CN102050852B - 2”-o-鼠李糖基当药素及其类似物的制备和其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及2”-O-鼠李糖基当药素及其类似物的制备和其用途。所述2”-O-鼠李糖基当药素及其类似物可显著增强葡萄糖转运蛋白GLUT4的转位作用，促进葡萄糖的吸收和利用，显著抑制血糖升高，可单独应用或与医学上可接受的药用辅料组成药物组合物或制剂，作为抗II型糖尿病及其并发症药物，经胃肠道或不经胃肠道途径施用。其制备方法包括从天然植物原料中分离及化学合成等手段，经粉碎、溶剂提取、弱极性大孔吸附树脂分离、聚酰胺色谱柱分离、葡聚糖凝胶色谱柱分离、半制备型高效液相色谱仪纯化等工艺制成。
Description
技术领域
本发明涉及2”-O-鼠李糖基当药素及其类似物的制备和其用途，特别是涉及从天然植物中分离纯化得到的2”-O-鼠李糖基当药素及其类似物在制备用于治疗II型糖尿病及其并发症的药物中的应用，属于天然药物化学领域。
背景技术
本发明所研究的是鸢尾科射干属植物射干Belamcanda chinensis(L.)DC.的叶。射干的根茎为常用传统中药，始载于《神农本草经》。全国各地均有栽培。射干药材性味苦寒，入肝、肺经，具有清热解毒、利咽消炎的功效，主要用于咽痛肺痈、痰咳气喘等症，为治疗喉痹咽痛之要药。
目前研究较多的是射干的根茎。主要药理作用有抗炎、抗病毒、抑菌、消除自由基、利胆、抗腹泻、抗血栓、抑制TXA2(血栓素A2)合成和促进PGI2(前列环素)生成等，但尚未见到关于射干叶中分离纯化得到的2”-O-鼠李糖基当药素及其类似物作为治疗II型糖尿病及其并发症的药物用途方面的报道。
糖尿病是一种常见的内分泌疾病，是一种由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症。由于胰岛素分泌绝对或相对不足或靶细胞对胰岛素敏感性减低，引起以糖代谢紊乱为主，继发脂肪、蛋白质、水、电解质代谢障碍，临床以高血糖为主要共同标志，久病可引起多个系统损害，病情严重和应激时可发生急性代谢紊乱如酮症酸中毒等。糖尿病人发生冠心病、缺铁性或出血性脑血管病、失明、肢端坏疽等严重并发症的比例均明显高于非糖尿病人群。
目前一般将糖尿病分为两类，I型糖尿病(又称胰岛素依赖型糖尿病)和II型糖尿病(又称非胰岛素依赖型糖尿病)。世界各地的糖尿病患者中有90％的人患有II型糖尿病。据世界卫生组织估计，到2030年，全世界糖尿病患者的数目将上升为3.6亿人以上。
胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足是II型糖尿病的两个主要病理生理特点，尽管两者在糖尿病发病中的原发作用、具体机制尚不清楚，但葡萄糖转运异常可能构成其共同基础。大量研究已证明，胰岛素抵抗的主要病理改变之一是指脂肪细胞和骨骼肌细胞内胰岛素信号通路受损致GLUT4(葡萄糖转运蛋白4)转位障碍。
GLUT4属于葡萄糖转运蛋白家族。GLUT4表达于胰岛素敏感的脂肪细胞(如白色及褐色脂肪)和肌肉细胞(如骨胳肌和心肌)，是其主要胞膜转运蛋白，对胰岛素反应敏感而迅速并快速增加葡萄糖转运。研究发现，高脂饮食可下调大鼠白色脂肪组织的GLUT4水平，并明显抑制受胰岛素调控的脂肪细胞GLUT4的转位及对葡萄糖的摄取，而运动训练可提高胰岛素抵抗状态下脂肪细胞和骨骼肌中GLUT4的含量，促进脂肪细胞和肌肉组织对葡萄糖的转运和利用，从而改善糖耐量异常和胰岛素抵抗。并且研究还发现病理性破坏小鼠肌肉中GLUT4基因，这些小鼠出现严重的葡萄糖转运障碍，并且早期就导致严重的胰岛素抵抗和葡萄糖耐量减退，而内源性增加GLUT4的表达可改善db/db鼠糖尿病血糖情况。因此，GLUT4是维持体内葡萄糖正常代谢的一个关键蛋白。
在基础状态下，血胰岛素处于低水平，绝大部分GLUT4位于胞浆内，此时葡萄糖转运吸收减少；然而当进餐后，血糖升高，血胰岛素释放增加，胰岛素分别作用于脂肪细胞和肌细胞胰岛素受体，通过受体后信使与膜通道转运蛋白的信息交流，使GLUT4重新分布于细胞表面，促进细胞对葡萄糖的吸收和利用，同时降低血糖水平。GLUT4在促进葡萄糖吸收和利用上起关键限速作用。在II型糖尿病症状中，由于胰岛素抵抗，GLUT4不受胰岛素调控转运血液中的葡萄糖进入细胞，导致血糖水平居高不下。因此，该蛋白以及调控该蛋白膜转移的信号通路成为抗糖尿病药物开发的一个领域。
发明内容
本发明人通过对天然植物鸢尾科射干属植物射干的叶进行研究，通过分离提纯制备得到2”-O-鼠李糖基当药素及其一系列类似物，发现这些化合物对GLUT4转位具有显著的促进作用，进而可用于治疗II型糖尿病及其并发症。
因此，本发明的目的是提供一类2”-O-鼠李糖基当药素及其类似物和包含2”-O-鼠李糖基当药素及其类似物的药物组合物在制备治疗II型糖尿病及其并发症的药物中的用途。
本发明的另一个目的是提供一种2”-O-鼠李糖基当药素及其类似物的制备方法。
根据本发明的技术方案，本发明提供的一类2”-O-鼠李糖基当药素及其类似物具有如下式(I)所示的结构：
其中：
R1表示H、鼠李糖基、葡萄糖基或寡糖基；
