KR20130026399A - 세포내 대사 촉진용 조성물, 그 조성물을 함유하는 당대사 또는 지질 대사 질환의 예방 및/또는 치료용 의약 제제, 기능성 식품 및 건강식품 - Google Patents

Abstract

지질의 축적을 억제하면서, 지방세포 및 근세포에의 혈당의 흡수를 증가시킨다. PPARγ의 아고니스트, 그 생리학적으로 허용되는 염 및 그들의 수화물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 적어도 1종 이상 함유하는 것을 유효 성분으로서 함유하는 세포내 대사 촉진용 조성물, TNF-α 활성 억제제, 그 조성물을 유효 성분으로 하는 의약 제제, 건강식품 및 기능성 식품을 제공한다. 본원 발명의 조성물은 지질 축적을 예방하면서 혈당치를 개선할 수 있다. 또한, TNF-α 활성을 억제함으로써, 당대사를 개선할 수 있다.

Description

세포내 대사 촉진용 조성물, 그 조성물을 함유하는 당대사 또는 지질 대사 질환의 예방 및/또는 치료용 의약 제제, 기능성 식품 및 건강식품{COMPOSITION FOR PROMOTING INTRACELLULAR METABOLISM, AND PHARMACEUTICAL PREPARATION FOR PREVENTING AND/OR TREATING SACCHAROMETABOLISM OR LIPID METABOLISM DISEASE, FUNCTIONAL FOOD, AND HEALTH FOOD CONTAINING THE COMPOSITION}

본 발명은 리간드의 기능을 갖는 화합물과 상기 화합물을 함유하며 당대사 또는 지질 대사 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 함유하는 의약 제제, 기능성 식품 및 건강식품에 관한 것이다.

본 발명은 글루코오스 항상성(glucose homeostasis), 과혈당증을 포함하는 고혈당의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 의약 제제, 기능성 식품, 및 건강식품에 관한 것이다.

본 발명에서 프로폴리스는 서양 꿀벌이 다양한 식물로부터 모은 혼합물로 성분의 수지와 같다. 서양 꿀벌은 프로폴리스를 벌집의 구멍을 막는 재료로 사용하며, 벌집 문의 방어에도 이용하고 있다. 프로폴리스는 폭넓은 생리활성을 갖기 때문에 서양에서 전통적인 민간약으로 기원전부터 사용되어왔다.

최근, 프로폴리스는 화학조성 및 생리활성에서 각각 전혀 매우 다양한 가능성이 있다는 점이 지적되었다(꿀벌 과학 27(2):63-70 Honeybee Science (2006) 참조). 예를 들어, 불가리아와 브라질로부터 수집된 프로폴리스의 샘플을 비교해보면, 완전 별종의 두 식물의 추출물을 비교하는 것과 마찬가지로 차이가 있다.

프로폴리스 추출물이 갖는 생리 활성은, 엔도셀린 길항 작용, 글루코코르티코이드와 같은 작용 및 일산화질소 합성 효소 저해 작용을 갖는 것(일본 특허 공개 2004-161664호 공보 참조, 이하, "종래 기술 1"이라 함)과 아디포넥틴 생산의 증강 작용, 퍼옥시솜 증식제 응답성 핵내 수용체γ(이하, PPARγ라고 약칭하는 경우도 있음) 활성화 작용(아고니스트 작용), 전구 지방세포에서 지방세포로의 분화를 유도하는 작용, 인슐린 저항성의 개선 작용 및 TNF-α에 의한 전구 지방세포에서 지방세포로의 분화를 억제하는 것을 개선하는 작용(일본 특허 공개 2010-37221호 공보 참조, 이하, "종래 기술 2"라 함)등이 알려져 있다.

또한, 프로폴리스는, 재배되는 산지에 따라, 계피산 유도체인 아테필린 C(artepillin C, 이하, "ARC"라고 하는 경우도 있음), 플라보노이드 및 폴리페놀의 일종인 카페인산 페네틸 에스테르(CAPE)등을 함유하는 것으로 알려져 있다. ARC를 비롯한 프레닐 계피산의 유도체에는, TNF-α로 인해 아디포넥틴 발현이 저하되는 것을 억제하는 작용이 있는 것으로 알려져 있다(일본 특허 공개 2010-150161호 공보, 이하 "종래 기술3"이라 함). ARC의 구조식을 하기 화학식 1로 나타낸다.

상기와 같은 작용을 갖는 프로폴리스는 식품에도 배합되는데, 예를 들면, 구미 캔디, 츄잉검, 화과자, 버터 케이크 등(일본 특허 공개 평9-141002호 공보 참조, 이하, "종래 기술 4"라고 함.) 등이 알려져 있다.

또한, PPARγ는 자기 피드백을 하는 전사 인자이지만, 프로폴리스 추출물은 PPARγ를 비롯한 지질 합성 관련 유전자의 발현을 억제하고, 지질 합성을 저해한다는 것(일본 특허 공개 2010-53122호 공보, 이하, "종래 기술 5"라고 함.)으로 알려져 있다.

이에 반하여, PPARγ의 아고니스트로 알려진 로시글리타존(Rosiglitazone, 이하, "RSG"라고 약칭하는 경우도 있음.)은, 인슐린 저항성의 개선작용이나 전구 지방세포에서 지방세포로의 분화를 억제하는 것을 개선하는 작용이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 별도의 PPARγ의 안타고니스트로, 하기 화학식 2에 나타나는 GW9662가 알려져 있다. RSG가 지방세포의 분화와 성장을 촉진하는데 반하여, GW9662는 이들을 억제한다.

신진대사 증후군(Metabolic syndrome)은 비만, 고혈당, 고혈압, 고지혈증의 연합이다. 여기 내장비만이 신진대사 증후군 발생의 주요인자라는 상당한 증거가 있다. 많은 연구에서 이러한 비만이 만성적인 저수준 염증상태에 관여한다고 보고하였는데, 상기 염증은 인슐린 저항성의 발달을 촉진할 가능성이 있다.

또한, 연구는 지방조직에서 염증 매개체의 중요한 원료를 대표하는 것을 제안함으로써, 비만 지방조직이 대식세포의 침입을 증진키는 특징을 나타낸다.

지방세포에서 유래된 FFAs와 대식세포에서 유래된 TNF-α를 포함하는 파라클린(paracrine)루프에 대한 Suganami 외(Suganami T, Nishida J, Ogawa Y: A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005, 25:2062-2068)의 보고는, 비만 지방조직에서 염증 변화와 인슐린 저항성을 증가시키는 악순환의 고리를 수립한다.

지방세포에서 분비되는 MCP-1은 직접적으로 지방조직에서 대식세포의 모집을 유도하고, 그 후 TNFα등과 같은 염증매개체를 방출하기 위해 대식세포를 활성화한다. 결국, TNFα는 인슐린 신호를 방해하고 FFAs의 과생산을 유발하여 지방세포에서 지방분해를 유도한다. 사실, 이들의 농도, 지방산, 특히 포화 FFAs는, 비만에서 높게 나타난다. 이러한 악순환 염증 주기를 억제하는 화합물은 비만에서 강화된 염증활성 억제를 위해 이용될 수 있을 것이다. PPAR, 리간드에 의해 활성화된 핵 수용체 초과인원은 염증의 조절에서 핵심적인 역할을 한다. PPAR에 대한 합성 리간드, Thiazolidinediones (TZDs)는 대식세포에서 전구 염증 사이토카인의 생산과 지방조직에서 대식세포의 활성과 침윤을 억제한다.

추가적으로, 지방세포 분화 및 인슐린 증감(sensitization)에서 PPAR의 잘으로 유도된(well-studied) 효과인, PPAR활성은 지방세포에서 TNF-a의 활동을 억제한다.

지방세포 분화 및 인슐린 증감에서 PPAR의 잘 연구된 효과뿐만 아니라, PPAR 활성화는 지방세포에서 TNF의 활동을 억제한다.

이러한 점에서, PPAR 리간드의 항염증 특성은 최근 자신의 항당뇨병 활성의 추정반응기(putative effectors)로서 부각되었다. 현재, 아비에트산, 캡사이신(capsaicin) 및 탈수소 아비에트산(dehydroabietic acid)과 같은, 자연적으로 발생하는 많은 항염증 화합물은 PPAR에 의존하는 메커니즘을 통해 비만으로 유도된 염증과 인슐린 저항성에 반하는 긍정적인 효과를 보였다.

브라질의 남부 및 남동부 지역의 브라질 그린 프로폴리스 자원식물(baccharis dracunculifolia)에서 수집되어진 삼출물(exudates)로, 꿀벌에 의해 생산되어진 브라질 그린 프로 폴리스는, ARC 및 기타 플라보노이드가 높은 수준으로 포함되었다. 연구는 ARC가 항균, 항산화와 항암(antitumor)에 대한 활성을 소유한 것을 나타낸다. 또한, ARC는 생체 내외의 항염증 효과가 존재한다.

종래의 연구에서, ARC가 지방세포 분화를 유도하고 리간드로 PPAR을 활성화하여, 3T3-L1의 지방세포에서 포도당 흡수 자극하는 것을 나타낸다.

본 실험예는 지방세포와 대식세포의 공동배양 시스템뿐만 아니라 ob/ob 쥐, 당뇨병 비만 모델에서 신진 대사 기능에 ARC의 종합 효과를 조사했다. ARC는 MCP-1과 IL-6과 같은 염증 매개체의 생산을 억제하고, 지방조직의 지방세포와 대식세포 간의 염증 상호작용 조절을 통해 인슐린 저항성의 발달을 감소시켰다.

[특허 문헌 1] 일본 특허 공개 2004-161664호 공보 [특허 문헌 2] 일본 특허 공개 2010-37221호 공보 [특허 문헌 3] 일본 특허 공개 2010-150161호 공보 [특허 문헌 4] 일본 특허 공개 평9-141002호 공보 [특허 문헌 5] 일본 특허 공개 2010-53122호 공보

[비특허 문헌 1] 꿀벌 과학 27(2):63-70 Honeybee Science (2006)

상술한 종래 기술에는, 프로폴리스 추출물이 산지에 따라 조성이 서로 다르고, 다양한 생리 활성을 갖는 것이 나타나 있다.

종래 기술 1은 브라질산 프로폴리스와 중국산 프로폴리스의 함수 에탄올 추출물이 주요한 성분을 특정하고 있다. 종래 기술 1 및 2는, 프로폴리스 추출물이 PPARγ 아고니스트를 함유하는 것을 명백히 하고, 이들을 다양한 의약품으로서 사용할 수 있다는 것을 발견한 점에서는 뛰어나다. 그러나, 종래 기술 1 및 2에서 사용되고 있는 프로폴리스 추출물은, 그 유효 성분은 특정되어 있지 않다.

또한, 종래 기술 3에서는, 브라질산 프로폴리스에 포함되는 ARC가 TNF-α에 의한 아디포넥틴 발현의 저하를 억제하는 것을 확인하였으며, 당뇨병 비만의 치료 또는 예방에 사용할 수 있을 가능성을 나타낸 점에서 뛰어나다. 그러나, 종래기술 3에서는, in vitro의 실험만 행해져 있고, 동물을 이용한 in vitro의 실험에서도 마찬가지의 결과가 얻어질 보증이 없다고 하는 문제가 있다. in vitro에서 얻어지는 결과가, in vitro의 실험 결과와 반드시 상관이 없다는 것은, 당업자에게는 주지된 것이다.

또한, 종래 기술 4에서, 프로폴리스 추출물의 ｐH를 5.5~7.0으로 높임으로써 수용성을 향상시키고, 음식물, 바이러스성 질환, 세균성 질환, 외상성 질환 그 밖의 감수성 질환에 대한 약제, 피부미용제 등의 화장품에 사용하기 쉽게 했다는 점에서는 뛰어난 것이다. 그러나, 종래 기술 4에서는, 상기와 같은 ｐH로 추출한 프로폴리스 추출물이 실제로 항 바이러스 효과, 항균 효과 등을 나타내는지의 여부에 대해서는 지재되어 있지 않다.

따라서, 각종 성분이 섞인 상태의 프로폴리스 추출물을 그대로 고혈당 또는 인슐린 저항성의 개선에 사용하더라도, 그 유효 성분의 효과를 충분히 발휘시킬 수 있다는 보증은 없다.

반대로, PPARγ 활성 아고니스트를, 프로폴리스 추출물로부터 특정할 수 있다면, 고혈당이나 인슐린 저항성이 크게 개선될 가능성이 있다.

또한, 매우 강한 PPARγ 아고니스트인 RSG는, 고혈당 또는 인슐린 저항성의 개선에 유용하다. 그러나, RSG의 사용에는, 심근허혈이라는 리스크가 존재한다. 또한, PPARγ에 유도되는 지방세포의 유전자의 발현은, RSG에 의해 강하게 활성화되기 때문에 비만이라는 리스크도 있다.

한편으로, GW9662 그 밖의 PPARγ 안타고니스트는, PPARγ의 인슐린 저항성의 개선으로 이어지는 아디포넥틴 등의 유전자의 발현을 억제하나, 직접적으로는 당뇨병의 치료 효과나 고혈당의 개선 효과는 발휘되지 않는다.

