CN111744231A - 香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法 - Google Patents

香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法，包括如下步骤：(1)香菇发酵液的制备；(2)将香菇发酵液流经磁化的纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4，使得纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4吸附香菇发酵液中的活性成分，得到吸附活性成分的纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4；(3)将活性成分从纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4解吸附下来，得到抑制白色念珠菌生长的活性成分。利用磁化后的纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4能够很好地富集香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分，并且在逐渐减弱的交流磁场中利用饱和氢氧化钙溶液作为解吸附剂能够将抑制白色念珠菌生长的活性成分洗脱下来，可用于抑制白色念珠菌生长。

Description

香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域。具体地说是香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法。
背景技术
本申请的发明人在前期的研究工作中发现，香菇发酵液均有很好的体外抑制白色念珠菌生长及其生物被膜形成的作用【参见文献：中国酿造，2016年第5卷第1期86-89页】；但是香菇发酵液中活性成分含量低，无法在实际中用于抑制白色念珠菌，因此，必须对其抑菌活性物质进行富集，这样才有望将香菇发酵液真正用于抑制白色念珠菌。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法，可以实现更好的抑菌效果，为香菇发酵液用于抑制白色念珠菌奠定了基础。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法，包括如下步骤：
(1)香菇发酵液的制备；
(2)将香菇发酵液流经磁化的纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4，使得纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4吸附香菇发酵液中的活性成分，得到吸附活性成分的纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4；
(3)将活性成分从纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4解吸附下来，得到抑制白色念珠菌生长的活性成分。
上述香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法，在步骤(2)中，纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4的粒径为10-50nm。
上述香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法，在步骤(2)中，纳米Fe3O4的制备方法如下：在氮气保护下，将氯化亚铁和氯化铁加入到蒸馏水中，搅拌混合均匀后滴加氢氧化钠溶液，滴加完毕后再在水浴条件下继续搅拌反应2-5h，冷却后过滤，用蒸馏水洗涤所得固体，真空干燥后即得纳米Fe3O4。
上述香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法，在步骤(2)中：氯化亚铁和氯化铁的总浓度为0.2-0.5mol/L，氯化亚铁的浓度为氯化铁的浓度的二分之一；水浴温度为30-80℃，搅拌速度为500-1500r/min，反应溶液的pH为9-10。
上述香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法，在步骤(2)中，纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4的制备方法如下：将硝酸铁和硝酸钴或硝酸镍分别加入到蒸馏水中，搅拌混合均匀后滴加氢氧化钠溶液使得溶液pH大于或等于11，滴加完毕后再水浴搅拌反应1-2h，冷却后过滤，用蒸馏水洗涤所得固体，真空干燥后即得纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4。
上述香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法，在步骤(2)中：反应溶液中硝酸铁的浓度为0.2-0.5mol/L，硝酸钴或硝酸镍的浓度为0.1-0.25mol/L，且硝酸铁的浓度为硝酸钴或硝酸镍的浓度的2倍；水浴反应温度大于或等于90℃。
上述香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法，将纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4置于磁感应强度为0.2-0.5T的磁场中，并使香菇发酵液流经纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4，香菇发酵液的流速为0.2-0.5m/s，纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4与香菇发酵液的固液比为0.2-0.5g/L。
上述香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法，在步骤(3)中：将吸附活性成分的纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4加入到位于交流磁场的解吸附剂中，所述交流磁场的频率为300-400KHz，磁感应强度在30min-60min内由0.2-0.5T降低到0，解吸附剂为氢氧化钙饱和溶液。
上述香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法，在步骤(3)中：当所述交流磁场的磁感应强度变为0的时候，过滤除去纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4，然后向所得滤液中加入草酸，搅拌使草酸与氢氧化钙充分反应，过滤后即得富含抑制白色念珠菌生长的活性成分的滤液。
本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
本发明利用磁化后的纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4能够很好地富集香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分，并且在逐渐减弱的交流磁场中利用饱和氢氧化钙溶液作为解吸附剂能够将抑制白色念珠菌生长的活性成分洗脱下来，可用于抑制白色念珠菌生长；不仅实现了香菇发酵液中活性成分的富集，而且能够获得抑制白色念珠菌生长的富集液，从而可以实现更好的抑菌效果。
附图说明
图1本发明香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法中富集装置结构示意图。