R2表示H、CH3、CH2CH3或糖基；
R3表示H、CH3、CH2CH3或糖基；
R4表示H、OH或糖基；
R5表示H、OH或糖基；
R6表示H或糖基。
所述2”-O-鼠李糖基当药素的结构如式(II)：
R1表示鼠李糖基，R2表示H，R3表示CH3，R4表示H，R5表示H，R6表示H。
所述2”-O-鼠李糖基当药素类似物可以是如下结构之一：
1.当药素，结构如式(III)：
R1表示H，R2表示H，R3表示CH3，R4表示H，R5表示H，R6表示H。
2.2”-O-鼠李糖基异牡荆素，结构如式(IV)：
R1表示鼠李糖基，R2表示H，R3表示H，R4表示H，R5表示H，R6表示H。
3.异牡荆素，结构如式(V)：
R1表示H，R2表示H，R3表示H，R4表示H，R5表示H，R6表示H。
本发明所述2”-O-鼠李糖基当药素及其类似物不仅仅限于上述结构式(II)～(V)所示，还应包括式(I)所代表的其他化合物。
本发明所述2”-O-鼠李糖基当药素及其类似物包括但不限于通过从天然物中分离、化学合成或是在一个2”-O-鼠李糖基当药素类似物的基础上进行结构修饰或生物转化得到。以下是从天然植物中分离制备2”-O-鼠李糖基当药素及其类似物的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)将天然植物鸢尾科射干的叶切成小段或粉碎，得到射干叶碎片；
(2)将射干叶碎片进行提取及初步分离，所述的提取及初步分离方法是指包括水提及初步分离、醇提及初步分离或有机溶剂提取及初步分离在内的方法之一，所述弱极性大孔吸附树脂包括但不限于HP20、AB-8；
水提及初步分离法指：按射干的叶与水的重量体积比为1∶1～1∶20加水，加热回流提取0.5～2小时，过滤，滤渣重复以上操作1～5次，合并滤液，所得滤液可适当浓缩至无沉淀出现，滤液用弱极性大孔吸附树脂进行分离，用30％～50％乙醇水溶液洗脱，回收溶剂得浸膏；水提及初步分离法又指：按射干的叶与水的重量体积比为1∶1～1∶20加水，加热回流提取0.5～2小时，过滤，滤渣重复以上操作1～5次，合并滤液，回收溶剂至射干的叶与水的重量体积比为1∶1～1∶10，加乙醇至含醇量为70％～90％，静置，过滤，得到滤液，减压回收溶剂至无醇味，并加水稀释至射干的叶与溶剂的重量体积比为1∶1～1∶30，过滤，滤液用弱极性大孔吸附树脂进行分离，用30％～50％乙醇水溶液洗脱，回收溶剂得浸膏；
醇提及初步分离法指：按射干的叶与乙醇的重量体积比为1∶1～1∶20加60％以下浓度的乙醇，加热回流提取0.5～2小时，过滤，滤渣重复以上操作1～5次，合并滤液，回收溶剂至射干的叶与水的重量体积比为1∶1～1∶10，加乙醇至含醇量为70％～90％，静置，过滤，得到滤液，减压回收溶剂至无醇味，并加水稀释至射干的叶与溶剂的重量体积比为1∶1～1∶30，过滤，滤液用弱极性大孔吸附树脂进行分离，用30％～50％乙醇水溶液洗脱，回收溶剂得浸膏；醇提及初步分离法又指：按射干的叶与乙醇的重量体积比为1∶1～1∶20加60％～100％的乙醇，加热回流提取0.5～2小时，过滤，滤渣重复以上操作1～5次，合并滤液，减压回收溶剂至无醇味，并加水稀释至射干的叶与溶剂的重量体积比为1∶1～1∶30，过滤，滤液用弱极性大孔吸附树脂进行分离，用30％～50％乙醇水溶液洗脱，回收溶剂得浸膏；
有机溶剂提取及初步分离法指：按射干的叶与有机溶剂的重量体积比为1∶1～1∶50加有机溶剂，加热回流提取0.5～5小时，过滤，滤渣重复以上操作1～5次，合并滤液，减压回收溶剂至有机溶剂挥干，并加水稀释至射干的叶与溶剂的重量体积比为1∶1～1∶30，过滤，滤液用弱极性大孔吸附树脂进行分离，用30％～50％乙醇水溶液洗脱，回收溶剂得浸膏，其中，有机溶剂包括但不限于甲醇、正丁醇、乙酸乙酯、丙酮；
(3)浸膏采用聚酰胺色谱柱进行分离，以蒸馏水或50％以下乙醇水溶液洗脱，用聚酰胺薄层色谱法跟踪相应组分的洗脱情况，相同斑点组分施行合并，减压回收溶剂至无醇味，冷冻干燥，称重，得粗分产物，用HPLC分析粗分产物的纯度，如果粗分产物纯度大于60％，则可认作等同于细分产物直接进入步骤(5)操作；如果粗分产物纯度小于60％，则进入步骤(4)操作；
(4)粗分产物用蒸馏水或50％以下甲醇水溶液充分溶解，用Sephadex LH-20型葡聚糖凝胶色谱柱进行分离，蒸馏水或50％以下甲醇水溶液洗脱，用聚酰胺薄层色谱法跟踪相应组分的洗脱情况，相同斑点组分施行合并，减压回收溶剂至呈固状物，冷冻干燥，精密称重，得细分产物；
(5)细分产物用50％～100％甲醇水溶液充分溶解，用半制备型高效液相色谱仪，以ODS为固定相，以40％～80％甲醇水溶液或10％～50％乙腈水溶液为流动相，进行纯化，用分析型高效液相色谱法检测纯度，纯度大于98％的组分施行合并，减压回收溶剂至呈固状物，冷冻干燥，精密称重，得纯化合物，即本发明2”-O-鼠李糖基当药素及其类似物。
本发明2”-O-鼠李糖基当药素及其类似物作为治疗II型糖尿病及其并发症的药物，可以显著增强葡萄糖转运蛋白GLUT4的转位作用，促进葡萄糖的吸收和利用，显著抑制糖尿病患血糖的升高，从而治疗糖尿病及其并发症。