부작용을 수반하지 않고 인슐린 저항성이나 고혈당을 개선하는데 있어서는, 아고니스트 또는 안타고니스트의 작용의 강약을 적절히 제어하여 PPARγ의 활성을 제어하는 것이 매우 유용하다. 그리고, 당뇨병 환자 및 그 예비군의 수를 고려하면, 그와 같은 복합적인 작용을 갖는 조성물 또는 그와 같은 조성물을 이용한 복합적인 치료/예방법에 대한 높은 사회적 요청이 있다.

한편, 의약 제제에 의한 치료가 필요하지는 않지만, 과혈당증이나 고혈당이 될 위험성이 높은, 소위 과혈당이나 고혈당의 예비군으로 불리는 사람들은 식품을 섭취함으로써 이와 같은 상태를 개선해야 하며, 그와 같은 요청도 크다. 그리고, 기능성 식품 또는 건강식품으로서 상기한 바와 같은 효과를 발휘하는 화합물을 잘 섭취할 수 있다면, 병을 예방하는 것이 가능해진다. 또한, 해마다 증가하는 의료비가 방대한 금액에 이르고 있다는 점에서도, 사회적인 요청은 강하다.

본 발명의 제 1의 양태는, 상기 화학식 1로 표현되는 PPARγ의 아고니스트, 그 생리학적으로 허용되는 염 및 그들의 수화물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 적어도 1종 이상 함유하는 것을 유효 성분으로서 함유하는, 세포내 대사 촉진용 조성물이다.

상기 세포내 대사는 세포에서의 당대사인 것이 바람직하고, 지방세포 또는 근관 세포로의 당의 흡수의 촉진인 것이 더욱 바람직하다.

또한, 상기 세포내 대사는 세포에서의 지질 대사인 것이 바람직하고, 지방세포의 분화의 촉진인 것이 더욱 바람직하다.

상기 조성물은 PPARγ의 안타고니스트, 그 생리학적으로 허용되는 염 및 그들의 수화물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 적어도 1종 이상 함유하는 것을 더 포함하는 것이 바람직하다. 그리고, 상기 안타고니스트는, 상기 화학식 2로 표현되는 화합물 및 이들의 생리학적으로 허용되는 염 및 수화물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

여기에서, 상기 아고니스트와 상기 안타고니스트의 조성비는 1:10~100:1인 것이 바람직하고, 1:1~10:1인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 제2의 양태는, 상기의 조성물을 유효 성분으로 하여, 소정의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 당대사 질환의 예방 및/또는 치료용 의약 제제이다.

또한, 본 발명의 제3의 양태는, 상기의 조성물을 유효 성분으로 하여, 소정의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 지질 대사 질환의 예방 및/또는 치료용 의약 제제이다.

본 발명의 제4의 양태는, 상기 화학식 1로 표현되는 리간드, 그 생리학적으로 허용되는 염 및 그들의 수화물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 적어도 1종 이상 함유하는, TNF-α 활성 억제제이다.

본 발명의 제5의 양태는, 상기 TNF-α 활성의 억제제를 유효 성분으로 하여, 소정의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 당대사 활성 촉진용 의약 제제이다.

본 발명의 제6 및 제7의 양태는, 적어도 상기 화학식 1로 표현되는 화합물(아고니스트)과, 상기 화합물에 대한 안타고니스트를 함유하는, 기능성 식품 또는 건강식품이다.

본원 발명의 조성물 및 이들 조성물을 함유하는 의약 제제의 섭취에 의해, 지방세포 및 근관 세포의 어느 것에 있어서도 당대사를 개선함과 함께, 지질 축적을 억제하는 것이 가능해진다. 그리고, 이들 작용에 의해, 혈당치를 개선할 수 있다.

도 1은, ARC인 ARC 및 양성 대조 물질15-디옥실-델타-12,14-프로스타글란딘J2(15d-PGJ2)의 TR-FRET값(520㎚/495㎚비)을 나타내는 그래프이다. 용매(대조)를 이하, "C"라고 약칭한다.
도 2는, ARC 존재하에서의 PPARγ 표적 유전자 aP2의 단백질 발현량을 나타내는 SDS-PAGE면역 블롯 화상이다. RSG는 로시글리타존을 나타낸다. GAPDH는 글리세르 알데히드 3 인산 탈수소 효소를 나타내며, 발현량의 표준으로 한다.
도 3은, ARC 존재하에서의 PPARγ 표적 유전자 aP2의 mRNA 발현량비를 나타내는 그래프이다. 용매 첨가군을 음성 대조군으로 하고, 그 mRNA량을 1로 한다.
도 4는, 염색 세포로부터 추출한 오일 레드 O의 양으로 축적 지질량비를 구하여 얻어진 그래프이다. 대조로서 인슐린 비첨가군과 비교했다. C는 유도 물질을 제외하고, 어떠한 ARC 등도 첨가되어 있지 않은 용매를 투여한 음성 대조군에서의 실험 결과를 나타내고, RSG는 로시글리타존을 나타낸다. C에 대해서는 특별한 기재가 없는 한 이하와 마찬가지로 한다.
도 5는, 인슐린 존재하에서, ARC 및 PPARγ 안타고니스트에 의한 분화 유도시의 지방세포 특이적 유전자의 mRNA 발현량비를, GW9662의 용매 첨가군 C를 1로 하여 나타낸 그래프이다.
도 6은, 인슐린 존재하에서, ARC 및 PPARγ 안타고니스트에 의한 분화 유도시의 지방세포 특이적 유전자의 단백질 발현량을 나타내는 SDS-PAGE면역 블롯 화상이다. A10은 10μM의 ARC, A30은 30μM의 ARC, R1은 1μM의 RSG를 나타내는 것으로 하고, 이하 특별한 기재가 없는 한 이하와 마찬가지로 한다.
도 7은, 분화된 3T3-L1 지방세포에 RSG(1μM, R로 나타냄.) 또는 ARC을 인슐린 포함/비포함하여 첨가했을 때의 포도당 소비량을 나타내는 그래프이다. 또한, PI3 키나아제 저해제 보르트만닌(wortmannin) 존재하에서 ARC인 30μM의 ARC 또는 RSG(1μM, R)를 첨가했을 때의 포도당 소비량도 동시에 나타낸 그래프이다.
도 8은, 분화된 3T3-L1 지방세포에 ARC 또는 RSG를 첨가했을 때의 당수송체 유전자의 mRNA 발현량비를 용매 첨가군 C를 1로 하여 나타낸 그래프이다.
도 9는, 분화된 3T3-L1 지방세포에 ARC 또는 RSG를 첨가했을 때의 모든 세포의 당수송체 유전자의 단백질 발현량을 나타내는 SDS-PAGE면역 블롯 화상이다.
도 10은, 분화된 3T3-L1 지방세포에 인슐린 및 ARC을 첨가했을 때의 세포 내에 흡수된 포도당 아날로그2-NBDG의 형광 관찰 화상이다. 인슐린도 ARC도 첨가되어 있지 않은 음성 대조군을 C로 했다.
도 11은, 분화된 3T3-L1 지방세포에 ARC 또는 RSG를 첨가했을 때의 막에 국재하는 당수송체 유전자의 단백질 발현량을 나타내는 SDS-PAGE면역 블롯 화상이다.
도 12는, 인슐린에 응답하여 인산화되는 단백질의 인산화 상태를 나타내는 SDS-PAGE면역 블롯 화상이다. 인슐린 포함/비포함하여 A30은 30μM의 ARC를 R1은 1μM의 RSG를 각각 분화된 3T3-L1 지방세포에 첨가한 것을 나타낸다.
도 13은, TNF-α의 존재하에서 분화 유도했을 때에 ARC을 첨가한 3T3-L1 지방세포의 지질 축적량을 나타내는 그래프이다. 각 그래프의 숫자는 농도(μΜ)를 나타낸다.
도 14는, 지방세포 분화 유도를 수행한 후, TNF-α의 포함/비포함하여의 지방세포 특이적 사이토카인 MCP-1의 유전자의 mRNA 발현량비를 TNF-α 비존재하의 음성 대조군 C를 1로 하여 나타낸 것이다. Ar10은 10μM의, Ar30은 30μM의 ARC의, R10은 10μM의 RSG의 각각 분화 유도 후의 첨가를 나타낸다.
도 15는, 도 14와 마찬가지로 IL-6 유전자에 대해서 mRNA 발현량비를 나타낸 것이다.
도 16은, TNF-α의 포함/비포함하여 분화 유도한 후의 지방세포 글리세롤 방출량비를, TNF-α 비존재하((-)TNFalpha)에서 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 분화 유도시에 첨가한 ARC은 각각, 용매만(C), 10μM의 RSG, 10μM의 N-아세틸시스테인(NAC), 10μM의 디페닐렌 요오드늄(diphenyleneiodonium ; DPI), 1~30μM의 ARC, 40μM의 PD98059(PD), 10μM의 SB202190(SB), 20μM의 SP600125(SP)이다.
도 17은, L6 근관 세포를 ARC 존재하에서, 5mM의 포도당을 함유하는 배지에서 배양했을 때의 배지 중의 포도당의 소비량을 나타내는 그래프이다. 그래프는 각각, 용매만의 음성 대조군(C), RSG(R), 카페인산 페네틸 에스테르(CAPE), 3~200μM의 ARC를 나타낸다.
도 18은, 25mM의 포도당을 함유하는 배지를 사용하여도 도 17과 마찬가지의 실험을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 19는, 당뇨병 모델 쥐에 대하여 용매(대조)만, ARC을 20mg/kg/일(A20) 또는 50mg/kg/일(A50)을 제공했을 경우의 포도당의 혈장 수준의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 20은, 지방세포와 대식세포의 공동배양의 염증 활성에서 ARC의 효과를 나타내는 그래프이다. 분화된 3T3-L1 지방세포는 ARC의 지시 농도를 포함/비포함하여, 24시간 동안 RAW264 대식세포와 공동배양 한 다음, 12시간 동안 ARC의 지시 농도로 사전 처리되었다. 총 RNA는 분리되고, TNF-α(A), MCP-1(B)와 IL-6(C)의 mRNA 발μΜ현 수준은 실시간--PCR에 의해 결정되었다. (D) 배양 배지에서 FFA 농도이다. 결과는 세 개의 개별적 실험을 대표한다. 데이터는 ±SD를 의미로 표시된다. * P <0.05 vs 공동배양 대조군을 의미한다.
도 21은, RAW264 대식세포의 염증매개체의 팔미트산염으로 유도된 발현에서 ARC의 효과를 나타내는 그래프이다. RAW264 대식세포는 ARC를 포함/비포함하여 24시간 동안 250μΜ 팔미트산을 처리한 다음, 12시간 동안 ARC의 지시 농도로 사전 처리되었다. TNF-α(A), MCP-1(B)와 IL-6(C)의 mRNA 발현 수준은 실시간--PCR로 분석하였다. (D)NO 생산을 보여준다. 결과는 세 개의 개별적 실험을 대표한다. 데이터는 ±SD를 의미로 표시된다. * P <0.05 vs 팔미트산으로만(홀로) 처리된 세포이다.
도 22는, 3T3-L1 지방세포의 지방분해와 TNFα에서 유래된 염증에서 ARC의 효과를 나타내는 그래프이다. 3T3-L1 지방세포는 24 시간 10 ng/ml TNFα로 처리된 후, ARC의 지시 농도로 사전 인큐베이션되었다. 총 RNA는 분리되고, MCP-1 (A), IL-6(B)은 mRNA 발현 수준은 실시간- - PCR에 의해 분석되었다. 모든 값은 ±SD의 의미로 표시된다(n=3). (C)글리세롤 방출이다. (D)지방세포는 ARC를 포함/비포함하여 10 ng/ml TNF-α로 처리된 후, 12시간 동안 ARC의 지시 농도로 사전 처리되었다. 세포는 평평해졌으며, PPARγ와 perilipin A의 mRNA와 단백질 발현 수준은 실시간--PCR과 웨스턴 블랏팅으로 분석되었다. 결과는 세 개의 개별적 실험을 대표한다.데이터는 ±SD를 의미로 표시된다. * P <0.05 vs TNFα으로만(홀로) 처리된 세포이다.
도 23은, ob/ob 쥐에서 비금식 혈당, TG, T-Cho 및 NEFA 수준에서 ARC의 효과를 나타내는 그래프이다. ob/ob 쥐에서 5 주간 ARC로 처리 후, 실험기간 동안 비금식 혈장 포도당 수준(A), TG의 비금식 혈장 수준(B), T-Cho(C) 및 NEFA(D)를 보여준다. 데이터는 ±SEM (N = 8)의 의미로 표시된다. * P <0.05 vs ob/ob 대조군. 린, 린 대조군; ob.ob-C, ob/ob 대조군; ob/ob-20ARC, ob/ob 20 mg/kg ARC, ob/ob-50ARC, ob/ob 50 mg/kg ARC이다.
도 24는, ob/ob 쥐에서 포도당 내성과 인슐린 수준에서 ARC의 효과를 나타내는 그래프이다. 4주간 ARC로 처리 후 16시간 동안 금식 후 ob/ob 쥐에서 구두 포도당 내성 검사 프로필(A), 포도당의 금식 혈장 수준(B), 인슐린(C)을 보여준다. HOMA-IR(D)은 실험예에서 설명한 것처럼, 금식 혈장 포도당와 인슐린 수준에서 계산되었다. 데이터는 ±SEM (N = 8)의 의미로 표시된다. * P <0.05 vs ob/ob 대조군. 린, 린 대조군; ob.ob-C, ob/ob 대조군; ob/ob-20ARC, ob/ob 20 mg/kg ARC, ob/ob-50ARC, ob/ob 50 mg/kg ARC이다.
도 25는, ob/ob 쥐에서 아디포카인(adipokine)의 혈장 농도에 대한 ARC의 효과를 나타내는 그래프이다. ob/ob 쥐에 5주 동안 ARC를 처리한 후 혈청 MCP-1(A), IL-6(B) 와 아디포넥틴(C)의 수준을 보여준다. 데이터는 ±SEM (N = 8)의 의미로 표시된다. * P <0.05 vs ob/ob 대조군. 린, 린 대조군; ob.ob-C, ob/ob 대조군; ob/ob-20ARC, ob/ob 20 mg/kg ARC, ob/ob-50ARC, ob/ob 50 mg/kg ARC이다.