附图标记为：1-入口管；2-出口管；3-富集腔；4-滤网。
具体实施方式
1、材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1食用菌与指示菌
供试香菇，本实施例中的保存菌种；白色念珠菌(Candida albicans)ATCC10231：中国普通微生物菌种保藏管理中心。
1.1.2培养基
马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基：马铃薯(去皮)200.0g、葡萄糖20g，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g，硫酸镁MgSO4·7H2O0.25g，琼脂20g，加水至1000mL。
食用菌一级摇瓶液体培养基：葡萄糖30g、蛋白胨3g、酵母2g、硫酸胺磷酸二氢钾1g、七水合硫酸镁0.5g，加水至1000mL，调节pH至7.0。
食用菌液体发酵培养基：蔗糖30g，玉米粉20g，麸皮40g，加水至1000mL，调节pH值为7.0。
沙氏琼脂(Sabouraud's agar，SDA)培养基：葡萄糖40g，蛋白胨10g，琼脂20g，加水至蒸馏水1000mL，调节pH值为4.0-6.0。
RPMI-1640培养基：赛齐(上海)生物工程有限公司。
1.1.3化学试剂
KH2PO4(分析纯)：天津市风船化学试剂科技有限公司；硫酸铵(分析纯)：郑州辰尼化学试剂厂；MgSO4·7H2O、葡萄糖(分析纯)：天津市科密欧科技有限公司；甲基四氮盐(超纯级)：上海宝曼生物科技有限公司；Countess C10227自动血细胞计数仪：南京贝登生物科技有限公司。
1.2仪器与设备
DHZ-CA大容量恒温振荡器：江苏太仓市实验设备厂；LRH-250-HS恒温恒湿培养箱：广东省医疗器械厂；DG3022A酶标仪：南京华东电子医疗装备有限公司。
2、食用菌液体发酵液的制备
2.1、香菇的活化
取出香菇，用接种环取出一小块，在含有玻璃珠的无菌水中振荡，用无菌吸管吸取0.2mL涂平板，28℃培养6d，挑取单菌落移接到斜面马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，加上棉塞，置恒温培养箱内，28℃培养6d后可见组织块上长出绒毛状菌丝，菌丝长满斜面即得斜面菌种；
2.2、液体摇瓶种子制备
在300mL三角瓶中装入食用菌一级摇瓶液体培养基100mL，接入活化的斜面菌种，斜面菌种的面积为0.4cm2，数量为5块，然后放入28℃、180r/min下的摇床培养5d，即得液体摇瓶种子；
2.3、发酵培养
300mL三角瓶中装入食用菌液体发酵培养基100mL，调节发酵液初始pH值为5，接入7％的液体摇瓶种子，于28℃、180r/min的摇床中培养8d，即得香菇发酵液。
3、纳米Fe3O4、纳米CoFe2O4和纳米NiFe2O4吸附香菇发酵液中的活性成分
3.1、纳米Fe3O4的制备方法如下：在氮气保护下，将氯化亚铁和氯化铁加入到蒸馏水中，蒸馏水事先用浓盐酸酸化至pH小于5，搅拌混合均匀，氯化亚铁和氯化铁的总浓度为0.3mol/L，氯化亚铁的浓度为氯化铁的浓度的二分之一；保持搅拌速度为1000r/min，滴加氢氧化钠溶液至反应溶液pH为9，滴加完毕后再在70℃水浴条件下继续搅拌反应5h，冷却后过滤，用蒸馏水洗涤所得固体，真空干燥后即得纳米Fe3O4。
3.2、纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4的制备方法如下：将硝酸铁和硝酸钴或硝酸镍分别加入到蒸馏水中，反应溶液中硝酸铁的浓度为0.4mol/L，硝酸钴或硝酸镍的浓度为0.2mol/L；搅拌混合均匀后滴加氢氧化钠溶液使得溶液pH为12，滴加完毕后再在90℃的水浴中搅拌反应2h，冷却后过滤，用蒸馏水洗涤所得固体，真空干燥后即得纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4。
将粒度为10-50nm的纳米Fe3O4、纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4置于图1所示的富集装置的富集腔3中，然后以纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4与香菇发酵液的固液比为0.5g/L将香菇发酵液从入口管1泵入富集腔3中，再从出口管2中泵出，香菇发酵液的流动速度为0.2m/s，此时富集腔3位于磁感应强度为0.5T的磁场中；入口管1与富集腔3之间、出口管2与富集腔3之间均设有滤网4，防止纳米Fe3O4、纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4流走，同时还可以避免香菇发酵液中的固形物吸附在纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4上而影响抑制白色念珠菌生长的活性成分的吸附量。
4、将活性成分从纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4解吸附下来，得到抑制白色念珠菌生长的活性成分
将吸附活性成分的纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4加入到位于交流磁场的解吸附剂中，纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4与解吸附的质量体积比为0.05g/mL，所述交流磁场的频率为300KHz，磁感应强度在60min内由0.5T降低到0，解吸附剂为20℃的氢氧化钙饱和溶液。当所述交流磁场的磁感应强度降低到0的时候，过滤除去纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4，然后向所得滤液中加入草酸，所加入草酸的物质的量等于氢氧化钙的物质的量，搅拌使草酸与氢氧化钙充分反应生成草酸钙沉淀和水，过滤后即得富含抑制白色念珠菌生长的活性成分的滤液。
5、抑制白色念珠菌生长测试
5.1、白色念珠菌菌悬液的配制
将白色念珠菌接种于SDA液体培养基中，35℃摇床培养48h，用RPMI-1640培养基稀释，血细胞计数板计数，调整菌悬液浓度为1×106～5×106CFU/mL。
5.2、抑菌活性的测定
抑菌纸片的制备：分别取200μL的香菇发酵液和200μL的富含抑制白色念珠菌生长的活性成分的滤液滴加于直径为6mm的灭菌纸片上。
采用K-B纸片扩散法，取白色念珠菌悬液200μL均匀涂于SDA固体培养基。取制备好的抑菌纸片5片贴于琼脂培养基表面，并放置空白对照纸片于正中心，25℃培养24h，十字交叉法测量抑菌圈直径。
结果表明：香菇发酵液抑菌圈平均直径为3.318±0.134mm，利用纳米Fe3O4富集所得富含抑制白色念珠菌生长的活性成分的滤液抑菌圈平均直径为15.521±0.068mm，利用纳米CoFe2O4富集所得富含抑制白色念珠菌生长的活性成分的滤液抑菌圈平均直径为26.867±0.305mm，利用纳米NiFe2O4富集所得富含抑制白色念珠菌生长的活性成分的滤液抑菌圈平均直径为23.750±0.269mm。
由此可见：利用磁化后的纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4能够很好地富集香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分，并且在逐渐减弱的交流磁场中利用饱和氢氧化钙溶液作为解吸附剂能够将抑制白色念珠菌生长的活性成分洗脱下来，可用于抑制白色念珠菌生长；不仅实现了香菇发酵液中活性成分的富集，而且能够获得抑制白色念珠菌生长的富集液，从而可以实现更好的抑菌效果。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。