2”-O-鼠李糖基当药素或其类似物可用于使其发挥作用的各种给药途径，包括经胃肠道或不经胃肠道途径施用。例如可以口服、皮下、肌肉内、静脉内、透皮、鼻内、直肠内等方式给药。制药领域的普通技术人员可以根据针对疾病状况所选的2”-O-鼠李糖基当药素或其类似物的特性、疾病的状态和其他相关情况，选择施用的适当形式和方式。
本发明还提供了上述2”-O-鼠李糖基当药素或其类似物与医学上可接受的药用辅料组成的药物组合物或其制剂；所述的制剂包括各种类型的丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服剂、注射剂，以及临床上适宜的其它剂型；所述的制剂含有必要的附加剂，包括填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、pH调节剂，它们的比例和特性由其溶解性和化学特性、所选的给药途径和标准的制药实际来决定。
本发明的2”-O-鼠李糖基当药素或其类似物可以单独或与其药物组合物或其制剂形式施用治疗治疗II型糖尿病及其并发症。
具体实施方式
为了充分说明本发明的特性以及实施本发明的方式，下面给出实施例。
实施例1 2”-O-鼠李糖基当药素的制备及结构鉴定
1.2”-O-鼠李糖基当药素的制备
(1)取射干叶2kg，切成小段；
(2)射干叶碎片中加入20L蒸馏水，加热回流提取1小时，过滤，滤渣重复以上操作2次，合并滤液，回收溶剂至5L，加乙醇至含醇量为70％，静置，过滤，得到滤液，减压回收溶剂至无醇味，并加水稀释至20L，过滤，滤液用HP20型大孔吸附树脂进行分离，用40％乙醇水溶液洗脱，回收溶剂得干浸膏约50g；
(3)50g浸膏采用聚酰胺色谱柱进行分离，用30％乙醇水溶液洗脱，用聚酰胺薄层色谱法跟踪相应组分的洗脱情况，与2”-O-鼠李糖基当药素对照品比移值相同的斑点组分施行合并，减压回收溶剂至无醇味，冷冻干燥，称重，得粗分产物约6g；
(4)粗分产物用25％甲醇水溶液充分溶解，用Sephadex LH-20型葡聚糖凝胶色谱柱进行分离，用25％甲醇水溶液洗脱，用聚酰胺薄层色谱法跟踪相应组分的洗脱情况，与2”-O-鼠李糖基当药素对照品比移值相同的斑点组分施行合并，减压回收溶剂至呈固状物，冷冻干燥，精密称重，得细分产物2.57g；
(5)细分产物用50％甲醇水溶液充分溶解，用半制备型高效液相色谱仪，以ODS为固定相，以45％甲醇水溶液为流动相，进行纯化，用分析型高效液相色谱法检测纯度，纯度大于98％的组分施行合并，减压回收溶剂至呈固状物，冷冻干燥，精密称重，得纯化合物1.78g，经过结构鉴定，最终确定该化合物为”-O-鼠李糖基当药素。
2.2”-O-鼠李糖基当药素的结构鉴定
2.1理化性质
浅黄色针晶，mp.260-261℃。盐酸-镁粉反应：显红色。三氯化铝显色反应：黄色荧光。分子式：C28H32O14。
2.2波谱数据
UVλmax(nm)：269，337(MeOH)。
ESI-MS：m/z 593.1[M+H]+，m/z 447.0[M-rha+H]+。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：7.99(2H，d，J＝8.8Hz，2’，6’-H)；6.95(2H，d，J＝8.8Hz，3’，5’-H)；6.85(1H，s，8-H)；6.33(s，3-H)。
13CNMR(100MHz，DMSO-d6)：181.8(C-4)，164.7(C-7)，163.3(C-2)，162.5(C-4’)，160.3(C-5)，156.8(C-9)，128.5(C-2’，6’)，120.0(C-1’)，116.4(C-3’，C-5’)，109.8(C-6)，104.8(C-10)，102.6(C-3)，100.3(C-1″′)，90.1(C-8)，81.6(C-5″)，80.0(C-3″)，76.2(C-2″)，74.6(C-4″′)，71.7(C-1″)，71.2(C-3″′)，70.9(C-2″′)，70.6(C-4″)，68.2(C-5″′)，61.7(C-6″)，56.6(-OCH3)，18.0(-CH3)。
实施例2 2”-O-鼠李糖基当药素增强小鼠GLUT4转位作用实验
1.样品
2”-O-鼠李糖基当药素(实施例1制备得到的)
2.试剂
胶原酶VIII，牛血清第五组分，兔抗GLUT4(一抗)，羊抗兔-HRP(二抗)，二溴乙胺，其它药品均为分析纯。
3.实验方法
将样品加到小鼠脂肪细胞悬液中，37℃水浴温育40min后，细胞悬液在4℃下超声破碎，离心(3000×g，15min，4℃)，弃去表面悬浮的白色脂肪层，悬液继续离心(12000×g，25min，4℃)，沉淀用Medium I(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，250mM蔗糖，pH＝7.4)稀释成溶液作为待测的细胞膜样品溶液。
GLUT4的含量采用Western blot的方法测定，其具体操作如下：
(1)电泳：采用分离胶浓度为10％，浓缩胶5％进行蛋白分离富集，浓缩胶80V电压，分离胶120V电压，冰浴中电泳大约1.5h，进行转膜；