이하에, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 명세서 중에서, "환자"에는 인간 및 인간 이외의 척추 동물로서 병에 걸린 동물이 포함된다. 또한, "잠재적인 환자"란, 특히 대사성 요인에 의해 앞으로 병에 걸릴 가능성이 있는 환자를 의미하며, "잠재적인 환자"에는 "인간의 잠재적인 환자"가 항상 포함되는 것으로 한다.

또한, 본 명세서 중에서, "세포내 대사"란, 세포 내에서 행해지는 다양한 대사를 의미한다. 본 명세서 중에서 "리간드"는, 선택적 또는 특이적인 높은 친화성을 가지고, 특정한 부위에서 수용체와 결합하는 물질을 의미한다. 본 명세서 중에서, "리간드"는 수용체에 결합하여, 수용체의 입체 배좌의 변화를 발생시킴으로써, 생체 응답 반응 생체내 물질과 마찬가지의 세포내 정보 전달계를 작동시키는 아고니스트를 포함하는 것으로 한다.

본 명세서 중에서, "아고니스트"는, 생체내 물질과 마찬가지로 완전한 활성을 발휘하는 아고니스트 뿐만 아니라, 부분적인 활성만 나타내는 부분 아고니스트도 포함한다. "안타고니스트"는, 수용체에 결합은 하지만, 생체 물질과 달리 생체 반응을 일으키지 않으며, 또한 그 결합에 의해 본래 결합해야 할 생체내 물질과 수용체의 결합을 저해하여, 생체 응답 반응을 일으키지 않는 약품을 의미한다.

본 명세서에서 "기능성 식품"이란, 그 식품 자체가 원래 함유하고 있는 영양소에 의해, 그 식품을 섭취한 자에게 공여할 수 있는 이상의 이익을 줄 수 있는 성분을 함유하는 식품을 의미한다. 또한, "건강식품"이란, 건강의 유지증진에 도움이 되는 성분을 추출하고, 제조한 조생성물 또는 정제물을 주성분으로 하는 분말, 과립제, 정제, 캡슐제, 액제 등으로 한 것을 의미하며, 평소에 부족하기 쉬운 영양 성분의 섭취를 보조하는 서플먼트도 포함하는 것으로 한다.

본 발명은, 상기 화학식 1로 표현되는 PPARγ의 아고니스트(ARC), 그 생리학적으로 허용되는 염 및 그들의 수화물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 적어도 1종 이상 함유하는 것을 유효 성분으로서 함유하는, 세포내 대사 촉진용 조성물이다. 여기에서, 상기 세포내 대사는, 세포에서의 당대사인 것이 바람직하고, 지방세포 또는 근관세포로의 당의 흡수 촉진인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 이들을 함유함으로써, 인슐린에 대한 의존성이 낮고, 인슐린을 투여/비투여하여 어느 쪽에 있어서도, 혈당치를 제어하는 효과가 높아지는 것에 의한다.

또한, 상기 세포 내 대사는 세포에서의 지질 대사인 것이 바람직하고, 지방세포의 분화의 촉진인 것이 더욱 바람직하다. 그리고, PPARγ의 안타고니스트, 그 생리학적으로 허용되는 염 및 그들의 수화물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 적어도 1종 이상 함유하는 것을 더 포함하는 것이 바람직하다.

상기 PPARγ의 안타고니스트는, 상기 화학식 2로 표현되는 화합물 및 이들의 생리학적으로 허용되는 염 및 수화물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

여기에서, 안타고니스트와 ARC와 병용함으로써, ARC의 작용을 잘 제어할 수 있다. 그리고, 상기 아고니스트와 상기 안타고니스트의 조성비는 1:10~100:1인 것이 바람직하고, 1:1~10:1인 것이 더욱 바람직하다. 이 조성비로 배합함으로써, 지방세포의 분화 촉진 효과가 높은 것에 의한다.

또한, 본 발명은 상기의 조성물을 유효 성분으로 하여, 소정의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 당대사 질환의 예방 및/또는 치료용 의약 제제이다.

또한, 본 발명은 상기의 조성물을 유효 성분으로 하여, 소정의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 지질 대사 질환의 예방 및/또는 치료용 의약 제제이다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표현되는 화합물(ARC), 및 이들의 생리학적으로 허용되는 염 및 수화물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 적어도 1종 이상 함유하는 TNF-α 활성 억제제이다. TNF-α에 의해 야기되는 염증 반응을 억제할 수 있고, 그 결과, 당대사를 개선할 수 있다.

상기 화학식 1 또는 상기 화학식 2로 표현되는 화합물의 생리학적으로 허용되는 염으로서는, 나트륨염, 칼륨염, 염산염 등을 들 수 있다. 또한, 수화물으로서는, 1수화물, 2수화물 등을 들 수 있다.

상기 화학식 1~2로 표현되는 화합물, 및 이들의 생리학적으로 허용되는 염 및 수화물, 및 이들 혼합물은 공지의 방법 또는 그에 준하는 방법에 의해 제조하고, 입수해도 좋고, 시판중인 제품을 구입해서 사용해도 좋다.

본 발명에서 사용하는 화합물은, 프로폴리스 원괴를 물이나 유기 용매를 사용하여 추출해서 얻을 수도 있고, 초임계 추출, 미셀화 추출 등에 의해 얻을 수도 있다. 메탄올, 에탄올, 부탄올, 프로판올, 이소프로판올 등의 저급 알코올을 사용하는 것이 ARC를 용이하고 또한 다량으로 추출할 수 있는 점에서 바람직하다. 또한, 아세톤이나 에세트산 에틸 등을 사용할 수도 있다.

물, 함수 알코올 그 밖의 상기와 같은 유기 용매를 사용하여 얻은 추출물을 통상의 순서에 따라 컬럼을 이용하여 정제함으로써, ARC를 얻을 수 있다. 또한, 아고니스트로서 사용하는 RSG는 발매원인 Sankyo Co., Ltd. 또는 그락소스미스클라인 주식회사로부터 구입할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는, 상기한 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 당대사 질환의 예방 및/또는 치료용 의약 제제이다. 또한 다른 양태는, 지질 대사의 예방 및/또는 치료용 의약 제제이다. 또한 다른 양태는, 당대사 활성 촉진용 의약 제제이다.

이와 같은 의약 제제로서는, 주사제, 좌제, 에어로졸제, 경피흡수제 그 밖의 비경구제, 정제, 산제(가루약), 캡슐제, 환제, 토로키제, 액제 그 밖의 다양한 제형의 제제를 들 수 있다. 여기에서, 상기의 정제에는 당의정, 코팅정, 바컬정이 포함되며, 캡슐제에는 경캡슐제, 연캡슐제이 모두 포함된다. 또한, 과립제에는 코팅된 과립제도 포함된다. 또한, 상기의 액제에는 현탁제, 유제, 시럽제, 엘릭시르제 등이 포함되고, 시럽제에는 드라이 시럽도 포함된다.

그 밖의 제형의 제제에는, 상기의 조성물을 액상으로 하여, 이를 아가로스비드에 함침시킨 겔제 등도 포함된다. 또한, 상기한 각 제제에는 서방(徐放)화 되어 있지 않은 것, 서방화된 것이 모두 포함된다.

이와 같은 제제는, 공지의 제제학적 제법에 따라, 제제의 제조시에 약리학적으로 허용될 수 있는 일본약국방에 기재된 담체, 부형제, 붕괴제, 활택제, 착색제 등을 사용하여 제조할 수 있다.

상기의 제제에서 사용하는 담체나 부형제로서는, 예를 들면, 유당, 포도당, 백당, 만니톨, 감자 전분, 옥수수 전분, 탄산 칼슘, 인산 칼슘, 황산 칼슘, 결정 셀룰로스, 감초말, 겐티아나 가루 등을 들 수 있다.

결합제로서는, 예를 들면, 전분, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 시럽, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 피로리돈, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 카르복실 메틸 셀룰로오스 등을 들 수 있다.

붕괴제로서는, 예를 들면, 전분, 한천, 젤라틴말, 카르복실 메틸 셀룰로오스 나트륨, 카르복실 메틸 셀룰로오스 칼슘, 결정 셀룰로오스, 탄산 칼슘, 탄산수소 나트륨, 알길산 나트륨 등, 활택제로서는 예를 들면 스테아린산 마그네슘, 탈크, 수소 첨가 식물유, 마크로골 등을 사용할 수 있다.

착색제는, 의약품에 첨가하는 것이 허용되어 있는 것이라면 사용할 수 있으며, 특별히 한정되지 않는다. 또한, 이들 이외에, 교미제, 교취제 등도, 필요에 따라 적절히 사용할 수 있다.

정제 또는 과립제로 하는 경우에는, 필요에 따라, 백당, 젤라틴, 히드록시 프로필 셀룰로오스, 정제 세락, 젤라틴, 글리세린, 소르비톨, 에틸 셀룰로오스, 히드록시 프로필 셀룰로오스, 히드록시 프로필 메틸 셀룰로오스, 폴리비닐 피로리돈, 프탈산 셀룰로오스 아세테이트, 히드록시 프로필 메틸 셀룰로오스 프탈레이트, 메칠 메타크릴레이트, 메타아크릴산 중합체 등을 사용하여 코팅해도 좋고, 복수 층으로 코팅할 수도 있다.

또한, 과립제나 분제를 에틸 셀룰로오스나 젤라틴과 같은 캡슐에 채워 넣어서 캡슐제로 할 수도 있다.

상기의 화합물, 또는 그들의 생리학적으로 허용되는 염, 혹은 수화물을 사용하여 주사제를 조제하는 경우에는, 필요에 따라, pH 조정제, 완충제, 안정화제, 가용화제 등을 첨가할 수도 있다.

예를 들면, 상기 화학식 1~2로 표현되는 화합물, 및 이들의 생리학적으로 허용되는 염 및 수화물, 및 이들 혼합물과 상기한 안타고니스트를 1:10~100:1 사이의 원하는 배합비로 혼합하여 조성물로 하고, 상기한 부형제를 첨가하여, 종래의 방법에 따라 더 혼합하고, 타정기를 이용하여 타정함으로써, 정제를 제조할 수 있다.

예를 들면, 배합비를 1:1로 한 상기 조성물 1mg에 상기한 부형제 200㎎을 첨가하여, 종래의 방법에 따라 더 혼합하고, 타정기를 이용하여 타정함으로써, 정제를 제조할 수 있다.

또한, 상기의 조성물을 종래의 방법에 따라 과립제로 하고, 소정의 양, 예를 들면, 100㎎을 소프트 캡슐에 채워 넣음으로써, 캡슐제를 제조할 수 있다.

상기 의약 제제를 상기 당대사 질환의 환자에게 투여하는 경우에는, 그 투여량은 환자의 증상의 위독한 정도, 연령, 체중, 및 건강 상태 등의 제 조건에 따라 서로 다르다. 일반적으로는, 성인 1일당 1㎎/㎏~2,000㎎/㎏, 바람직하게는 1㎎/㎏~1,000㎎/㎏ 정도를 경구 또는 비경구적으로 1일 1회 혹은 그 이상의 회수에 걸쳐 투여하면 좋다. 상기와 같은 제 조건에 따라 투여 횟수 및 양을 적절히 증감하면 좋다.

유효 성분인 상기 화학식 1로 표현되는 화합물 등의 함유량이 하한값 미만에서는 혈당 강하 작용 또는 인슐린 저항성의 개선 작용이 충분히 발휘되지 않고, 반대로 상한값을 초과하여 첨가해도, 첨가량에 걸맞는 효과가 발휘되지 않기 때문이다.

상기 의약 제제를 지질 대사 질환의 환자에게 투여하는 경우 및 당대사 활성촉진 등 의약 제제인 경우에도, 그 투여량은 상기의 당대사 질환의 경우와 마찬가지이다. 당대사 질환과 지질 대사 질환의 합병증 환자에게 투여하는 경우에는, 증상의 위독한 정도, 연령, 체중, 및 건강 상태 등의 제 조건에 따라, 어떠한 질환 단독의 경우보다도 증량하면 좋다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 함유하는 기능성 식품 또는 건강식품이다.

