.84(1H，d，J=9.5Hz，H-4)，6.19(1H，d，J=9.5Hz，H-3)；两个孤立的芳香质子信号δ7.09(1H，s，H-5)，6.76(1H，s，H-8)；一个甲氧基质子信号δ3.91(3H，s，6-OCH₃)。碳谱给出10个碳信号，除了一个甲氧基碳信号δ56.9(6-OCH₃)，其余9个碳信号在低场，为sp²杂化的碳信号，属于典型的香豆素类化合物的碳信号，其中包括一个酯羰基碳信号δ164.1(C-2)；两个邻二连氧取代的芳香碳信号δ153.0(C-7)，147.1(C-6)；两个烯键碳信号δ146.1(C-4)，110.1(C-3)。根据以上数据该化合物鉴定为东莨菪素(scopoletine)。 

化合物14：白色针晶(甲醇)，在365nm下有荧光，暗示该化合物为香豆素类化合物。该化合物分子式为C₁₆H₁₈O₉。氢谱的低场区给出一组AB偶合系统的烯氢信号δ7.89(1H，d，J=9.4Hz，H-4)，6.30(1H，d，J=9.4Hz，H-3)；两个孤立的芳香质子信号δ7.20(1H，s，H-5)，7.17(1H，s，H-8)；一个甲氧基质子信号δ 3.91(3H，s，6-OCH₃)；一个葡萄糖端基质子信号δ5.06(1H，d，J=7.6Hz，Glc-H-1)；在δ3.41-3.54还给出一组葡萄糖质子信号。推测该化合物为香豆素苷类化合物。碳谱给出16个碳信号，其中6个碳信号归属为葡萄糖碳信号，9个碳信号为香豆素类苷元碳信号，剩余一个碳信号为甲氧基碳信号。与化合物13比较，发现化合物14是化合物13的葡萄糖苷，综上所述，该化合物被鉴定为东莨菪苷(scopoloside)。 

3、α-葡萄糖苷酶抑制活性分析 

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)是一类能够从含有α-葡萄糖苷键底物的非还原端催化水解α-葡萄糖基的酶的总称，包括麦芽糖酶(α-D-glucosidase glucohydrolase)、异麦芽糖酶(dextrin 6-α-D-glucanchydolase)、蔗糖酶(sucrase，α-D-glucohydrolase)和海藻糖酶(trehalase，α-trehalase glucohydrolase)等，这些酶首先从猪肠粘膜中分离得到，随后从人体组织中也制备得到。 

α-葡萄糖苷酶广泛分布于生物体中，在机体的代谢过程中起着非常重要的作用，参与食物消化、糖蛋白的生物合成，多糖及糖复合物的合成与分解代谢等许多生物过程。如果这些α-糖苷酶的酶活力受到了影响，体内的正常代谢就会破坏。糖尿病、肥胖症、高血脂、炎症、癌变、免疫反应和病毒感染等都和细胞表面的复合糖质有密切关系，而复合糖质的形成又和α-葡萄糖苷酶的存在有一定的联系。因此，开发出适当的α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物，调节α-葡萄糖苷酶的活性，可以治疗很多疾病，具有广阔的应用前景。 

4、α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物的应用 

4.1α-葡萄糖苷酶抑制与糖尿病 

α-葡萄糖苷酶是碳水化合物消化吸收的一类关键酶^[15]。α-葡萄糖苷酶具有寡糖和双糖的结合位点。淀粉在消化道内分解为低聚糖，最终经小肠绒毛上皮细胞刷状缘存在的膜结合酶：麦芽三糖及双糖类水解酶(α-葡萄糖苷酶、蔗糖酶、麦芽糖酶)等分解为单糖。葡萄糖、乳糖、麦芽糖等直接经由刷状缘膜存在的Na⁺依赖性机制(Na⁺糖载体)；果糖则经扩散作用通过细胞膜进入细胞内。然后通过侧基底膜存在的运输载体排出，再被上皮细胞下丰富的毛细血管网吸收^[16]。具体过程为：食物中的多糖，如淀粉经口腔唾液、胰淀粉酶消化成含少数葡萄糖分子的低聚糖，α-葡萄糖苷酶便从这些低聚糖的非还原末端切开α-1，4糖苷键，释 放出葡萄糖。葡萄糖被小肠上皮细胞吸收后进入血液，成为血糖。在生理状态下，小肠上、中、下三段均存在α-葡萄糖苷酶，但以小肠上段为吸收的主要部位，因此人体对糖的吸收迅速而完善。 

