CN111733237A - 长链非编码rna lamp5-as1在mll-r白血病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了长链非编码RNA LAMP5‑AS1在MLL‑R白血病中的应用。具体的，MLL融合基因白血病病人中LAMP5‑AS1显著高表达。而且高表达的LAMP5‑AS1与病人生存率呈显著负相关；小鼠白血病模型的结果表明敲低LAMP5‑AS1的表达可显著抑制MLL融合基因白血病存活，显著延长模型小鼠的生存周期。表明LAMP5‑AS1可作为诊断标记物和/或治疗靶点在MLL‑R白血病中发挥作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，长链非编码RNA LAMP5-AS1在MLL-R白血病中的应用。
背景技术
MLL融合基因白血病，即MLL(mixed-lineage leukemia)基因重排白血病(MLL-rearranged leukemia，MLL-R白血病)，在现有的治疗手段下，五年生存率低于30％。患者由于具有治愈率较低、预后较差、治疗早期易复发等特点而使得该类型白血病的治疗仍然面临严峻的挑战，因而在近年来受到了广泛的关注。由于MLL-R白血病患者五年生存率显著低于其他白血病患者导致很多患者放弃了治疗的机会，因此，有必要采取新的方法审视该类型白血病的生物学特性，深入研究儿童MLL-R白血病的发病机理从而寻找早期诊断与新的治疗方法对有效提高MLL-R白血病病人的存活率具有重要的意义。
近年来一类长度超过200nt的长非编码RNA(long nonprotein-coding RNA，lncRNA)被发现参与到了生物发育以及多种癌症的发病机制中。与小分子的非编码RNA不同，大部分lncRNA发挥作用的机理尚不明确，目前报道一些lncRNA可以通过表观遗传学机制或在转录后水平调控mRNA与miRNA的表达，从而参与到肿瘤的发病进程中。由于lncRNA在演化中的保守性较低，因此很多lncRNA调控的分子靶标具有高度的特异性，提示lncRNA有潜力作为良好的癌症特异性治疗靶标，有关lncRNA的研究已成为当前生命科学和分子医学研究的前沿和重要领域，在乳腺癌、肝癌、结肠癌、肺癌等肿瘤中已获得重要进展。例如，CN107236817A公开了LncRNA ENST00000424523.1在胃癌诊断、治疗中的应用，CN111118156A公开了LncRNA AC012640.1在诊断和治疗膀胱癌中的应用，CN110241224A公开了lncRNA-T065925在诊断和治疗结直肠癌中的应用等。
而LncRNA在白血病中的重要调控作用逐渐被发掘，在急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblastic leukemia，ALL)和急性髓细胞性白血病(acute myeloidleukemia，AML)中，lncRNA都具有特异的表达模式，提示lncRNA在不同分型的白血病中都存在重要的调控作用。因此，针对MLL-R白血病的治疗靶点具有重要的理论和应用意义，而且也能为lncRNA在其他白血病者癌症中的作用机制和作为潜在治疗靶点提供积极的借鉴作用。但是目前关于LncRNA在MLL-R白血病中的研究还鲜有报道，而关于lncRNA与MLL融合蛋白降解的研究尚未见有报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供长链非编码RNALAMP5-AS1作为诊断标记物在制备MLL-R白血病诊断产品中的应用。
本发明的另一目的在于提供长链非编码RNA LAMP5-AS1作为治疗靶点在筛选或制备用于治疗MLL-R白血病药物中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
本发明发现一个在MLL-R白血病中特异性高表达，而在正常生理条件下及其他类型白血病低表达的lncRNA，将其命名为LAMP5-AS1(ENST00000443469.1，NR_109957，RP5-1119D9.4)。LAMP5-AS1的基因座位为人第20号染色体的反义DNA链上，其基因覆盖从9,505,180bp到9,514,998bp的范围，可以转录出长度为1928nt的lncRNA，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