Claims (9)

1.香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)香菇发酵液的制备；
(2)将香菇发酵液流经磁化的纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4，使得纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4吸附香菇发酵液中的活性成分，得到吸附活性成分的纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4；
(3)将活性成分从纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4解吸附下来，得到抑制白色念珠菌生长的活性成分。
2.根据权利要求1所述的香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法，其特征在于，在步骤(2)中，纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4的粒径为10-50nm。
3.根据权利要求1所述的香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法，其特征在于，在步骤(2)中，纳米Fe3O4的制备方法如下：在氮气保护下，将氯化亚铁和氯化铁加入到蒸馏水中，搅拌混合均匀后滴加氢氧化钠溶液，滴加完毕后再在水浴条件下继续搅拌反应2-5h，冷却后过滤，用蒸馏水洗涤所得固体，真空干燥后即得纳米Fe3O4。
4.根据权利要求3所述的香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法，其特征在于，在步骤(2)中：氯化亚铁和氯化铁的总浓度为0.2-0.5mol/L，氯化亚铁的浓度为氯化铁的浓度的二分之一；水浴温度为30-80℃，搅拌速度为500-1500r/min，反应溶液的pH为9-10。
5.根据权利要求1所述的香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法，其特征在于，在步骤(2)中，纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4的制备方法如下：将硝酸铁和硝酸钴或硝酸镍分别加入到蒸馏水中，搅拌混合均匀后滴加氢氧化钠溶液使得溶液pH大于或等于11，滴加完毕后再水浴搅拌反应1-2h，冷却后过滤，用蒸馏水洗涤所得固体，真空干燥后即得纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4。
6.根据权利要求5所述的香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法，其特征在于，在步骤(2)中：反应溶液中硝酸铁的浓度为0.2-0.5mol/L，硝酸钴或硝酸镍的浓度为0.1-0.25mol/L，且硝酸铁的浓度为硝酸钴或硝酸镍的浓度的2倍；水浴反应温度大于或等于90℃。
7.根据权利要求1-6任一所述的香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法，其特征在于，将纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4置于磁感应强度为0.2-0.5T的磁场中，并使香菇发酵液流经纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4，香菇发酵液的流速为0.2-0.5m/s，纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4与香菇发酵液的固液比为0.2-0.5g/L。
8.根据权利要求1-6任一所述的香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法，其特征在于，在步骤(3)中：将吸附活性成分的纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4加入到位于交流磁场的解吸附剂中，所述交流磁场的频率为300-400KHz，磁感应强度在30min-60min内由0.2-0.5T降低到0，解吸附剂为氢氧化钙饱和溶液。
9.根据权利要求8所述的香菇发酵液中抑制白色念珠菌生长的活性成分富集方法，其特征在于，在步骤(3)中：当所述交流磁场的磁感应强度变为0的时候，过滤除去纳米Fe3O4或纳米CoFe2O4或纳米NiFe2O4，然后向所得滤液中加入草酸，搅拌使草酸与氢氧化钙充分反应，过滤后即得富含抑制白色念珠菌生长的活性成分的滤液。
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