상기 조성물은, 예를 들면, 빵, 쿠키 및 비스켓, 쌀밥 첨가용 보리 및 잡곡, 우동, 메밀국수, 파스타 그 밖의 면류, 우유, 우유 대용품, 크림, 버터, 버터 밀크, 치즈, 유청(whey), 요거트 그 밖의 유제품, 마가린, 쇼트닝, 잼, 마요네즈, 된장, 간장 그 밖의 대두 제품, 차, 커피 및 코코아, 청량음료, 과실음료 그 밖의 비알콜성 음료, 약용술 그 밖의 알콜성 음료, 캔디, 초콜렛 그 밖의 스낵 과자, 츄잉검, 얼음 과자, 아이스크림, 센베이, 양갱 그 밖의 대두를 원료로 하는 당과 또는 과자 등에 0.1~15 중량부 첨가하여, 조제물로 하여 기능성 식품으로 할 수 있다.

또한, 예를 들면, 카무트 소맥 신록의 즙, 적색 피망, 당근, 사과 등의 채소나 과일을 동결 건조한 분말에, 후술하는 양으로 첨가하여 서플먼트로 할 수도 있다.

한편, 상기의 요거트, 간장, 음료 등에 첨가하는 경우에는, 이들 중에서 본 발명의 조성물이 결정화되어 침전되지 않도록 하기 위해, 용해 조제나 안정화제를 적절히 첨가할 수도 있다.

또한, 본 발명의 조성물을 단독으로, 또는 2종 이상을 혼합하여, 종래의 방법에 따라, 예를 들면, 상기의 채소나 과일을 동결 건조한 분말에 후술하는 양으로 첨가하여, 분제, 과립제, 정제, 캡슐제로 함으로써, 건강식품으로 할 수 있다.

여기에서, 본 발명의 조성물을 분말로 하기 위해서는, 생성 과정에서 얻어진 추출물을 농축하고, 동결 건조, 스프레이 드라이, 진공 건조 등의 방법을 이용하여 건조시키고, 샘플 밀, 블렌더, 믹서 등에 의해 건조 고체를 분쇄하면 좋다. 또한, 필요에 따라, 콘스타치, 감자 전분, 덱스트린, 시클로 덱스트린, 굴 껍데기 분말 등을 첨가해도 좋다.

또한, 상기한 바와 같이 하여 얻은 분말에 적절히 상기한 결합제를 첨가하여 타정하고, 정제로 할 수도 있다. 정제로 한 후에, 상기한 백당 또는 젤라틴 등의 코팅제를 사용하여, 당의정으로 해도 좋고, 다른 코팅제를 이용하여 장용제 등으로 할 수도 있다.

또한, 상기한 바와 같이 하여 얻은 분말을 종래의 방법에 따라 과립으로 하여, 과립제를 제조할 수도 있다. 또한, 상기의 분말이나 과립을 상기한 캡슐에 적당량 충전함으로써, 캡슐제로 할 수도 있다.

또한, 상기 조성물의 함유량은 상기 식품 중에 1~1,000㎎/100g인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 실험예에서, 당대사 질환 등의 환자가 상기 ARC가 포함된 각각의 식품을 소정의 기간, 소정의 횟수, 소정의 분량을 섭취함으로써, 당대사 질환 등의 진행의 예방 및/또는 당대사 질환 등의 치료를 할 수 있다. 당대사 질환 등의 잠재적인 환자가 상기와 마찬가지로 실시함으로써 당대사 질환 등의 발병을 예방할 수 있다.

종래의 연구에서, 비만으로 유도된 인슐린 저항성은 비만 지방조직에서 병적인 염증 매개체의 분비와 함께 만성 염증을 동반하는 것을 제안하였다. 이는 조직 염증의 감소가 비만-관련 대사증후군을 개선하는데 필수적일 수 있음을 명시한다.

TNFα, MCP-1과 IL-6을 포함하는 몇몇 사이토카인은 비만 및 당뇨병 환자의 지방조직 대식세포의 증가된 수와 연관되어있다. 비만의 맥락에서 염증의 원인이 아직 완전히 명확하지는 않지만, 지방조직으로 대식세포의 침윤은 중심 사건 듯 보인다. 지방세포에서 분비된 MCP-1은, 지방조직으로의 대식세포 침윤을 자극한다. 지방조직이 모집되어 질 때, 활성화된 대식세포는, 성숙된 지방세포에서 FFAs와 MCP-1의 분비를 더욱 자극하는 TNFα를 분비한다.

TNFα는 또한, 지방세포에서 지방분해를 활성화하는 IL-6의 분비를 유도한다. 따라서 지방세포에서 유래된 FFAs와 대식세포-유래된 TNFα을 포함하는 사이토카인 파라클린(paracrine) 루프는, 비만 지방조직에서 염증을 악화시키는 악순환의 고리를 수립한다.

종래 연구에서는, ARC가 3T3-L1 지방세포에서 PPAR 리간드 바인딩 활성과 향상된 인슐린 감도를 갖는 것을 나타내고 ARC의 항염증 효과에 초점을 맞추었다. 현재 연구에서는, ARC가 ob/ob 마우스에서 혈장 FFA 농도를 감소시키는 경향과 혈장 MCP-1과 IL-6 농도를 두드러지게 감소시키는 것을 발견하였다.

상기 파리리핀 A(perilipin A)는 PPARγ의 수준 유전자로, 세포 내 TG 지질 방울의 표면을 감싸고, TG 지질 방울에 리파아제의 접근을 제한하여 지방분해를 조절한다. PPARγ은 지방세포 분화, 지질과 당의 대사 및 염증에서 중요한 역할을 한다. TZDs와 15-디옥시-Δ12, 14-프로스타 글란딘 J2를 포함하는 PPARγ 아고니스트은, 지방세포에서 PPARγ를 활성화하여 TNFα의 효과를 억제하는 것으로 보고되었다. PPARγ아고니스트는 TNFα, IL-6과 MCP-1 유전자 발현 및 단백질 분비를 억제시킨다. PPARγ의 이러한 항염증 효과에 대한 근본적인 분자 메커니즘은 두 개의 서로 다른 경로를 포함할지도 모른다. 첫째, PPARγ는 핵 인자-B(NF-κB)와 같은 전구 염증 전사 인자를 저지하는 것처럼 보여진다. 둘째, PPARγ는 염증 유전자 전사에 따라, 유전자 프로모터 영역에서 공동-억제 복합체의 제거를 방지한다.

이전에 ARC는 PPARγ의 리간드이며, TNFα로 차단되어 지방세포 분화를 유도한다는 것을 보고했다. 또한, ARC는 RAW264 대식세포에서 NO 생산 감소하고, 본 실험예의 생체외 결과와 일치하며, TNFα로 자극된 HEK293 세포에서 NF-κB의 활동을 억제하는 것으로 보고되었다. 현재 연구에 따르면, ARC는 또한, PPAR의 mRNA와 단백질 발현과 TNFα-자극된 지방세포에서 파리리핀 A(perilipin A)인 표적 유전자를 복원한다. 이러한 결과를 기초로, ARC가 NK-κB활성을 억제하고 PPARγ를 활성화함으로서, FFAs와 특정 염증 매개체의 생산을 억제할 가능성이 있으나, 그것은 항염증 특성에서 ARC의 가능 대사를 밝히기 위한 조사가 추가로 요구된다.

이하에, 실시예, 배합예, 제제예 및 실험예를 들어 본 발명을 보다 상세하게 설명하나, 본 발명은 이들에 한정되는 것이 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. PPAR γ 리간드의 결합 시험

(1) 통계 해석

모든 정성 데이터는 독립적으로 3회 이상의 실험을 수행한 후에, 대표적인 것을 나타냈다. 정량값은, Origin 6.0 소프트웨어를 사용하여, 평균치 ± 표준 오차로 나타내고, 분산 분석(ANOVA)으로 비교했다. 위험율 p<0.05로 통계학적으로 의미 있다고 판단했다.

(2) 세포 배양

쥐 전구 지방세포 3T3-L1((독일) 이화학연구소 바이오리소스센터)은, 10％ 소 혈청, 100U/mL의 페니실린, 100μg/mL의 스트렙토마이신을 포함하는 10％ Dulbecco's modified Eagle's 배지(DMEM)(이상의 시약은, 모두 Gibco BRL사 제)를 사용하여, 37℃에서 가습, 5% CO₂의 조건하에 배양했다. 특별히 기재하지 않는 한, 배양의 조건은 이하의 실험에서도 마찬가지이다.

(3) 지방세포 분화

3T3-L1 지방세포를 배양하여, 칸플루언트(confluent)로 된 날로부터 이틀 후를 0일째로 하여, 이틀 동안 배양을 하고, 전구 지방세포 3T3-L1을 분화시켰다. 배지는, 0.5mM의 IBMX(3-isobutylmethylxanthine ; Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제), 10μg/mL의 인슐린(INS ; Sigma-Aldrich사 제), 0.25μM의 DEX(dexamethasone ; Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제) 및 10％ 소 태아 혈청(FBS ; Biosource, Inc. 제)을 포함하는 DMEM(MDI diferenciation media사 제)을 이용했다.

이틀 후, 상기의 배지를 10μg/mL의 인슐린 및 10％ FBS를 포함하는 DMEM로 치환하고, 또한 이틀 동안 배양하여, 그 후, 10％ FBS를 포함하는 DMEM로 교체했다.

분화 개시로부터 6~8일 경과한 지방세포를 이하의 시험에 사용했다. 특별히 기재하지 않는 한, 이하의 실험에서 수행하는 분화 유도 조건은 마찬가지이다.

(4) PPARγ 리간드 결합 시험

PPARγ 리간드 결합 활성은, Lanthascreen TR-FRET Peroxisome Proliferator Activated Receptor γ Coactivator Assay Kit(Invitrogen사 제)를 사용하여, 첨부된 순서에 따라 측정했다. 반응액에는 용매만, 0.1~100μM의 ARC(ARC), 10μM의 15-Deoxy-Delta-12,14-prostaglandin J2(15d-PGJ2 ; SIGMA사 제), 1μM의 RSG(RSG ； Alexis Biochemicals사 제) 중 어느 하나를 첨가했다.

그 후, 520㎚/495㎚의 TR-FRET비를 여기 파장 340㎚, 발광 파장 520㎚ 및 495㎚에서, EnVision^TM 멀티 리더(Perkin-Elmer. Inc. 제)를 이용하여 측정하고, 얻어진 값으로부터 구했다. 1μM의 RSG 및 10μM의 15d-PGJ2는 의미 있게 높은 TR-FRET값(520㎚/495㎚비)을 나타냈다.

한편, ARC는 농도 의존적으로 TR-FRET값이 상승하고, 1μM 및 100μM에서 의미 있게 높은 값을 나타냈다(표 1 및 도 1). 이상의 결과로부터, ARC가 PPARγ의 리간드로서의 구조를 포함하고, PPARγ의 아고니스트 또는 부분 아고니스트(partial agonist)로서 작용하는 것으로 나타났다.

(용매에 대하여 ^* P<0.05)

(5) PPARγ 표적 유전자의 단백질 발현량 측정

PPARγ 표적 유전자의 단백질 발현량은, 면역 블롯에 의해 측정했다. 면역 블롯 시험에서 사용한 세포 용해액의 조성은 이하와 같다.

150mM 염화나트륨, 1mM 에틸렌디아민 사초산(EDTA), 1% 트리톤 X-100, 1% 디옥시콜산 나트륨, 0.1％ 도데실 황산나트륨(SDS), 1mM 불화 페닐메틸술포닐(PMSF)을 포함하는 50mM 트리스 염산 완충액(pH7.4)

1차 항체 : 항aP2 폴리클로날 항체(cell signaling Technology Inc. 사 제)

2차 항체 : HRP-linked anti-rabbit IgG(GE Healthcare사 제)

완전히 분화된 3T3-L1 지방세포를 10~30μM의 ARC, 또는 1μM의 RSG의 존재하에서 48시간 배양하고, PBS에서 세정하여, Total 단백질을 조제했다.

50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1mM PMSF를 포함하는 lysis buffer를 첨가하여 세포를 벗겨내고, 얼음 위에서 30분간 둔 후, 원심(12000xg)을 행하여 웃물을 회수하여, 단백질을 얻었다.

이 단백질 20μg을 10％ SDS 폴리아크릴 아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분리하고, 이를 불화 폴리비닐덴(PVDF)막에 전사했다. 0.1％ tween 20 및 스킴 밀크를 용해한 트리스 완충 생리 식염수(TBS)로 이루어지는 블록킹 완충액을 사용하여, 상기 PVDF막을 블록킹하고, 1차 항체인 항aP2 폴리클로날 항체 및 ２차 항체인 HRP-linked anti-rabbit IgG로 블롯했다. 항원과 항체의 복합물은 chemiluminescence(GE Healthcare사 제)로 검출했다.

결과를 도 2에 도시한다. ARC의 농도에 의존하여 aP2의 발현량이 많아진 것이 확인되었다(도 2).

(6) PPARγ 표적 유전자의 mRNA 발현량 측정

완전히 분화된 3T3-L1 지방세포를 10~30μM의 ARC 존재하에서 48시간 배양하여, 해당 세포로부터 전체 RNA를 추출했다. RNA 추출은 이하와 같이 행했다. ISOGEN ((주)NIPPON GENE 제)을 이용하여, 세포로부터 전체 RNA를 추출했다. 각 시료 및 대조로부터 추출한 1μg의 전체 RNA에 기초하여, oligo d(T) 및 Reverse Transcript System(Promega Corp.제)을 사용하여 역전사를 행하고, cDNA를 얻었다.