(2)转膜：将滤纸、海绵、胶、膜、海绵、滤纸等三明治夹层安装好，正负极放到电转移装置，倒入电转移缓冲液，进行电转移，15V、30mA、冰浴条件下电转移4h，然后用丽春红检验蛋白是否转移到膜上；
(3)封闭：将膜放入5％的脱脂奶粉中，4℃，封闭一夜；
(4)与一抗的反应：将封闭好的膜加入一抗，37℃温育2h；
(5)与二抗的反应：用TBS缓冲液对用一抗温育过的膜进行漂洗，漂洗三次，每次10分钟，然后加入二抗，于37℃温育1h；
(6)底物显色：TBS漂洗二抗温育过的膜，漂洗三次，每次10分钟，然后加入底物进行显色，定量，拍照保存。
4.结果
实验数据见表1。表1为体外实验研究2”-O-鼠李糖基当药素增强小鼠脂肪细胞GLUT4转位作用的结果，表示GLUT4含量与加药量的关系。
表1 2”-O-鼠李糖基当药素对GLUT4的转位影响
注：*P＜0.05，**P＜0.01，具有显著性差异
结果表明2”-O-鼠李糖基当药素显著增强了小鼠脂肪细胞GLUT4转位作用。
实施例3 2”-O-鼠李糖基当药素对糖尿病大鼠血糖的影响
1.动物造模
选用成年雄性大鼠50只，体重200±10g，实验前禁食不禁水12h后，尾静脉注射四氧嘧啶，剂量为35mg/kg，次日重复以上操作一次，实验环境要求25℃恒温，于注射四氧嘧啶的第七天尾部取血，用血糖仪测禁食12h后大鼠的空腹血糖值，以空腹血糖浓度大于11.1mmol/L的大鼠作为糖尿病大鼠，另设一组正常大鼠作空白对照，对照组尾静脉注射生理盐水10mL/kg。
2.分组、给药及指标测定
选造模成功的30只大鼠分成三组，分别为模型对照组、阳性对照组和给药组，每组各10只，阳性对照组按230mg/kg的剂量每天灌胃给予消渴丸1次，给药组按50mg/kg的剂量每天灌胃给予2”-O-鼠李糖基当药素(实施例1制备得到的)1次，连续给药15天，每5天称体重1次，于第5天、第10天断尾取血，用血糖仪测禁食12h的大鼠血糖值，末次给药后40min测血糖值。
3.结果
结果显示，给药前模型组与给药组大鼠的血糖值无显著性差异(P＞0.05)；给药15天时，2”-O-鼠李糖基当药素可显著抑制给药组糖尿病大鼠血糖升高(P＜0.05或P＜0.01)。结果见表2。
表2 2”-O-鼠李糖基当药素对糖尿病大鼠血糖的影响(X±S)
注：模型组与空白对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01
给药组与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01
实施例4 2”-O-鼠李糖基当药素对糖尿病大鼠血清胰岛素的影响
1.动物造模
选用成年雄性大鼠50只，体重200±10g，实验前禁食不禁水12h后，尾静脉注射四氧嘧啶，剂量为35mg/kg，次日重复以上操作一次，实验环境要求25℃恒温，另设一组正常大鼠作空白对照，对照组尾静脉注射生理盐水10mL/kg。
2.分组、给药及指标测定
选造模成功的30只大鼠分成三组，分别为模型对照组、阳性对照组和给药组，每组各10只，阳性对照组按230mg/kg的剂量每天灌胃给予消渴丸1次，给药组按50mg/kg的剂量每天灌胃给予2”-O-鼠李糖基当药素(实施例1制备得到的)1次，连续给药15天，第15天给药后40min眼眶取血，用于测定血清胰岛素浓度。
用放免法测定血清胰岛素，结果显示，用四氧嘧啶造模后能引起血清胰岛素的降低(空白对照组17.70±8.93，模型组3.49±1.90，##P＜0.01)，给药15天后，给药组大鼠的血清胰岛素浓度显著降低，说明2”-O-鼠李糖基当药素对β细胞损伤造成的胰岛素缺乏具有一定治疗作用；同样实验条件下，阳性对照药连续灌胃给药15天后，阳性对照组大鼠的血清胰岛素浓度液显著降低(8.61±3.95，P＜0.05)。结果见表3。
表3 2”-O-鼠李糖基当药素对糖尿病大鼠血清胰岛素的影响(X±S)
注：模型组与空白对照组比较##P＜0.01
给药组与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01
实施例5 当药素的制备及结构鉴定
1.当药素的制备
(1)取射干叶2kg，切成小段；
(2)射干叶碎片中加入20L蒸馏水，加热回流提取1小时，过滤，滤渣重复以上操作2次，合并滤液，回收溶剂至5L，加乙醇至含醇量为70％，静置，过滤，得到滤液，减压回收溶剂至无醇味，并加水稀释至20L，过滤，滤液用HP20型大孔吸附树脂进行分离，用40％乙醇水溶液洗脱，回收溶剂得干浸膏约50g；
(3)50g浸膏用聚酰胺色谱柱进行分离，用30％乙醇水溶液洗脱，用聚酰胺薄层色谱法跟踪相应组分的洗脱情况，与当药素对照品比移值相同的斑点组分施行合并，减压回收溶剂至无醇味，冷冻干燥，称重，得粗分产物约9g；
(4)粗分产物用45％甲醇水溶液充分溶解，用Sephadex LH-20型葡聚糖凝胶色谱柱进行分离，用45％甲醇水溶液洗脱，用聚酰胺薄层色谱法跟踪相应组分的洗脱情况，与当药素对照品比移值相同的斑点组分施行合并，减压回收溶剂至呈固状物，冷冻干燥，精密称重，得细分产物7.67g；