本发明发现LAMP5-AS1在MLL-R白血病病人高表达。进一步，利用ROC曲线分析证实，LAMP5-AS1能够显著地区分MLL-R白血病和MLL野生型(MLL-wt)白血病病人样品；生存曲线分析得出高表达的LAMP5-AS1五年生存率显著降低，预示着LAMP5-AS1具有作为MLL-R白血病的分类器及预后指示器的潜在临床作用。
因此，本发明首先提供长链非编码RNA LAMP5-AS1作为诊断标记物在制备MLL-R白血病诊断产品中的应用。以及检测长链非编码RNA LAMP5-AS1表达量的试剂在制备备MLL-R白血病诊断产品中的应用。
本发明还提供一种MLL-R白血病诊断产品，包含检测长链非编码RNA LAMP5-AS1表达量的引物。
优选地，所述引物包含上游引物和下游引物，其序列依次如SEQ ID NO:2～3所示。
优选地，所述产品为试剂、芯片或试剂盒等。
本发明证实利用siRNA技术敲低LAMP5-AS1，发现MLL-R白血病细胞系增殖减弱，凋亡增多。而且，NOD-SCID小鼠模型实验显示，shRNA敲低LAMP5-AS1的MLL-R白血病细胞具有抑制肿瘤生长的作用。表明抑制LAMP5-AS1的表达可以抑制MLL-R白血病细胞肿瘤生长。
因此，本发明的另一目的是提供长链非编码RNA LAMP5-AS1作为治疗靶点在筛选或制备用于治疗MLL-R白血病药物中的应用。
同时还提供所述的长链非编码RNA LAMP5-AS1的抑制剂在制备用于治疗MLL-R白血病药物中的应用。
一种MLL-R白血病治疗药物，含有抑制长链非编码RNA LAMP5-AS1表达的抑制剂。
优选地，还包含药学上可接受的载体。
优选地，所述抑制剂为抑制长链非编码RNA LAMP5-AS1表达的siRNA或shRNA。
优选地，所述siRNA选自siRNA-1或siRNA-2中的一种或多种，siRNA-1序列如SEQID NO:4～5所示，siRNA-2序列如SEQ ID NO:6～7所示。
优选地，所述shRNA选自shRNA-1或shRNA-2中的一种或多种，shRNA-1序列如SEQID NO:8～9所示，shRNA-2序列如SEQ ID NO:10～11所示。
本发明还发现LAMP5-AS1这些结果说明在MLL-R白血病细胞系中，敲低LAMP5-AS1，细胞自噬会发生明显的变化，证实了LAMP5-AS1对自噬的抑制作用。
本发明发现LAMP5-AS1直接影响了MLL融合基因的蛋白水平。通过相关的分子生物学实验，证实了LAMP5-AS1是通过细胞自噬作用途径降解。
因此，本发明还提供长链非编码RNA LAMP5-AS1在制备调控MLL融合蛋白降解的制剂中的应用。
本发明通过基因工程手段调控长链非编码RNA，LAMP5-AS1的表达水平直接诱导MLL融合蛋白降解，对于靶向MLL-R白血病的精准治疗具有重要价值。同时，该发明还证实LAMP5-AS1在指示MLL-R白血病的分类及预后中具有潜在的临床实用价值。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次发现证实一个在MLL-R白血病高表达的lncRNA LAMP5-AS1，而且高表达的LAMP5-AS1与病人生存率呈显著负相关；小鼠白血病模型的结果表明敲低LAMP5-AS1的表达可显著抑制MLL融合基因白血病存活，显著延长模型小鼠的生存周期。表明LAMP5-AS1可作为诊断标记物和/或治疗靶点在MLL-R白血病中发挥作用，LAMP5-AS1能够指示该病的诊断、预后和治疗。此外，本发明还阐明LAMP5-AS1调控MLL融合蛋白的选择性自噬降解，可为MLL-R白血病的药物作用靶点提供新的依据。
附图说明
图1为长链非编码RNA LAMP5-AS1在MLL-R白血病表达及临床意义评估。(A)，qRT-PCR技术检测LAMP5-AS1在MLL-r白血病样品中特异高表达；(B)，利用最优的分界点处(0.001292)的区分LAMP5-AS1表达水平的高低。高表达的LAMP5-AS1具有较低的无白血病生存率。