정량 실시간- PCR은 이하와 같이 행했다. 얻어진 cDNA를 사용하여, ABI Prism 7300 장치(Applied Biosystems사 제)에 의해 실시간-(real time)-PCR을 행하고, 유전자의 발현량을 정량했다. 반응액은 SYBR(등록상표) Green reaction buffer(Roche사 제)로부터 작성했다. 내부 표준은 β-actin 유전자를 이용했다.

PCR의 사이클 조건은, 50℃ 2분, 95℃ 10분이라는 사이클을 1 사이클로 하고, 그 후 95℃ 15초, 60℃ 1분의 사이클로 하고, 40 사이클 반복했다. 정량은 triplicate(n=3)으로 각 3회 행했다.

프라이머 서열은 이하와 같다.

aP2 primer1 [5'-CAACCTGTGTGATGCCTTTGTG-3'] (서열번호 1)

aP2 primer2 [5'-CTCTTCCTTTGGCTCATGCC-3'] (서열번호 2)

β-actin primer1 [5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3'] (서열번호 3)

β-actin primer2 [5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'] (서열번호 4)

이 전체 RNA를 사용하여 합성한 cDNA에 대하여, 정량 실시간- PCR 시험을 행했다. 결과를 표 2 및 도 3에 나타낸다. ARC의 농도에 의존하여 aP2의 신호가(signal) 강해지는 것이 나타났다. 이상으로부터, ARC가 아고니스트로서 지방세포 중의 PPARγ를 활성화함으로써, PPARγ의 표적 유전자 aP2의 발현이 향상된 것으로 나타났다.

실시예 2. 지방세포의 분화 촉진제에 대한 시험

(1) 분화 유도 배양

10％ 소 혈청을 포함하는 DMEM에서 배양한 전구 지방세포 3T3-L1을, 10％ FBS를 함유하는 DMEM 중에, 표 3에 나타내는 농도의 ARC 또는 GW9662(시그마알드리치사 제)를 첨가한 각 배지, 및 또한 1μg/mL의 인슐린을 첨가한 배지 중에서, 24 웰 플레이트를 사용하여, 37℃에서 9일 동안 배양했다. 배양 기간 동안, 3일마다, 신선한 배지로 교체했다.

(2) 오일 레드 O 염색

오일 레드 O(시그마알드리치사 제)는, 60％ 이소프로판올에 0.5％가 되도록 용해하고, 여과하여, 오일 레드 O 염색액을 조제했다.

상기한 바와 같이 9일 동안 배양을 행하여 세포를 분화시킨 후, 배지를 제거하고, 고정액(10％ 포르말린을 포함하는 인산 완충 생리 식염수(PBS ; phosphate-buffered saline))를 사용하여, 실온에서 1시간 세포를 고정했다. 고정액을 버리고, PBS로 3회 세정한 후, 오일 레드 O 염색액으로 실온에서 30분간 세포를 염색했다. 그 후, 오일 레드 O 염색액을 버리고, 증류수로 세포를 3회 세정하고, 그 후, 현미경 하에서 관찰을 행했다. 또한, 지방과 오일 레드 O를 이소프로판올로 추출하고, 분광 광도계로 파장 520㎚의 흡광도를 측정했다.

(3) 분화 유도된 세포의 관찰

1~30μL의 ARC 또는 1μM의 RSG 존재하에서, 상기한 바와 같이 전구 지방세포 3T3-L1을 인슐린에 의해 분화 유도하고, 오일 레드 O 염색을 행했다. 흡광도 측정의 결과는, 표 3에 나타낸다.

인슐린의 비존재하에서 실험을 수행한 경우에는, 10μM의 ARC에서의 지질의 축적량이 크게 증가했지만, 30μM에서는 감소했다.

이에 반하여, 인슐린 존재하에서는 어느 쪽의 화합물을 첨가한 군이라도 지질 축적량은 증가했지만, 특히, RSG의 증가량이 커졌다. ARC의 첨가량이 3μM 및 10μM인 경우보다도, 1μM 및 30μM일 때의 축적량이 낮아졌다.

이상에 의해, ARC는 RSG보다도 약한 지방세포 분화 촉진 작용을 갖는 것으로 나타났다. 이는, ARC를 의약 조성물로 한 경우에, 지방 축적이라는 부작용이 작은 것을 나타내고 있다.

실시예 3. PPAR γ 아고니스트 병존시의 지방세포의 분화 시험

PPARγ 아고니스트를 병존시켰을 때의 지방세포의 분화 시험을, 이하와 같이 행했다. 특별히 기재가 없는 실험 조건은, 실시예 2와 마찬가지이다.

(1) 세포 분화의 촉진

10μM의 ARC 또는 1μM의 RSG와, 10μM의 GW9662를 사용하여, 인슐린의 존재하 및 비존재하에 세포의 분화를 유도했다. ARC만, ARC와 GW9662의 병존시, RSG만, RSG와 GW9662의 병존시의 분화 유도 후의 세포를 오일 레드 O 염색을 행했다.

또한, 하기 표 4 및 도 4에는, GW9662의 농도를 변화시켰을 때의 지질 축적량비, 흡광도 측정으로 구한 결과를 나타냈다.

(인슐린( INS )을 첨가한 용매(C) 첨가군에 대하여 ^* P<0.05

인슐린을 첨가한 10μ MARC 첨가군에 대하여 ^# P<0.05

인슐린을 첨가한 1μM의 RSG 첨가군에 대하여 ^$ P<0.05)

ARC에 의한 지방 축적량은, GW9662의 농도에 거의 의존하여 저하되고, GW9662의 농도가 ARC와 동일한 10μM에 도달했을 때에 완전히 억제되었다. 이 때문에, 이 때에 작용이 길항한다고 생각되었다.

1μM의 RSG 존재하에서 배양하면, GW9662의 농도를 10μM로 한 경우라 하더라도 지방 축적의 증가는 완전하게는 억제되지 않았다.

이상으로부터, RSG와 달리, ARC는 PPARγ 안타고니스트에 의해, 그 지방세포 분화 촉진 작용을 용이하게 제어할 수 있는 것, 및 ARC에 PPARγ 안타고니스트를 첨가한 조성물의 지방세포 분화 촉진 작용은 그 첨가 비율에 따라 용이하게 제어할 수 있는 것으로 나타났다.

(2) 세포 특이적 유전자의 발현 촉진

상기 (1)과 마찬가지로, ARC 및 GW9662의 존재하에서, 인슐린에 의해 분화 유도를 행했다. 얻어진 지방세포를 사용하여, RNA 추출 및 정량 실시간- PCR 및 면역 블롯 시험을 실시예 1과 마찬가지로 행했다.

이하의 서열을 갖는 프라이머를 사용했다.

adiponectin primer1 [5'-GTTGC AAGCT CTCCT GTTCC-3'] (서열번호 5)

adiponectin primer2 [5'-CTTGC CAGTG CTGTT GTCAT-3'] (서열번호 6)

GLUT4 primer1 [5'-CCCCG ATACC TCTAC ATCAT C-3'] (서열번호 7)

GLUT4 primer2 [5'-GCATC AGACA CATCA GCCCA G-3'] (서열번호 8)

PPARγ2 primer1 [5'-GCTGT TATGG GTGAA ACTCT G-3'] (서열번호 9)

PPARγ2 primer2 [5'-ATAAG GTGGA GATGC AGGTT C-3'] (서열번호 10)

1차 항체로서, 항 Glut4 또는 항 PPARγ의 폴리클로날 항체(cell signaling Technology Inc.사 제)를 사용했다. 결과를 표 5 및 도 5에 나타낸다.

지방세포 특이적 유전자의 mRNA 발현은, 10~30μM의 ARC 존재하에서 분화된 지방세포 중에서 증가하고, 그 수준은 1μM의 RSG 존재하의 경우와 동등했다. GW9662의 영향하에서는, 전체적으로 그 발현 수준이 저하되나, 10~30μM의 ARC 존재하에서는 RSG 존재하와 동등한 수준으로, 그 발현이 증가했다.

도 6에 도시하는 바와 같이, 지방세포 특이적 유전자의 단백질 발현은, mRNA의 경우와 마찬가지로, 10~30μM의 ARC 존재하에서 분화된 지방세포 중에서 활성화되었다. GW9662의 영향하에서도 마찬가지였다.

이상의 결과로부터, ARC를 아고니스트와 병존시키면, 지방세포 중의 지방축적을 과잉 항진시키지 않고, 좋은 사이토카인인 아디포넥틴 유전자(adiponectin)나 당수송체 유전자(GLUT4) 등의 지방세포 특이적 유전자의 발현을 촉진하는 것으로 나타났다. 한편, RSG에는, 이와 같은 효과는 볼 수 없었다.

이는, ARC와 아고니스트를 조합시키면, 비만을 과잉으로 항진시키는 부작용이 없고, 인슐린 저항성을 개선하는 것을 나타낸다. 또한, 상기 지방세포 특이적 유전자의 발현을 촉진하면서, 지방 축적의 부작용을 더욱 억제할 수 있는 것도 나타났다. RSG에는 이와 같은 효과는 볼 수 없었다.

실시예 4. 지방세포의 당 흡수 시험

(1) 분화 후의 지방세포의 당흡수

분화 후의 지방세포의 당흡수를 이하와 같은 글루코오스 소비 시험으로 검토했다. 118mM 염화나트륨, 4.7mM 염화 칼륨, 2.5mM 염화 칼슘, 1.2mM 황산 마그네슘, 25mM 인산 수소나트륨, 1.2mM 인산 이수소칼륨, 0.1％ 소 혈청 알부민(BSA), 1mM 글루코오스, 10mM Hepes 및 2mM 피르빈산 나트륨으로 이루어지는 pH7.4의 KHH(Krebs Henseleit Hepes) 완충액을 조제했다.

96 웰의 플레이트 상에서 생육하여 완전히 분화된 지방세포 3T3-L1을 후술하는 농도의 ARC를 포함하는 배지에서 48시간 배양했다. 48시간 후에 세포를 무혈청의 DMEM으로 2회 세정하고, 또한 3시간 배양했다. 3시간 후, 100㎚의 인슐린을 포함하거나 또는 포함하지 않는 KHH 완충액에 후술하는 농도의 ARC를 용해시켜 이를 첨가하고, 또한 1시간, 배양을 계속했다.

완충액 중의 포도당 농도는, 글루코오스 옥시다제(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제)를 이용한 글루코오스 옥시다제법으로 결정했다. 세포를 배양하지 않은, 배지만 들어간 웰의 전체 글루코오스량에서 피험 웰의 배지 중 글루코스량을 차감하여 세포 내에 흡수된 글루코스량을 구했다.

(+) 인슐린의 용매(C) 첨가군을 100으로 했을 때의 각 군의 포도당 소비량(mmol/L)의 비를 하기의 표 6에 나타낸다.

3~30μM의 ARC 존재하에서 배양한 분화 후의 지방세포의 글루코오스 흡수량은, ARC의 농도에 의존하여 상승했다. 30μM의 ARC는, 1μM의 RSG와 동등한 글루코오스의 흡수 활성화 작용을 나타냈다.

표 6 및 도 7에 도시하는 바와 같이, 인슐린의 존재하에서는, 30μM의 ARC 존재하에서, 글루코오스 흡수량이 크게 상승했지만, 1~10μM에서는 글루코오스의 흡수량은 그다지 큰 상승은 보이지 않았다.

((-) 인슐린 : 인슐린 비존재하의 용매(C)에 대하여, ^# P<0.05

(+) 인슐린 : 인슐린 존재하의 용매(C)에 대하여, ^* P<0.05)

상기 실시 결과로부터, ARC는 RSG와는 달리 인슐린 의존성이 약한 것을 나타내고 있으며, 인슐린을 동시 첨가했을 때에 생기는 급격한 혈당 강하라는 부작용을 피할 수 있는 것으로 나타났다.

(2) 분화 후의 지방세포의 당수송체 유전자 발현

상기와 마찬가지로, 분화시킨 3T3-L1 지방세포를 10~30μM의 ARC 또는 1μM의 RSG 존재하에서 48시간 배양하고, 마찬가지로, 세포로부터 전체 RNA 또는 단백질을 추출하여, 유전자 발현 산물의 정량을 행했다.

여기에서는, 이하의 서열을 갖는 프라이머를 사용했다.

GLUT1 primer1 [5'-GAGGA GCTCT TCCAC CCTCT-3'] (서열번호 11)

GLUT1 primer2 [5'-TCTGG AGCCA TCAAA GTCCT-3'] (서열번호 12)

표 7 및 도 8에 도시하는 바와 같이, 당수송체 유전자의 mRNA 발현은, 10~30μM의 ARC 존재하에서 배양한 지방세포 중에서 증가했다. 또한, 도 9에 도시하는 바와 같이, 당수송체 유전자의 단백질 발현도, mRNA와 마찬가지로 증가했다.

(GLUT1 : 용매(C)에 대하여 ^#P<0.05

GLUT4 : 용매(C)에 대하여 ^*P<0.05)

상기 실시 결과로부터, ARC는 분화 후의 지방세포에서 당 수송체 유전자의 발현을 증가시키는 것이 확인되고, 당의 흡수를 촉진하는 것이 시사되었다.

(3) 형광성을 가진 당에 의한 흡수된 당의 관찰

분화 후의 지방세포에 인슐린 존재하에서 글루코오스 유도체2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose(2-NBDG)(Invitrogen사 제)를 흡수시켜, ARC의 흡수 촉진 작용을 관찰했다.