α-葡萄糖苷酶抑制剂主要作用机理为通过抑制α-葡萄糖苷酶活性，使低聚糖类在小肠上段的分解和吸收被抑制，而仅在中、下段进行，故糖类降解减少，吸收面积减少，吸收时间后延，使餐后血糖曲线较为平稳，从而降低餐后高血糖。拜糖平和米格列酮两种α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物，均与α-葡萄糖苷酶活性部位发生竞争性结合，阻滞消化过程中肠道的α-葡萄糖苷酶将双糖分解为单糖，从而延缓碳水化合物的消化和吸收，起到了少食多餐的作用。将原本在十二指肠和空肠上部进行的吸收过程推迟到了小肠的中下部，从而可避免饭后血糖迅速上升，抑制饭后高血糖和胰岛素过度分泌，减少患者血糖波动幅度，改善其血糖稳定指数，对高胰岛素血症及高甘油血症患者也有一定的改善作用。α-葡萄糖苷酶抑制剂在延缓碳水化合物的消化和吸收的同时不抑制蛋白质和脂肪的吸收，一般不引起营养吸收障碍。α-葡萄糖苷酶抑制剂与酶结合的时间大约是4-6小时，此后酶的活性又可以恢复。目前其他各种口服降糖药及胰岛素治疗未能避免餐后高血糖的发生，因为很难控制药物作用与食物的消化吸收在时间上的相互对应，餐后总会有某些时间里血糖过高，长期积累可引起糖化蛋白终末产物(AGE)堆积，导致各种并发症。与之相比较，α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物可减少葡萄糖的毒性作用，可能使胰岛素分泌得到改善。因此α-葡萄糖苷酶抑制剂以独特的优势成为临床治疗II型糖尿病治疗的首选药和I型糖尿病的胰岛素治疗的辅助药物。 

4.2α-葡萄糖苷酶抑制剂与病毒感染 

在艾滋病发生发展过程中，HIV逆转录酶是关键部位，HIV-1包膜糖蛋白的合成需要α-葡萄糖苷酶对寡糖进行加工，α-葡萄糖苷酶抑制剂可使包膜糖蛋白前体因在内质网内进行N-糖基化时发生错误折叠而停留在内质网，干扰病毒的组装，因此α-葡萄糖苷酶抑制剂可以阻止病毒的感染，从而阻止HIV-1在淋巴细胞和单核细胞之间传播，减少感染细胞和未感染细胞之间的合体细胞的形成，α-葡萄糖苷酶抑制剂可以用来开发防治艾滋病药物。 

4.3α-葡萄糖苷酶抑制剂与肿瘤 

将α-葡萄糖苷酶抑制剂野尻霉素及其十种结构类似物添加于肿瘤鼠中，显示 出不同程度的抗肿瘤活性，另一种抑制剂castanospermine可改变内皮细胞糖基化，防止肿瘤细胞的转移^[17]。体内研究表明，抑制剂影响了N连接糖蛋白复合物的形成，使老鼠肿瘤转移被抑制。研究表明，血管的生成需要特定的细胞寡糖，抑制剂改变内细胞上与之相关的某些结构，有抑制肿瘤生长的可能，α-葡萄糖苷酶抑制剂有望开发成以阻止肿瘤血管生长为目标的抗肿瘤药物^[18]。 

5、粗提物与14个单体化合物α-葡萄糖苷酶抑制活性研究 

5.1待测样品来源 

枸杞籽提取过程中的粗提物和从枸杞籽中分离得到的14个单体化合物。待测试的样品在实验前用DMSO溶解，测试时再用磷酸盐缓冲液稀释配制成所需的各种浓度。 

5.2α-葡萄糖苷酶活性实验操作方法 

A样品组(Sample) 

(1)加入25μl各种浓度的样品溶液后，加入25μlα-葡萄糖苷酶，再加入175μl磷酸盐缓冲液，然后在混合器上混合10分钟后。 

(2)加入25μl底物：4-硝基酚-2-D-吡喃葡萄糖苷(缩写PNPG)后，在混合器上混合5分钟(启动反应，反应体系总体积是250μl)。 

(3)放入保温箱，37°C，15分钟后， 

(4)加入1M Na₂CO₃ 50μl终止反应， 

(5)在波长405nm处测定吸收值。 

B阴性对照组(Negative control)则将25μl各种浓度的样品溶液换成25μl磷酸盐缓冲液，其他不变。 

C空白组(Blank)将25μl各种浓度的样品溶液和25μl α-葡萄糖苷酶都换成磷酸盐缓冲液。 

D样品对照组(Sample blank)则是将25μl α-葡萄糖苷酶和25μl底物(缩写PNPG)都换成磷酸盐缓冲液。 

计算公式 

$I=\frac{({\mathrm{OD}}_{\mathrm{Negative\; control}}-{\mathrm{OD}}_{\mathrm{Blank}})-({\mathrm{OD}}_{\mathrm{Sample}}-{\mathrm{OD}}_{\mathrm{Sample\; blank}})}{{\mathrm{OD}}_{\mathrm{Negative\; control}}-{\mathrm{OD}}_{\mathrm{Blank}}}*100\%$