(5)细分产物用55％甲醇水溶液充分溶解，用半制备型高效液相色谱仪，以ODS为固定相，以55％甲醇水溶液为流动相，进行纯化，用分析型高效液相色谱法检测纯度，纯度大于98％的组分施行合并，减压回收溶剂至呈固状物，冷冻干燥，精密称重，得纯化合物4.75g，经过结构鉴定，最终确定该化合物为当药素。
2.当药素的结构鉴定
2.1理化性质
浅黄色粉末，mp.225-228℃。盐酸-镁粉反应：显红色。三氯化铝显色反应：黄色荧光。分子式：C22H22O10。
2.2波谱数据
UVλmax(nm)：269，337(MeOH)。
HRFAB-MS：m/z 445.11[M-H]-。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：7.99(2H，d，J＝8.gHz，2′，6′-H)；6.96(2H，d，J＝8.8Hz，3′，5′-H)；6.86(1H，s，8-H)；6.83(s，3-H)。
13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)：182.2(C-4)，164.9(C-7)，163.9(C-2)，161.3(C-4’)，160.3(C-5)，156.8(C-9)，128.5(C-2’，6’)，121.0(C-1’)，116.0(C-3’，C-5’)，109.7(C-6)，104.6(C-10)，103.0(C-3)，91.0(C-8)，81.9(C-5″)，79.1(C-3″)，72.8(C-2″)，70.9(C-1″)，69.6(C-4″)，61.8(C-6″)，56.5(-OCH3)。
实施例6 当药素增强小鼠GLUT4转位作用实验
1.样品
当药素(实施例5制备得到的)
2.试剂
胶原酶VIII，牛血清第五组分，兔抗GLUT4(一抗)，羊抗兔-HRP(二抗)，二溴乙胺，其它药品均为分析纯。
3.实验方法
将样品加到小鼠脂肪细胞悬液中，37℃水浴温育40min后，细胞悬液在4℃下超声破碎，离心(3000×g，15min，4℃)，弃去表面悬浮的白色脂肪层，悬液继续离心(12000×g，25min，4℃)，沉淀用Medium I(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，250mM蔗糖，pH＝7.4)稀释成溶液作为待测的细胞膜样品溶液。
GLUT4的含量采用Western blot的方法测定，其具体操作如下：
(1)电泳：采用分离胶浓度为10％，浓缩胶5％进行蛋白分离富集，浓缩胶80V电压，分离胶120V电压，冰浴中电泳大约1.5h，进行转膜；
(2)转膜：将滤纸、海绵、胶、膜、海绵、滤纸等三明治夹层安装好，正负极放到电转移装置，倒入电转移缓冲液，进行电转移，15V、30mA、冰浴条件下电转移4h，然后用丽春红检验蛋白是否转移到膜上；
(3)封闭：将膜放入5％的脱脂奶粉中，4℃，封闭一夜；
(4)与一抗的反应：将封闭好的膜加入一抗，37℃温育2h；
(5)与二抗的反应：用TBS缓冲液对用一抗温育过的膜进行漂洗，漂洗三次，每次10分钟，然后加入二抗，于37℃温育1h；
(6)底物显色：TBS漂洗二抗温育过的膜，漂洗三次，每次10分钟，然后加入底物进行显色，定量，拍照保存。
4.结果
实验数据见表4。表4为体外实验研究当药素增强小鼠脂肪细胞GLUT4转位作用结果，所示为GLUT4含量与加药量的关系。
表4 当药素对GLUT4的转位影响
注：*P＜0.05，**P＜0.01，具有显著性差异
结果表明当药素显著增强了小鼠脂肪细胞GLUT4转位作用。
实施例7 当药素对糖尿病大鼠血糖的影响
1.动物造模
选用成年雄性大鼠50只，体重200±10g，实验前禁食不禁水12h后，尾静脉注射四氧嘧啶，剂量为35mg/kg，次日重复以上操作一次，实验环境要求25℃恒温，于注射四氧嘧啶的第七天尾部取血，用血糖仪测禁食12h后大鼠的空腹血糖值，以空腹血糖浓度大于11.1mmol/L的大鼠作为糖尿病大鼠，另设一组正常大鼠作空白对照，对照组尾静脉注射生理盐水10mL/kg。
2.分组、给药及指标测定
选造模成功的30只大鼠分成三组，分别为模型对照组、阳性对照组、给药组，每组各10只，阳性对照组按230mg/kg的剂量每天灌胃给予消渴丸1次，给药组按150mg/kg的剂量每天灌胃给予当药素(实施例5制备得到的)1次，连续给药15天，每5天称体重1次，于第5天、第10天断尾取血，用血糖仪测禁食12h的大鼠血糖值，末次给药后40min测血糖值。
3.结果
结果显示，给药前模型组与给药组大鼠的血糖值无显著性差异(P＞0.05)；给药15天时，当药素可显著抑制给药组糖尿病大鼠血糖升高(P＜0.05或P＜0.01)。结果见表5。
表5 当药素对糖尿病大鼠血糖的影响(X±S)
注：模型组与空白对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01
给药组与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01
实施例8 2”-O-鼠李糖基异牡荆素的制备及结构鉴定