도 10에 도시하는 바와 같이, 10~30μM의 ARC 및 1μM의 RSG 존재하에서, 세포 내에 흡수된 2-NBDG의 신호는 증가했다. 이 결과로부터, ARC가 당의 흡수를 촉진하는 것으로 나타났다.

(4) 세포막에 국재하는 당수송체 단백질량의 변화

분화 후의 지방세포의 세포막 획분에 국재하는 당수송체 단백질량을 면역 블롯 시험에 의해 검출했다. 도 11에 도시하는 바와 같이, 30μM의 ARC 또는 1μM의 RSG 존재하에서는 GLUT4의 국재량이 증가했다. 또한, 인슐린 존재하에서도 마찬가지였다. 이 실험 결과로부터, ARC는 세포막에 국재하는 당수송체를 증가시키는 것으로 나타났다.

(5) 인슐린 응답성의 인산화 신호의 변화

분화 후의 지방세포 중에서 인슐린에 응답하여 인산화되는 IRS-1 및 Akt의 인산화 상태를 면역 블롯 시험으로 검출했다. 1차 항체로서 항 IRS-1, 항 phospho- IRS-1(Tyr612), 항 phosphor-Akt(Ser473/T308) 및 항 Akt 폴리클로날 항체(cell signaling Technology Inc.사 제)를 이용했다.

도 12에 도시하는 바와 같이, 인슐린 비존재하, 또는 존재하의 어느 쪽의 경우에도, ARC는 IRS-1 및 Akt의 인산화 상태에 영향을 주지 않았다. 이는, ARC가 인슐린 경로에 영향을 주지 않고, 당의 흡수를 향상시키는 것으로 나타났다. 이는 ARC를 함유하는 의약 제제는, 인슐린 저항성의 세포에 대해서도 효과적으로 작용하는 것이 가능하고, 그에 따라 혈당을 컨트롤할 수 있음을 나타내고 있다. 그리고, 인슐린과의 병용이나 인슐린의 대용이 되는 혈당 강하제로서 사용할 수 있는 것도 나타내고 있다.

실시예 5. ARC 의 항 TNF -α 활성 억제 작용의 검토

(1) 지방의 축적

실시예 2와 마찬가지로, ARC 존재하에서 3T3-L1 지방세포의 분화를 유도했다. 본 실시예에서는 0~30μM의 ARC에 더해서, 5ng/mL의 TNF-α를 첨가했다.

도 13에 도시하는 바와 같이, TNF-α의 영향에 의해, 지방의 축적량은 약 50％ 저하되나, 10~30μM의 ARC를 첨가하는 것으로 회복했다.

(2) 아디포사이토카인의 발현

TNF-α 존재하에서 배양한 분화가 완료된 3T3-L1 중의 아디포사이토카인 유전자의 mRNA 발현량을 상기와 마찬가지로 측정했다.

표 8, 도 14 및 도 15에 도시하는 바와 같이, 10ng/mL의 TNF-α 존재하에서 10~30μM의 ARC 또는 10μM의 RSG는 MCP-1 및 IL-6의 발현량을 억제했다.

(용매(C) 첨가군에 대하여, ^# P<0.05.

10ng/ml의 TNF-α 첨가군에 대하여, ^* P<0.05)

(3) 글리세롤의 방출

TNF-α 존재하에서 배양한 분화가 완료된 3T3-L1로부터 분비되는 글리세롤량을 측정했다. 결과를 표 9에, TNF-α 및 피험 물질 무첨가의 글리세롤 방출량을 100으로 했을 때의,각 피험 물질 존재하의 글리세롤 분비량을 비로서 나타냈다.

도 16에 도시하는 바와 같이, 10μM의 RSG, 10μM의 NAC(N-acetyl-cysteine), 10μM의 DPI(diphenyleneiodorium), 1~30μM의 ARC, 및 40μM의 PD(PD98059)의 존재하에서는, 모두 의미 있게 분비 글리세롤량이 저하되었다.

(TNF-α 비존재하의 용매(C) 첨가군에 대하여, ^# P<0.05 , ^### P<0.001.

TNF-α 존재하의 용매(C)에 대하여, ^* P<0.05 , ^*** P<0.001)

이상의 결과로부터, ARC가 TNF-α에 유도되는 지질 분해와 지질 분비를 억제하는 것으로 나타났다.

실시예 6. 근관 세포에 대한 당 흡수 작용

L6 근관 세포를 100μM의 RSG, 30μM의 카페인산 페네틸 에스테르(CAPE) 또는 3~200μM의 ARC의 존재하, 24 웰 플레이트를 사용하여 37℃에서 24시간 배양했다. 그 후, 5mM 또는 25mM의 포도당을 포함하는 신선한 배지와 교체하여, 1시간 배양했다. 배양 상청 중의 포도당 소비량은, 시판중인 키트, 글루코오스 2Ⅱ-테스트와코(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)를 사용하여, 키트에 첨부된 프로토콜에 따라 측정했다.

저농도 배지(포도당 농도 5mM) 및 고농도 배지(25mM)의 어느 쪽을 사용한 경우에도, RSG, 카페인산 페네틸 에스테르를 첨가한 경우, 인슐린 존재하와 비존재하에서 포도당 소비량에는 거의 차이는 보이지 않았다. 200μM의 ARC를 첨가하면, 인슐린 존재하에서의 포도당 소비량은, 인슐린 비존재하에 비해 저하되었다.

이에 반하여, 3μM~100μM의 ARC를 첨가한 경우에는, 인슐린 존재하에서의 포도당 소비량이, 비존재하인 경우의 1.5배 이상으로 증가했다(표 10, 도 17 및 18). 상기 실시 결과로부터 ARC에는 근세포의 당의 흡수를 촉진하는 작용이 있는 것으로 나타났다.

^(* 1 : 용매(C)를 1로 했을 때의 포도당 소비량

^* 2 : 인슐린 비존재하에, 각 약제를 첨가했을 때의 포도당 소비량을 1로 했을 때의 포도당 소비량)

실시예 7.

(1) 재료와 방법

생후 7주째의 C57BL/6 쥐 및 생후 7주령의 C57BL/6J-ob/ob 쥐(이하, "ob/ob"라고 약칭하는 경우도 있음.)는, 일본 Charles Libber사로부터 구입했다.

통상의 쥐 먹이(표준식)로서 오리엔탈효모공업(주)의 CRF-1을 구입했다. 예비 사육으로서 표준식으로 1주 동안, 순화 사육을 수행한 후, 3주 동안 실험을 행했다. 각 군의 쥐는 8마리/케이지에서, 항온(23ㅁ 5℃), 12/12시간의 명암 사이클을 유지하여, 자유롭게 섭식시키면서 사육했다.

(2) Π형 당뇨병 모델 쥐 ob/ob에서의 ARC의 항 당뇨병 효과의 측정

정제한 ARC를 용매 5% 디메틸설폭사이드(이하, "DMSO"라고 약칭하는 경우도 있음.)와 5% tween 80을 포함하는 수용액에 용해하여, 예비 사육한 7주령의 숫컷 ob/ob 쥐에, 20mg/kg/일 또는 50mg/kg/일의 ARC를, 3주 동안, 복강 내 투여했다.

본 투여군을, 도 19 및 이하의 명세서 중에서, A20 또는 A50이라고 칭한다. 또한, 음성 대조군에는 상기 용매로 한 5% DMSO와 5% tween 80을 포함하는 수용액을 상기 동일한 조건으로 투여했다. 도 19 및 이하의 명세서 중에서, 대조 또는 대조군이라고 칭한다.

또한, 대조군, A20 및, 각각 쥐로부터 채혈하여, 시판중인 키트, 글루코오스 CⅡ-테스트 와코(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)를 사용하여, 키트에 첨부된 프로토콜에 따라 측정했다. 측정 결과를 표 11 및 도 19에 나타낸다.

데이터의 표기는 평균치 ± 표준 오차(모집단의 ｎ은 8). Student t 검정에서 대조군에 대하여 ^*는 p<0.05이다.

(3) 당뇨병 모델 쥐에서 ARC 섭취가 건강 상태에 주는 영향의 측정

쥐의 섭식량 측정은 상기와 같이 행했다. 3주 동안의 투여 기간 중의 각 군의 섭식량을 측정한 바, A20, A50, 및 대조의 각 군 사이에는 체중 변화량에 의미 있는 차이는 보이지 않았다. 이상으로부터, 상기의 농도의 ARC를 섭취하더라도, 당뇨병 모델 쥐의 섭식량에는 영향이 없는 것으로 나타났다.

ARC 투여군(A20 및 A50)과 대조군 사이에는, 체중 변화량에 의미 있는 차이는 보이지 않고, 상기의 농도의 ARC를 섭취하더라도 당뇨병 모델 쥐의 체중 증가에는 영향이 없는 것으로 나타났다.

[ 배합예 ]

ARC 및 GW9662를 1:1로 혼합한 본 발명의 조성물을 사용한 식품의 배합예를 이하에 나타낸다. 각 배합예는 기능성 식품, 건강식품의 어느 것으로도 할 수 있다.

배합예 1. 츄잉검

배합예 2. 구미

배합예 3. 캔디

배합예 4. 요거트( 하드소프트 )

배합예 5. 소프트 캡슐

배합예 6. 커피 음료

배합예 7. 커피 음료(분말)

배합예 8. 청량 음료

배합예 9. 정과

[ 제제예 ]

다음으로, 본 발명의 조성물을 함유하는 제제예를 나타내나, 본 발명은 이들에 한정되는 것이 아니다.

제제예 1. 정제

상기의 성분을 각각 칭량하고, 균일하게 혼합한 후에 압축 타정하여 중량 300㎎의 정제를 제조할 수 있다.

제제예 2. 경캡슐제

상기의 성분을 각각 칭량하고, 균일하게 혼합한 후, 경캡슐에 300㎎씩 충전함으로써, 경캡슐제를 제조할 수 있다. 여기에서, 조성물 1은 ARC와 GW9662와 유당을 1:1:1로 혼합한 것이다. 한편, 제제예 3~6에서 사용하는 조성물 1은 상기와 동일한 것이다.

제제예 3. 연캡슐제

상기의 성분을 각각 칭량하고, 균일하게 혼합한 후, 연캡슐에 100㎎씩 충전함으로써, 연캡슐제를 제조할 수 있다.

제제예 4. 과립제

상기의 성분을 각각 칭량하고, 균일하게 혼합한 후, 종래의 방법에 따라 과립제를 제조할 수 있다.

제제예 5. 시럽제

상기의 성분을 각각 칭량하고, 당 및 사카린을 주사용 증류수 60mL에 용해한 후, 글리세린 및 에탄올에 용해된 조성물 2 및 조미료의 용액을 첨가한다. 이 혼합물에 정제수를 첨가하여, 최종 용량을 100mL로 함으로써, 경구 투여용의 시럽제를 제조할 수 있다.

제제예 6. 과립제

[실험예]

ARC는 지방세포와 대식세포 간 상호 염증작용을 억제하고, ob/ob 비만 당뇨병 쥐(mice)에서 고혈당과 고지혈증을 개선시킨다.

(1) 실험예의 요약

비만에서, 지방조직내의 만성적인 저수준의 염증은 제 2형 당뇨병과 인슐린 저항성 발병에 기여한다. 여기, 본 실험에서는 지질 대사 및 염증의 이상에서 ARC의 효과를 조사했다. 본 실험은 3T3-L1의 지방세포와 RAW264 대식세포의 공동배양에서, 염증 상호작용에 ARC의 억제 효과와 복강 내로 처리된 당뇨병 비만 ob/ob 쥐에서 고혈당의 효과를 조사하였다. 공동배양에서, ARC는 종양 괴사인자(TNF)-a, 단핵구 화학주성 단백질 (MCP) -1, 인터루킨 (IL) -6 및 자유 지방산의 생산의 mRNA 발현을 억제했다. ARC는 또한, 팔미트산으로 처리된 RAW264 대식세포에서 IL-6과 MCP-1의 mRNA발현을 약화시켰다. 3T3-L1 지방세포에서, ARC는 지방분해와 IL-6 및 MCP-1의 발현을 유도하는 TNF-α를 저해하였는데, 상기 지방분해는 퍼옥시솜 증식제 응답성 핵내 수용체-γ(Peroxisome Proliferated Activated Receptor-γ; PPARγ) 와 파라클린의 하향조절로 회복된다.

in vivo에서 , ob/ob 쥐에 50mg/kg ARC는, 혈장 포도당, 중성지방(트리글리세리드) 및 총 콜레스테롤 수준을 감소시켰고, 포도당 과민반응을 개선하였다. 또한, ARC는 ob/ob 쥐 혈장에서 MCP-1과 IL-6 농도를 감소시켰다. 본 실험예는 ARC가 지방세포와 대식세포간의 염증 상호작용을 억제하고, 고혈당증과 고지혈증을 개선시키는 것을 보여준다. ARC는 인슐린 저항성의 치료 및 예방에 대한 유익한 효과를 주는 것으로 제안된다.