图2为LAMP5-AS1调控MLL-R白血病的细胞学功能。(A)qRT-PCR技术检测LAMP5-AS1在THP1的敲低效果；(B)CCK-8技术检测敲低LAMP5-AS1的情况下，MLL-R白血病细胞系的增殖水平显著降低；(C)流式细胞术技术检测敲低LAMP5-AS1的情况下，MLL-R白血病细胞系的凋亡水平显著增强本图中均采用三次重复的平均值±标准差，星号表示通过t检验比较两组之间的差异具有统计学意义(**P<0.01；***P<0.001)。
图3为LAMP5-AS1调控MLL-R白血病的动物模型。(A)实体瘤模型显示，在接种敲低LAMP5-AS1细胞组的肿瘤大小明显小于接种NC细胞组；(B)实体瘤模型的肿瘤生长曲线。(C)实体瘤模型的肿瘤重量统计；(D)利用生存曲线统计接种敲低LAMP5-AS1的MV4-11后，小鼠的生存周期。本图中均采用三次重复的平均值±标准差，星号表示通过t检验比较两组之间的差异具有统计学意义(*，p<0.05,**,p<0.01；***,p<0.001)。
图4为LAMP5-AS1调控MLL蛋白及下游基因表达水平。(A)western blot检测融合蛋白MLL-AF9和MLL-AF4的水平在敲低LAMP5-AS1后，显著降低；(B)qRT-PCR检测表达，LAMP5-AS1不影响MLL融合基因的mRNA表达；(C)实体瘤样品利用western blot技术检测，显示MLL-AF9融合蛋白水平显著降低。本图中均采用三次重复的平均值±标准差，星号表示通过t检验比较两组之间的差异具有统计学意义。(N.S.,无显著差异)。
图5为LAMP5-AS1调控MLL-R白血病细胞自噬。(A)免疫荧光实验显示LC3聚点数目在LAMP5-AS1敲低的MLL-R白血病细胞系中明显增多。标尺为10um；(B)扫描电镜图显示自噬溶酶体(箭头指示)的数目在LAMP5-AS1敲低的MLL-R白血病细胞系中明显增多；(C)westernblot实验显示，LC3B-II的水平在LAMP5-AS1敲低的MLL-R白血病细胞系中明显增多。本图中均采用三次重复的平均值±标准差，星号表示通过t检验比较两组之间的差异具有统计学意义(***,p<0.001)。
图6为LAMP5-AS1调控MLL-R白血病细胞自噬聚集。在构建有mRFP-GFP-LC3的MV4-11(A)和Molm13细胞(B)中，敲低LAMP5-AS1后，动态监测细胞自噬情况。巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1)为自噬抑制剂。
图7为敲低LAMP5-AS1促进MLL-AF9的自噬降解。(A)在MLL-R白血病细胞系中分别加入氯喹(Chloroquine)，巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1)和雷帕霉素(Rapamyci你)后，MLL-AF9和MV4-11蛋白水平分别发生相应的变化。氯喹和巴佛洛霉素A1为自噬抑制剂，雷帕霉素为自噬促进剂。(B)自噬抑制剂巴佛洛霉素A1可以回复由于敲低LAMP5-AS1诱导的MLL融合蛋白自噬降解作用。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得，所用引物序列均由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。
实施例1 LAMP5-AS1表达分析及其临床价值评估
本发明发现一个在MLL-R白血病中特异性高表达，而在正常生理条件下及其他类型白血病低表达的lncRNA LAMP5-AS1。为了进一步确定LAMP5-AS1在MLL-R白血病中的表达特异性，我们重新从中山大学附属第一医院收集了一批病人骨髓样品进行检测分析，其中包括MLL野生型(MLL-wt)白血病样品163例，及53例MLL-R白血病样品。所有样品收集均受中山大学道德委会批准并获得病人知情同意。通过提取RNA并采用qRT-PCR技术对LAMP5-AS1进行特异性检测。其用到的qRT-PCR的引物序列如下：
正向引物序列：5’-CACTGAACGGATCTCAAACC-3’(SEQ ID NO：2)；
反向引物序列：5’-CCAAGGGACAGTGATGCTAC-3’(SEQ ID NO：3)。