1.2”-O-鼠李糖基异牡荆素的制备
(1)取射干叶40kg，切成小段；
(2)射干叶碎片中加入400L蒸馏水，加热回流提取1小时，过滤，滤渣重复以上操作2次，合并滤液，回收溶剂至100L，加乙醇至含醇量为70％，静置，过滤，得到滤液，减压回收溶剂至无醇味，并加水稀释至400L，过滤，滤液用HP20型大孔吸附树脂进行分离，用40％乙醇水溶液洗脱，回收溶剂得干浸膏约1000g；
(3)1000g浸膏采用聚酰胺色谱柱进行分离，用20％乙醇水溶液洗脱，用聚酰胺薄层色谱法跟踪相应组分的洗脱情况，与2”-O-鼠李糖基异牡荆素对照品比移值相同的斑点组分施行合并，减压回收溶剂至无醇味，冷冻干燥，称重，得粗分产物约0.7g；
(4)粗分产物用20％甲醇水溶液充分溶解，用Sephadex LH-20型葡聚糖凝胶色谱柱进行分离，用20％甲醇水溶液洗脱，用聚酰胺薄层色谱法跟踪相应组分的洗脱情况，与2”-O-鼠李糖基异牡荆素对照品比移值相同的斑点组分施行合并，减压回收溶剂至呈固状物，冷冻干燥，精密称重，得细分产物422mg；
(5)细分产物用50％甲醇水溶液充分溶解，用半制备型高效液相色谱仪，以ODS为固定相，以45％甲醇水溶液为流动相，进行纯化，用分析型高效液相色谱法检测纯度，纯度大于98％的组分施行合并，减压回收溶剂至呈固状物，冷冻干燥，精密称重，得纯化合物306mg，经过结构鉴定，最终确定该化合物为2”-O-鼠李糖基异牡荆素。
2.2”-O-鼠李糖基异牡荆素的结构鉴定
2.1理化性质
黄色颗粒状固体，盐酸-镁粉反应阳性。三氯化铝显色反应：黄色荧光。分子式：C27H30O14。
2.2波谱数据
UVλmax(nm)：266，298(sh)，330(MeOH)。
ESI-MS：m/z 579.5[M+H]+。
1HNMR(500MHZ，DMSO-d6)δppm：13.13(1H，s，5-OH)，10.90(1H，brs，7-OH)，10.36(1H，brs，4’-OH)，8.04(2H，d，J＝8.6Hz，H-2’，6’)，6.90(2H，d，J＝8.6Hz，H-3’，5’)，6.25(1H，s，H-3)，6.78(1H，s，H-8)。
13CNMR：δppm：163.9(2-C)，102.4(3-C)，182.0(4-C)，160.6(5-C)，108.2(6-C)，162.2(7-C)，91.4(8-C)，155.7(9-C)，104.1(10-C)，121.5(1’-C)，128.8(2’，6’-C)，115.8(3’，5’-C)，161.0(4’-C)；Glc-：71.4(1”-C)，75.1(2”-C)，79.8(3”-C)，70.6(4”-C)，81.6(”-C)，61.1(6”-C)；Rha-：100.2(1-C)，70.3(2-C)，70.2(3-C)，71.6(4-C)，68.1(5-C)，17.5(6-C)。
实施例9 2”-O-鼠李糖基异牡荆素增强小鼠GLUT4转位作用实验
1.样品
2”-O-鼠李糖基异牡荆素(实施例8制备得到的)
2.试剂
胶原酶VIII，牛血清第五组分，兔抗GLUT4(一抗)，羊抗兔-HRP(二抗)，二溴乙胺，其它药品均为分析纯。
3.实验方法
将样品加到小鼠脂肪细胞悬液中，37℃水浴温育40min后，细胞悬液在4℃下超声破碎，离心(3000×g，15min，4℃)，弃去表面悬浮的白色脂肪层，悬液继续离心(12000×g，25min，4℃)，沉淀用Medium I(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，250mM蔗糖，pH＝7.4)稀释成溶液作为待测的细胞膜样品溶液。
GLUT4的含量采用Western blot的方法测定，其具体操作如下：
(1)电泳：采用分离胶浓度为10％，浓缩胶5％进行蛋白分离富集，浓缩胶80V电压，分离胶120V电压，冰浴中电泳大约1.5h，进行转膜；
(2)转膜：将滤纸、海绵、胶、膜、海绵、滤纸等三明治夹层安装好，正负极放到电转移装置，倒入电转移缓冲液，进行电转移，15V、30mA、冰浴条件下电转移4h，然后用丽春红检验蛋白是否转移到膜上；
(3)封闭：将膜放入5％的脱脂奶粉中，4℃，封闭一夜；
(4)与一抗的反应：将封闭好的膜加入一抗，37℃温育2h；
(5)与二抗的反应：用TBS缓冲液对用一抗温育过的膜进行漂洗，漂洗三次，每次10分钟，然后加入二抗，于37℃温育1h；
(6)底物显色：TBS漂洗二抗温育过的膜，漂洗三次，每次10分钟，然后加入底物进行显色，定量，拍照保存。
4.结果
实验数据见表6。表6为体外实验研究2”-O-鼠李糖基异牡荆素增强小鼠脂肪细胞GLUT4转位作用结果，所示为GLUT4含量与加药量的关系。
表6 2”-O-鼠李糖基异牡荆素对GLUT4的转位影响
注：*P＜0.05，**P＜0.01，具有显著性差异
结果表明2”-O-鼠李糖基异牡荆素显著增强了小鼠脂肪细胞GLUT4转位作用。
实施例10 2”-O-鼠李糖基异牡荆素对糖尿病大鼠血糖的影响
1.动物造模