실험예 1. 시료의 준비

ARC는 ((E) -3 - [4 - 히드 록시 -3,5 - 비스 (3 - 메틸 -2 - butenyl) 페닐] propenoic 산), 3 isobutylmethylxanthine (IBMX), dexamethasone과 BSA는, Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Osaka, Japan)에서 구입하였다. 팔미트산염(Palmitate)은 시그마(세인트 루이스, MO, USA)에서 구입하였다. 사이버(SYBER) 그린 반응 버퍼는 로슈에서 (만하임, 독일)구입하였다. perilipin A와 PPARγ에 대항하는 다클론성(Polyclonal) 항체는, Cell Signaling Technology Inc. (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. 서양고추냉이 과산화효소가 결합된 항-토끼 IgG는(Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG) Amersham (Buckinghamshire, UK)에서 구입하였다. ARC 브라질 녹색 프로폴리스의 분리는 Akitayahonten Inc. (Gifu, Japan)에서 구입하였다. 천연 녹색 프로폴리스 (1kg)은 1개월 간 메탄올 (4 L)로 추출하였다. 추출물은 여과 및 농축하였으며, 에틸 아세테이트와 물로 분할되었다. 에틸 아세테이트에 녹는 용해분할(174g)은 실리카겔 오픈 형(silica gel open column) (에틸 아세테이트 BW-820M, 후지 Silysia 화학 (주), 일본, 8시 2분 = 헥산 BW 실리카 겔)를 사용하여 분류되었다.

용해분할된 용출분수(eluted fractions)(50.5 g)의 일부(15g)는 추가로 ODS 실리카겔(Cosmosil 75C18-OPN, 메탄올 70 % 수성 메탄올)을 사용하여 분류되었다. 용출파벌(eluted factions)(6g)은, 그 결과로서, 정통 화합물의 데이터 비교뿐만 아니라, 1H-NMR 데이터 분석에 의해, ARC로 설립되었다.

실험예 2. 세포의 배양과 분화

3T3-L1 전구 지방세포 및 RAW264 대식세포는 RIKEN BioResource 센터 (츠쿠바, 일본)에서 얻었다. 세포는 37℃, 5% CO2의 습한 대기에서, 10% 소태아혈청(FBS; Biosource Inc., Camarillo, CA, USA)과 항생제(100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin; Gibco BRL)가 보충된, DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium; Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)배지에서 자랐다. 포화된 후(0일로 정의된) 2일에서, 3T3-L1 전구 지방세포의 분화를 위해, 세포는 10% FBS를 포함하는 DMEM에서 0.25 μM의 덱사메타손(dexamethasone) 0.5 mM IBMX, 10 μg/ml의 인슐린을 포함하는 분화 배지에서 인큐베이션되었다. 이틀 후, 세포 배양배지는, 10% FBS와 10 μg/ml의 인슐린을 포함하는 DMEM으로 교체되었고, 그 후, 이틀 후, 10% FBS를 포함하는 신선한 DMEM를 교체하였다. 지방세포는 초기 분화 후, 8-14일에 이용되었다.

실험예 3. 지방세포와 대식세포의 공동배양

분화된 3T3-L1 지방세포는(14일) RAW264 대식세포와 공동배양하였다. 3T3-L1 지방세포와 RAW264 대식세포는 종래의 상호연결 방식으로 공동배양되었다. 간단히 말해, 분화된 3T3-L1 지방세포(14일)는 12시간동안 2% 지방산이 제거된 BSA를 포함하는 DMEM에서 지시농도의 ARC로 인큐베이션되었다. 다음, RAW264 대식세포는 (1.5 ㅧ 105 세포 / ML) 24시간동안 2% 지방산이 제거된 BSA를 포함하는 지시농도의 ARC를 포함/비포함하여 디시(dish)에 플레이트하였다. 처리 24시간 후, 배양된 세포는 수집하여 측정될 때까지 -20℃에 저장된다. 배지로 방출되는 FFA의 양은 NEFA C-테스트(Wako Pure Chemical Industries)로 분석하였다. 96-웰 플레이트에서 배양된 3T3L-1 지방세포(8일)의 지방분해 분석은 2% BSA(지방산이 제거된)로 보충된 혈청이 제거된 DMEM에서 하룻밤 동안 배양되었다.

다음 날 아침, 세포는 24시간동안 10 ng/ml TNF-α의 포함/비포함하여 지시 농도의 ARC로 처리되었다. 배양배지의 글리세롤 함량은 비색분석(colorimetric assay)(Glycerol Reagent; sigma)을 이용하여 결정되었다.

실험예 4. 방출된 질소 산화물 측정

RAW264 대식세포는 96-웰 플레이트(1.5 ×10(의 5제곱) cell/ml)에 분배되었으며, 24시간 동안 2% BSA(지방산 제거된)가 보충된 혈청이 제거된 DMEM에서 ARC의 지시 농도와 250 μM 팔미트산 염으로 처리되었다. 세포가 제거된 배양 상등액(supernatant)에서 아질산염의 양은 Griess 시약을 사용하여 측정하였다.

실험예 5. 동물 및 처리

7주 된 수컷 C57BL/6J Lep ob/ob (ob/ob) 쥐(mice) 및 린 (Lean) 한배에서 낳은 새끼(형제)(littermates)는 Charles River Japan (Kanagawa, Japan)에서 구입하였고, 12시간의 빛/어둠의 주기(08:00~20:00시에 빛)로 습도-조절된 조건과 (23 ± 3℃)의 온도 하에서 개별적으로 보관되었다. 실험기간 동안, 모든 쥐는 표준 설취류 정상-지방 식단(NFD) (CRF-1 찰스 강 (Charles River))을 유지하였다. 쥐는 물과 음식의 접근이 자유롭게 허용되었다. 연구는 중부 대학의 동물 실험위원회로 인가되었고, 쥐는 그들의 지침을 따라 적합하게 유지하였다.

32마리의 쥐는 처리군으로 나뉘었다(n=8/그룹): lean 대조군 (린), ob/ob 대조군 (ob/ob-C), ob/ob + 20 mg/kg ARC (ob/ob-20ARC)와 ob/ob + 50 mg/kg (ob/ob-50ARC). 쥐는 5주 동안 하루에 한 번씩, 단독으로, 또는 20 또는 50 mg/kg의 ARC를 수송기구(5 % DMSO 5% Tween-80 H2O)로 복강 내 투여하였다. 실험 기간 동안, 쥐는 물과 음식의 접근이 자유롭게 허용되었다. 몸무게는 2주마다 측정하였고, 음식 섭취는 매일 측정하였다.

실험예 6. 혈장 및 조직의 수집

이전에, 동안과 실험기간의 끝에서, 금식 및 비금식 혈액 샘플은 생화학 혈장 분석을 위해 쥐의 꼬리 정맥에서 수집되었다. 급식 5주 후, 쥐는 혈액 수집 직후, 자궁경부 전위에 의해 사망했다. 혈장 샘플은 4℃에서 10분간 10,000ㅧg으로 원심 분리하여 얻고 사용할 때까지 -80℃에 저장하였다. 간, 골격근과 흰 지방조직(WAT; 피하, 부고환, 장간막, 후복막에서)은 제거되고, 무게를 측정한 뒤, 액체질소로 냉동되었으며, 이후 사용할 때까지 -80℃에서 저장되었다. 수집된 혈액은 하룻밤 4℃에서 보관되고, 혈청은 4℃에서 10분간 10,000ㅧg으로 혈액을 원심 분리하여 얻었다. 그 결과인 혈청은 사용할 때까지 -80℃에 저장되었다.

실험예 7. 구강 포도당 내성 검사

급식 4주 후, 쥐는 16시간 동안 금식하고, 그 후 D-글루코오스(sigma)의 2g/kg 체중으로 구강내 투여하였다. 혈액 샘플은 지정된 시간에 꼬리 정맥에서 수집하였고, 포도당 농도는 포도당 C-II 테스트(Wako Pure Chemical Industries)를 이용하여 측정하였다.

실험예 8. 생화학적 분석

혈장 포도당, 중성지방(TG), NEFA와 총 콜레스테롤 (TC) 수준은 상업 효소 분석 키트를(포도당 C II-Test, 중성지방 E-Test, NEFA C-테스트 및 콜레스테롤 E-Test; Wako Pure Chemical Industries)를 이용하여 결정되었다. 혈장 인슐린, 아디포넥틴(adiponectin), MCP-1과 IL-6 수준은 효소-연관된 면역분석(ELISA) 키트 (Mouse Insulin ELISA Kit (U-type); Shibayagi, shibukawa, Japan; Mouse 아디포넥틴/Acrp30, MCP-1 and IL-6; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 측정되었다.

다음과 같이 인슐린 저항성을 측정함으로서 항상성 모델 평가 (HOMA) 색인은 단식 혈장 포도당과 인슐린 수준에서 계산되었다: HOMA = 금식 포도당 (mg/이) × 금식 인슐린 (ng/ml)/ 405.

실험예 9. RNA 제제( preparation )와 유전자 발현 분석

각 샘플에서 총 RNA 1 μg과 아이소젠(Isogen) 시약(Nippon Gene, Tokyo, Japan)을 사용한 세포에서 분리된 총 RNA는 무작위 프라이머와 역전사 시스템(Promega, Piscataway, NJ, USA)을 이용하여 cDNA를 역전사한다.

cDNA 합성 후, 실시간-- PCR(real time-PCR)은 ABI의 프리즘 7700 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하여 수행되었다.

모든 반응은 다음과 같은 프로토콜 사용하여 실행되었다:

2분간 95℃; 20초간 95℃의 40주기, 20초간 60℃, 40초간 72℃와 30초간 72℃; 그리고 확장/최대 5분간 72℃에서 융해 곡선.

프라이머 가닥은 표 28에서 보여준다.

(실시간- - PCR 에 사용되는 프라이머 가닥)

(TNF-α (서열번호 13), NM_031168 (서열번호 14), IL-6 (서열번호 15), NM_031168 (서열번호 16), MCP-1 (서열번호 17), NM_011333 (서열번호 18), perillipin (서열번호 19), NM_175640 (서열번호 20), β-actin (서열번호 21), XM_001473623 (서열번호 22))

모든 샘플은 β-액틴의 발현에 대해 표준화되었다. mRNA의 발현 수준은 각 실험의 대조의 상대적인 비율로 표시된다.

실험예 10. 단백질 추출 및 면역 블로팅 ( immunoblotting )

세포는 얼음처럼 차가운 생리 인산염 버퍼로 세척하고 용해 버퍼(50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM 염화나트륨, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.5% 데옥시콜산나트륨(sodium deoxycholate), 0.1% SDS, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride(PMSF))로 수득하였다. lysates는 20분간 12,000 × g에서 원심 분리되었고, 상등액이 수집되었다. 추출물의 단백질은 10 % SDS 폴리아크릴아미드(polyacrylamide)의 겔 전기영동으로 분리되고, 폴리염화비닐 디플루오린화물(difluoride)의 막에 전기적이동(electrotransferred)했다. 막은 차단버퍼(Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20 and 5% nonfat dried milk)를 차단하고, 1차 항체와 적절한 2차 항체를 배양한다. 항원-항체 복합체는 chemiluminescence (Amersham)에 의해 발견되었다.

실험예 11. 통계 분석

모든 질적 데이터는 적어도 세 독립적인 실험을 대표한다.

양적 데이터는 수단 ± 평균의 표준 오차 또는 ± 표준 편차로 표시되며, Dunnett의 다중 비교 시험과 분산의 편도 분석에 의해 비교된다. P <0.05의 값은 통계적으로 중요성을 나타내는 것으로 간주된다. 통계학적으로 상당한 중요성이 인정된다.

본 발명의 실험예에서 다음과 같은 효과를 확인하였다.

(1) 지방세포와 대식세포의 공동배양의 염증활성에서 ARC 의 효과

지방세포와 대식세포간의 염증 상호작용에서 ARC의 효과를 조사하기 위해, 공동배양된 3T3-L1 지방세포와 RAW264 대식세포를 다양한 농도의 ARC로 처리하였다. 본 실험예에서 테스트한 ARC의 농도 중 어느 하나도, 24시간동안 처리한 후, 3T3-L1 지방세포 또는 RAW264 대식세포의 생존에 영향을 미치지 않았다. 공동배양은 TNFα, MCP-1과 IL-6 등의 염증 매개체의 mRNA 발현 수준에서 표시된 증가를 보여 주었고(도 20a~20c), ARC의 투여는 TNF-, MCP-1과 IL-6 (P <0.05)의 발현을 현저히 감소시켰다. 또한, 대식세포와 지방세포의 공동배양은 지방세포에서 혼자에 비해 배지에서 현저하게 FFA 수준이 증가되었다. 이 공동배양에서 ARC의 처리는 복용-의존 방식 (P <0.05) (도 20d)에서 FFAs의 분비를 현저히 억제한다.

(2) RAW264 대식세포에서 염증 매개체의 팔미트산염으로 유도된 발현에서 ARC의 효과

이것은 이전에 3T3-L1 지방세포와 RAW264 대식세포의 공동배양이 FFA의 방출을 현저히 증가시켰다고 보고되었는데, 상기 FFA의 방출은 , TNF-α 신호를 차단하여 억제된다. 또한, 팔미트산염과 같은, 포화 지방산 (FAS)은, RAW264 대식세포에서 TNFα mRNA의 발현을 현저하게 유도하였는데, 이때 상기 팔미트산염은 3T3-L1에서 방출된 주요 FFA이다. 따라서, 대식세포의 염증활성이 유도된 FFA에 ARC의 효과를 조사하였다. 도 21과 같이, 250 μM 팔미트산은 TNF-α, MCP-1과 IL-6의 mRNA 발현과 일산화질소 반응을 현저하게 강화시켰다. 30 M의 ARC는 TNF를 감소시키지는 않지만(P <0.05), MCP-1and IL-6의 mRNA 발현과 일산화질소 반응을 둔화시킨다.