I：代表抑制率 

5.3实验结果 

5.3.1粗提物的测试结果：枸杞籽的甲醇总提取物具有抗α-葡萄糖苷酶活性，IC50为2.33mg/mL。将甲醇总提取物加水溶解后，分别用等体积的正己烷、乙酸乙酯萃取后得到的正己烷提取物、乙酸乙酯提取物比甲醇提取物具有更强的α-葡萄糖苷酶活性，IC50分别为2.11mg/mL，1.57mg/mL。剩下的水层经大孔树脂柱处理，得到的甲醇洗脱物也表现出较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50为1.89mg/mL。 

5.3.214个单体化合物的活性测试结果：化合物1，2，3，6，7表现出较强的的-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50分别为0.32，0.60，0.60，0.46，0.56Mm；化合物4，5，13表现出中等程度的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50分别为1.02，1.14，1.46mM；化合物9，11，12，14表现出较弱的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50分别为5.47，3.31，4.24，4.23m；化合物8，10未表现出α-葡萄糖苷酶抑制活性。 

5.3.3香豆酰酪胺类化合物1，2，3，4，5均有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。化合物1抑制活性比化合物2强一倍，说明此类化合物中反式双键对α-萄糖苷酶活性抑制的贡献作用大于顺式双键；化合物3抑制活性比化合物1弱一倍，与化合物2抑制活性相当，说明酚酸部分引入3-OCH3减弱α-葡萄糖苷酶抑制活性；化合物4，5分别为化合物3的二倍体，抑制活性均比化合物3弱一倍。 

5.3.4已有文献报道对羟基苯乙胺类化合物表现出很弱或者无α-葡萄糖苷酶抑制活性；并且本实验中发现对羟基桂皮酸(10)也未表现出α-葡萄糖苷酶抑制活性；推测二者脱水而成的酰胺基团是香豆酰酪胺类化合物抑制α-葡萄糖苷酶活性的必要基团。 

Claims (4)

1.一种从枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣中提取α-葡萄糖苷酶活性抑制剂的方法，其提取步骤为：枸杞籽及其提取枸杞油后的残渣经甲醇超声提取3次，合并提取液，减压干燥得甲醇总提取物，将甲醇总提取物加水溶解后，分别用等体积的正己烷、乙酸乙酯萃取3次，减压回收溶剂，得正己烷提取物、乙酸乙酯提取物；剩下的水层经大孔树脂柱处理，甲醇洗脱，得甲醇洗脱物、水洗脱物，采取α-葡萄糖苷酶活性体系追踪，发现正己烷提取物、乙酸乙酯提取物、甲醇洗脱物均表现出一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，将上述三种提取物经硅胶柱色谱，ODS柱色谱以及高效液相制备色谱分离得到14个化合物，分别为N-反式-香豆酰酪胺(N-(p-trans-coumaroyl)tyramine)(1)、N-顺式-香豆酰酪胺(N-(p-cis-coumaroyl)tyramine)(2)、N-反式-对羟基苯乙基阿魏酰胺(N-p-trans-hydroxyphenethyl ferolamine)(3)、大麻酰胺己(cannabisin F)(4)、大海米酰胺(grossamide)(5)、芥子醛(sinapaldehyde)(6)、阿魏醛(ferulaldehyde)(7)、对羟基苯甲醛(p-hydroxy benzaldehyde)(8)、香草酸(vanillic acid)(9)、对香豆酸(trans-p-hydroxycinnamic acid)(10)、3-羟基-1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙-1-酮(3-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)propan-1-one)(11)、2，3-二羟基-1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙-1-酮(2，3-dihydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)propan-1-one)(12)、东莨菪素(scopoletine)(13)，东莨菪苷(scopoloside)(14)。

2.如权利要求1所述抑制剂在制备治疗糖尿病的药物中的应用，是将其用作临床治疗II型糖尿病治疗的首选药和I型糖尿病的胰岛素治疗的辅助药物。

3.如权利要求1所述抑制剂在制备预防艾滋病的药物中的应用，是将其用作预防艾滋病的辅助药物。

4.如权利要求1所述抑制剂在制备抗肿瘤的药物中的应用，是将其用作阻止肿瘤血管生长的抗肿瘤药物。

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