选用成年雄性大鼠50只，体重200±10g，实验前禁食不禁水12h后，尾静脉注射四氧嘧啶，剂量为35mg/kg，次日重复以上操作一次，实验环境要求25℃恒温，于注射四氧嘧啶的第七天尾部取血，用血糖仪测禁食12h后大鼠的空腹血糖值，以空腹血糖浓度大于11.1mmol/L的大鼠作为糖尿病大鼠，另设一组正常大鼠作空白对照，对照组尾静脉注射生理盐水10mL/kg。
2.分组、给药及指标测定
选造模成功的30只大鼠分成三组，分别为模型对照组、阳性对照组和给药组，每组各10只，阳性对照组按230mg/kg的剂量每天灌胃给予消渴丸1次，给药组按50mg/kg的剂量每天灌胃给予2”-O-鼠李糖基异牡荆素(实施例8制备得到的)1次，连续给药15天，每5天称体重1次，于第5天、第10天断尾取血，用血糖仪测禁食12h的大鼠血糖值，末次给药后40min测血糖值。
3.结果
结果显示，给药前模型组与给药组大鼠血糖值无显著性差异(P＞0.05)；给药15天时，2”-O-鼠李糖基异牡荆素可显著抑制给药组糖尿病大鼠血糖升高(P＜0.05或P＜0.01)。结果见表7。
表7 2”-O-鼠李糖基异牡荆素对糖尿病大鼠血糖的影响(X±S)
注：模型组与空白对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01
给药组与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01
实施例11 异牡荆素的制备及结构鉴定
1.异牡荆素的制备
(1)取射干叶40kg，切成小段；
(2)射干叶碎片中加入400L蒸馏水，加热回流提取1小时，过滤，滤渣重复以上操作2次，合并滤液，回收溶剂至100L，加乙醇至含醇量为70％，静置，过滤，得到滤液，减压回收溶剂至无醇味，并加水稀释至400L，过滤，滤液用HP20型大孔吸附树脂进行分离，用40％乙醇水溶液洗脱，回收溶剂得干浸膏约1000g；
(3)1000g浸膏用聚酰胺色谱柱进行分离，用30％乙醇水溶液洗脱，用聚酰胺薄层色谱法跟踪相应组分的洗脱情况，与异牡荆素对照品比移值相同的斑点组分施行合并，减压回收溶剂至无醇味，冷冻干燥，称重，得粗分产物约1g；
(4)粗分产物用40％甲醇水溶液充分溶解，用Sephadex LH-20型葡聚糖凝胶色谱柱进行分离，用40％甲醇水溶液洗脱，用聚酰胺薄层色谱法跟踪相应组分的洗脱情况，与异牡荆素对照品比移值相同的斑点组分施行合并，减压回收溶剂至呈固状物，冷冻干燥，精密称重，得细分产物538mg；
(5)细分产物用60％甲醇水溶液充分溶解，用半制备型高效液相色谱仪，以ODS为固定相，以60％甲醇水溶液为流动相，进行纯化，用分析型高效液相色谱法检测纯度，纯度大于98％的组分施行合并，减压回收溶剂至呈固状物，冷冻干燥，精密称重，得纯化合物435mg，经过结构鉴定，最终确定该化合物为异牡荆素。
2.异牡荆素的结构鉴定
2.1理化性质
浅黄绿色粉末状固体，盐酸-镁粉反应阳性。三氯化铝显色反应：黄色荧光。分子式C21H20O10。
2.2波谱数据
UVλmax(nm)：266，330(MeOH)。
ESI-MS(m/z)：431[M-H]-。
1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ：(ppm)13.15(1H，s，5-OH)，10.84(1H，brs，7-OH)，10.34(1H，brs，4’-OH)，8.03(2H，d，J＝7.5Hz，H-2’，6’)，6.95(2H，d，J＝3Hz，H-3’，5’)，6.79(1H，s，H-8)，6.27(1H，s，H-3)。
13CNMR(500MHz，DMSO-d6)δ：(ppm)164.0(C-2)，102.4(C-3)，182.0(C-4)，160.6(C-5)，108.1(C-6)，161.0(C-7)，91.6(C-8)，156.0(C-9)，104.0(C-10)，121.6(C-1’)，128.8(C-2’，6’)，115.7(C-3’5’)，162.7(C-4’)，73.3(C-1”)，70.8(C-2”)，78.7(C-3”)，70.6(C-4”)，81.7(C-5”)，61.4(C-6”)。
实施例12 异牡荆素增强小鼠GLUT4转位作用实验
1.样品
异牡荆素(实施例11制备得到的)
2.试剂
胶原酶VIII，牛血清第五组分，兔抗GLUT4(一抗)，羊抗兔-HRP(二抗)，二溴乙胺，其它药品均为分析纯。
3.实验方法
将样品加到小鼠脂肪细胞悬液中，37℃水浴温育40min后，细胞悬液在4℃下超声破碎，离心(3000×g，15min，4℃)，弃去表面悬浮的白色脂肪层，悬液继续离心(12000×g，25min，4℃)，沉淀用Medium I(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，250mM蔗糖，pH＝7.4)稀释成溶液作为待测的细胞膜样品溶液。
GLUT4的含量采用Western blot的方法测定，其具体操作如下：
(1)电泳：采用分离胶浓度为10％，浓缩胶5％进行蛋白分离富集，浓缩胶80V电压，分离胶120V电压，冰浴中电泳大约1.5h，进行转膜；