(3) 3 T3 - L1 지방세포의 지방분해와 TNF α-파생된 염증에서 ARC 의 효과

TNFα는 공동배양된 지방세포에서 염증의 주요 대식세포에서 유래된 파라클린 매개체이다. ARC의 항염증 효과를 명확하게 하기위해, 3T3-L1 지방세포에서 지방분해와 TNFα으로 유도된 전구 염증 사이토카인 생산에 작용하는 효과에 대해 조사하였다. 도 22a 및 22b에서 보여주는 것처럼, 재조합 TNF-α와 3T3-L1 지방세포의 처리는 상기 ARC를 무효화함으로서 MCP-1과 IL-6의 mRNA 발현을 현저하게 증가시켰다. 또한 TNFα로 처리된 지방세포의 지방분해에서 ARC의 효과를 조사하였다. 도 22c에서 보여주는 것처럼, ARC는 현저하게 수행-의존적으로 TNFα으로 유도된 지방분해를 감소시켰다(P <0.05).

다음, TNF-자극된 지방세포에서 ARC의 항염증 및 항 지방분해 효과를 근본적인 메커니즘을 명료하게 하기 위해, 본 실험예에서 ARC가 지방세포에서 TNF에 의해 감소된 활성과 PPAR 발현에 대한 복구 여부를 조사했다. 도 22d에서 보여주는 것처럼, ARC는 TNFα으로 유도된 PPAR의 단백질 발현과 mRNA에서의 감소를 방지/예방한다. 또한, ARC는 mRNA와 단백질 수준에서, PPARγ로 항-지방분해 유전자를 조절시킴으로써, perilipin의 발현을 증가시킨다.

(4) ob / ob 쥐의 혈당 수준 및 기타 매개변수에 대한 ARC 의 효과

인슐린 저항성의 발달에서 ARC의 효과를 생체 내에서 조사하기 위해, 5주 동안 ARC를 ob/pb 쥐에게 처리하였다. 표 29는 체중, 음식 섭취량과 장기 무게에서 ARC의 효과를 보여준다.

(체중 증가, 식품 섭취 속도와 장기 무게)

(흰 지방 조직무게와 간 무게, 식품 섭취, 몸무게는 5주간 ARC로 처리되거나 처리되지 않은 BL6/J 쥐와 ob/ob 쥐에서 측정되었다. 데이터는 ㅁ SEM (N = 8)의 의미로 표시된다. * P <0.05 vs ob/ob 대조군)

몸의 무게와 장기 무게는 ob/ob-C, ob/ob-20ARC 및 ob/ob-50ARC 그룹 사이에 차이가 없었고, 실험기간 동안 식품 섭취량에도 현저한 차이는 없었다. 비금식 혈당 농도는 3주와 5주에 ob/ob-C 그룹에서보다 ob/ob-50ARC 그룹에서 현저하게 낮았다(도 23a, P <0.05).

NEFA 농도가 비금식 상태의 ob/ob-50ARC 그룹에서 감소하는 경향이 있는 반면(p=0.058), 비록 현저하지 않을지라도, 비금식 혈장 TG와 TC는 또한 ob/ob-C 그룹(도 23b 및 23c의, P <0.05)과 비교하여 ob/ob-50ARC그룹에서 현저하게 낮았다.

(5) ob / ob 쥐의 인슐린 수준과 포도당 내성에서 ARC 의 효과

포도당 내성을 분석하기 위해, 16시간 기아처리 후, ARC를 처리하고 4주 후에 OGTTs(oral glucose tolerance test)를 수행하였다. 혈당수준은 2g/kg의 포도당 투여 후 30분에 ob/pb-C 그룹에서보다 ob/ob-50ARC 그룹에서 현저하게 낮아졌다(도 24a, P <0.05)

금식 혈장 인슐린이 ob/ob-50ARC 그룹 (도 6c)에서 의미 없이 감소하는 경향을 보여준 반면에, eh 20b와 같이, 금식 혈당은 현저하게 감소하였다.

따라서, HOMA-IR, 인슐린 저항성 마커는, ob/ob-C 그룹과 비교하여 ob/ob-50ARC 그룹에서 현저하게 향상되었다 (도 24d, P <0.05).

(6) ob / ob 쥐에서 지방세포의 혈장농도에서 ARC 의 효과

ob/ob 쥐에서 아디포넥틴, MCP-1, IL-6과 같은 비만 관련 요인의 생산에서 ARC의 항염증 효과에 초점을 맞추었다. 도 25에서 보여주듯이, 혈장 MCP-1 수준은 ob/ob-20ARC 그룹과 ob/ob-50ARC 그룹 둘 다에서 현저하게 낮아졌고(도 25, P < 0.05), IL-6 수준은 ob/ob-C 그룹에 비해 그룹 ob/ob-50ARC 그룹에서 현저하게 낮아졌다(도 25, P < 0.05) .

그러나, ART가 처리된 그룹에서 혈장 아디포넥틴 수준은, 비록 ob/ob-50ARC 그룹에서 증가하는 경향이 있을 지라도, ob/ob -C 그룹에 비교하여 현저한 변화를 보여주지 않았다.

이상 본 실험예에서, 본 발명의 ARC가 3T3-L1 지방세포와 RAW264 대식세포에서 염증 반응을 억제하는 것과 생체 내에서 인슐린 저항성을 개선하는 것을 보여주었다. 혈장 NEFA를 유도하는 다른 변수의 변화, TG와 TC는 ARC와 관련된 포도당 내성의 개선을 돕는다. 이러한 결과는 ARC가 ob/ob 쥐에서 고혈당과 고지혈증의 발달을 예방하는데 도움을 준다는 것을 명시하였으며, 이러한 효과는 지방조직에 염증 감소와 연관된다. 생체 내 결과와 생체외 연구의 일치는, 비대(hypertrophied) 3T3-L1 지방세포와 RAW264 대식세포의 공동배양이 TNFα, MCP-1과 IL-6의 발현을 현저하게 상향-조절하는 것을 보여준다. 또한 ARC가 이러한 사이토카인의 발현을 현저하게 억제하는 것을 발견하였다. 마찬가지로, ARC는 TNFα-자극된 지방세포와 FA-자극된 대식세포에서 각각 IL-6과 MCP-1의 mRNA 발현을 억제하였다. 또한, ARC는 공동배양에서와 TNFα-자극된 지방세포에서 지방분해를 감소시켰다. 이러한 결과는 ARC가 지방세포 와 대식세포의 MCP-1, IL-6 생산과 지방세포에서 TNFα으로 유도된 FFA의 방출을 억제하여, 비만 지방조직의 만성적 염증 활성을 억제한다는 것을 명시한다. IL-6의 감소 수준은, FFA 방출의 감소에 따라 지방세포에서 지방분해의 추가 활성을 방지할 수 있다. TNF-자극된 3T3-L1 지방세포에서, 또한, ARC는 PPARγ와 perilipin A의 단백질 발현과 mRNA를 복원한다.

본 실험예에서는 ARC의 항염증 및 항당뇨병 특성을 확인하였다. ARC는 공동배양에서 FFA의 분비와 MCP-1과 IL-6를 포함하는 몇몇 전구 염증 매개체의 발현을 억제한다. 또한, ARC는 TNFα-자극 지방세포와 FA-자극 대식세포에서 그들의 발현을 차단했다. 당뇨병과 인슐린 저항성 (ob/ob 쥐)의 쥐 모델에서, ARC는 혈당과 지질 수준의 변수를 수정한다. 생체 내에서 ARC는 염증성 사이토카인의 수준을 감소시킨다. 이러한 결과는 ARC가 인슐린 저항성의 치료 및/또는 예방을 위한 이로운 효과를 줄 수 있다.

본 발명은 당대사 질환의 의약 제제, 기능성 식품, 건강식품 등의 제조 및 개발 분야에서 유용하다.

<110> MYU <120> COMPOSITION FOR PROMOTING INTRACELLULAR METABOLISM, AND PHARMACEUTICAL PREPARATION FOR PREVENTING AND/OR TREATING SACCHAROMETABOLISM OR LIPID METABOLISM DISEASE, FUNCTIONAL FOOD, AND HEALTH FOOD CONTAINING THE COMPOSITION <130> IP12-008 <160> 22 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> aP2 primer1 <400> 1 caacctgtgt gatgcctttg tg 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> aP2 primer2 <400> 2 ctcttccttt ggctcatgcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> beta-actin primer1 <400> 3 tgttaccaac tgggacgaca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> beta-actin primer2 <400> 4 ctctcagctg tggtggtgaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> adiponectin primer1 <400> 5 gttgcaagct ctcctgttcc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> adiponectin primer2 <400> 6 cttgccagtg ctgttgtcat 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> GLUT4 primer1 <400> 7 ccccgatacc tctacatcat 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> GLUT4 primer2 <400> 8 gcatcagaca catcagccca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> PPAR gamma 2 primer1 <400> 9 gctgttatgg gtgaaactct 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> PPAR gamma 2 primer2 <400> 10 ataaggtgga gatgcaggtt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> GLUT1 primer1 <400> 11 gaggagctct tccaccctct 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> GLUT1 primer2 <400> 12 tctggagcca tcaaagtcct 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> TNF-alpha primer <400> 13 acggcatgga tctcaaagac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> NM_031168 primer <400> 14 cggactccgc aaagtctaag 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> IL-6 primer <400> 15 cggactccgc aaagtctaag 20 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> NM_031168 primer <400> 16 aactgatatg cttaggcata acgcac 26 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> MCP-1 primer <400> 17 aagagagagg tctgtgctga 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> NM_011333 primer <400> 18 ttcactgtca cactggtcac 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> perillipin primer <400> 19 gatcgcctct gaactgaagg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> NM_175640 primer <400> 20 gatccacatg gccagagagt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> beta-actin primer <400> 21 tgttaccaac tgggacgaca 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> XM_001473623 primer <400> 22 ctctcagctg tggtggtgaa 20

Claims (17)

1. 하기 화학식 1로 표기되는 PPARγ의 아고니스트, 그의 생리학적으로 허용되는 염 및 그들의 수화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 적어도 1종 이상 함유하는 것을 유효 성분으로서 함유하는, 세포내 대사 촉진용 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 세포내 대사는, 세포에 관련된 당대사인 것을 특징으로 하는 세포내 대사 촉진용 조성물.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 당대사는, 지방세포 또는 근관세포로의 당 흡수의 촉진인 것을 특징으로 하는 세포내 대사 촉진용 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 세포내 대사는, 세포에 관련된 지질대사인 것을 특징으로 하는 세포내 대사 촉진용 조성물.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 지질대사는 세포의 분화의 촉진인 것을 특징으로 하는 세포내 대사 촉진용 조성물.
   
6. 제5항에 있어서,
   PPARγ의 안타고니스트, 그 생리학적으로 허용되는 염 및 그들의 수화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 적어도 1종 이상 함유하는 것을 더 포함하는 세포내 대사촉진용 조성물.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 안타고니스트는, 하기 화학식 2로 표기되는 화합물 및 이들의 생리학적으로 허용되는 염 및 수화물로 이루어지는 군으로부터 선택된 것인 세포내 대사 촉진용 조성물.
   [화학식 2]
   

   

   
   
8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
   상기 아고니스트와 상기 안타고니스트의 조성비는 1 : 10 ~ 100 : 1 인
   세포내 대사촉진용 조성물.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 아고니스트와 상기 안타고니스트의 조성비는 1 : 1 내지 10 : 1인
   세포내 대사 촉진용 조성물.
   
10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 유효성분으로 하여, 소정의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 당 대사 질환의 예방 및/또는 치료용 의약 제제.
    
11. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 유효성분으로 하여, 소정의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 지질 대사 질환의 예방 및/또는 치료용 의약 제제.
    
12. 하기 화학식 1로 표기되는 리간드, 또는 그의 생리학적으로 허용되는 염, 및 그들의 수화물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 적어도 1종 이상 함유하는, TNF-α 활성억제제.
    [화학식 1]
    

    

    
    
13. 제12항에 따른 TNF-α　활성억제제를 유효성분으로 하여, 소정의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 당 대사 활성 촉진용 의약제제.
    
14. 적어도, 하기 화학식 1로 표기되는 PPARγ의 아고니스트와, 상기 PPARγ 에 대한 안타고니스트를 함유하는, 기능성 식품
    [화학식 1]
    

    

    
    
15. 제 14항에 있어서,
    상기 안타고니스트는, 하기 화학식 2로 표기되는 화합물 및 그들의 생리학적으로 허용되는 염 및 수화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인,
    기능성 식품.
    [화학식 2]
    

    

    
    
16. 적어도, 하기 화학식 1로 표기되는 PPARγ 의 아고니스트와, 상기 PPARγ 에 대한 안타고니스트를 함유하는 건강식품.
    [화학식 1]
    

    

    
    
17. 제15항에 있어서,
    상기 안타고니스트는, 하기 화학식 2로 표기되는 화합물 및 그들의 생리학적으로 허용가능한 염 및 수화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 건강식품.
    [화학식 2]
    

    

    
    

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