(2)转膜：将滤纸、海绵、胶、膜、海绵、滤纸等三明治夹层安装好，正负极放到电转移装置，倒入电转移缓冲液，进行电转移，15V、30mA、冰浴条件下电转移4h，然后用丽春红检验蛋白是否转移到膜上；
(3)封闭：将膜放入5％的脱脂奶粉中，4℃，封闭一夜；
(4)与一抗的反应：将封闭好的膜加入一抗，37℃温育2h；
(5)与二抗的反应：用TBS缓冲液对用一抗温育过的膜进行漂洗，漂洗三次，每次10分钟，然后加入二抗，于37℃温育1h；
(6)底物显色：TBS漂洗二抗温育过的膜，漂洗三次，每次10分钟，然后加入底物进行显色，定量，拍照保存。
4.结果
实验数据见表8。表8为体外实验研究异牡荆素增强小鼠脂肪细胞GLUT4转位作用结果，所示为GLUT4含量与加药量的关系。
表8 异牡荆素对GLUT4的转位影响
注：*P＜0.05，**P＜0.01，具有显著性差异
实施例13 异牡荆素对糖尿病大鼠血糖的影响
1.动物造模
选用成年雄性大鼠50只，体重200±10g，实验前禁食不禁水12h后，尾静脉注射四氧嘧啶，剂量为35mg/kg，次日重复以上操作一次，实验环境要求25℃恒温，于注射四氧嘧啶的第七天尾部取血，用血糖仪测禁食12h后大鼠的空腹血糖值，以空腹血糖浓度大于11.1mmol/L的大鼠作为糖尿病大鼠，另设一组正常大鼠作空白对照，对照组尾静脉注射生理盐水10mL/kg。
2.分组、给药及指标测定
选造模成功的30只大鼠分成三组，分别为模型对照组、阳性对照组和给药组，每组各10只，阳性对照组按230mg/kg的剂量每天灌胃给予消渴丸1次，给药组按150mg/kg的剂量每天灌胃给予异牡荆素(实施例11制备得到的)1次，连续给药15天，每5天称体重1次，于第5天、第10天断尾取血，用血糖仪测禁食12h的大鼠血糖值，末次给药后40min测血糖值。
3.结果
结果显示，给药前模型组与给药组大鼠的血糖值无显著性差异(P＞0.05)；给药15天时，异牡荆素可显著抑制给药组糖尿病大鼠血糖升高(P＜0.05或P＜0.01)。结果见表9。
表9 异牡荆素对糖尿病大鼠血糖的影响(X±S)
注：模型组与空白对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01
给药组与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01
Claims (3)
1.2”-O-鼠李糖基当药素及其类似物的用途，所述2”-O-鼠李糖基当药素及其类似物的结构式为(Ⅰ)
(Ⅰ)
其中：
R1表示H或鼠李糖基；
R2表示H；
R3表示H或CH3；
R4表示H；
R5表示H；
R6表示H；
其特征在于：所述的用途是用于制备治疗Ⅱ型糖尿病的药物，可显著增强GLUT4的转位作用，促进葡萄糖的吸收和利用，显著抑制血糖升高。
2.根据权利要求1所述的2”-O-鼠李糖基当药素及其类似物的用途，其特征在于：2”-O-鼠李糖基当药素或其类似物经胃肠道或不经胃肠道途径施用，通过口服、皮下、肌肉内、静脉内、透皮、鼻内、直肠内给药。
3.根据权利要求1所述的2”-O-鼠李糖基当药素及其类似物的用途，其特征在于：该一系列2”-O-鼠李糖基当药素或其类似物与医学上可接受的药用辅料组成的药物组合物或其制剂；所述的制剂为各种类型的丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服剂、注射剂，以及临床上适宜的其它剂型；所述的制剂含有必要的附加剂，为填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、pH调节剂。
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| Joseph H.等.O-methoxylated C-glycosylflavones from Justicia pectoralis.《Journal of Natural Products》.1988,第51卷(第4期), * |
| Kroschewsky J. R..Flavonoids from the genus Tragopogon (compositae).《Phytochemistry》.1969,第8卷(第8期), * |
| McCormick S.等.O- and C-Glycosylflavones from Passiflora biflora.《Phytochemistry》.1983,第22卷(第3期), |
| McCormick S.等.O- and C-Glycosylflavones from Passiflora biflora.《Phytochemistry》.1983,第22卷(第3期), * |
| 张春容 等.射干的提取纯化工艺研究.《华西药学杂志》.2006,第21卷(第5期), * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102050852A (zh) | 2011-05-11 |
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