实验发现，与MLL野生型白血病样品相比，LAMP5-AS1在MLL-R白血病中显著高表达(p<0.001)(图1A)。而且，我们还发现，正常样品具有更低的LAMP5-AS1表达水平，说明：LAMP5-AS1的表达水平与疾病的恶性程度可能存在联系。为了进一步评估LAMP5-AS1在MLL-R白血病中的临床意义，我们随后利用Log-rank(Mantel-Cox)Test生存曲线，在这216例样品中，检验LAMP5对于MLL-R白血病的预后指示作用。实验分析结果如图1B所示，LAMP5-AS1高表达具有更低的无白血病生存率。这些结果预示着，LAMP5-AS1具有潜在区分MLL-R白血病和MLL-wt白血病的能力，高表达的LAMP5-AS1是在白血病疾病中同样是一个危险因素，是治疗白血病的潜在靶标。
实施例2 LAMP5-AS1在MLL-R白血病中的功能鉴定
为了解决LAMP5-AS1参与MLL-R白血病调控的核心问题，本实施例拟进一步研究LAMP5-AS1对MLL-R白血病的功能。选取MLL-R白血病细胞系，THP1(MLL-AF9)和MV4-11(MLL-AF4)为研究对象。通过siRNA干扰技术,为LAMP5-AS1分别设计2条不同的siRNA序列。
siRNA-1的正向序列：5’-CUGACAAAGUGCCGUCCAA dTdT-3’(SEQ ID NO：4)；
siRNA-1的反向序列：5’-UUGGACGGCACUUUGUCAG TdTd-3’(SEQ ID NO： 5)；
siRNA-2的正向序列：5’-GAGGCAAGACGAAGAAAGU dTdT-3’(SEQ ID NO：6)；
siRNA-2的反向序列：5’-ACUUUCUUCGUCUUGCCUC TdTd-3’(SEQ ID NO：7)。
在上述两个MLL-R白血病细胞系中，分别敲除LAMP5-AS1，利用CCK-8实验检测细胞的增殖情况。实验结果如图2B所示，在敲低LAMP5-AS1的情况下，无论是THP1还是MV4-11，细胞增殖同样显著下降。这说明，LAMP5-AS1在维持MLL-R白血病的增殖也发挥着重要的功能。于此同时，同样通过siRNA干扰技术敲低LAMP5-AS1，利用流式细胞术检测细胞的凋亡情况。实验结果如图2C所示，在敲低LAMP5-AS1的情况下，无论是THP1还是MV4-11，早期凋亡和晚期凋亡率显著升高。进一步检测LAMP5-AS1对MLL-R白血病细胞分化的影响。因此，通过细胞增殖和凋亡实验，推测LAMP5对MLL-R白血病的发生发展具有潜在调控作用。接下来，进一步验证了在成体水平验证LAMP5-AS1对MLL-R白血病的调控作用。同样利用上述的siRNA序列，设计LAMP5-AS1的shRNA序列。
shRNA-1的正向序列：
5’-GATCCCTGACAAAGTGCCGTCCAATTCAAGAGATTGGACGGCACTTTGTCAGTTTTTG-3’(SEQID NO：8)；
shRNA-1的反向序列：
5’AATTCAAAAACTGACAAAGTGCCGTCCAATCTCTTGAATTGGACGGCACTTTGTCAGG-3’(SEQID NO：9)；
shRNA-2的正向序列：
5’-GATCCGAGGCAAGACGAAGAAAGTTTCAAGAGAACTTTCTTCGTCTTGCCACTTTTTG-3’(SEQID NO：10)；
shRNA-1的反向序列：
5’-AATTCAAAAAGAGGCAAGACGAAGAAAGTTCTCTTGAAACTTTCTTCGTCTTGCCTCG-3’(SEQID NO：11)。
利用System Biosciences公司表达载体pGreenPuroTM shRNA Cloning andExpression Vector慢病毒表达系统构建LAMP5-AS1的敲除的稳定表达株。通过嘌呤霉素筛选得到Molm13LAMP5-AS1敲除细胞株。随后，将验证有效的稳定Molm13LAMP5-AS1细胞株扩大培养，同样分别采用皮下注射接种到5周龄的NOD-SCID小鼠体内：分别30小鼠，共3组(sh-NC,sh-LAMP5-AS1-1,sh-LAMP5-AS1-2)，每组10只小鼠。经过一定的时间，利用游标卡尺及电子天平检测皮下成瘤的情况。如图3A所示，皮下接种有sh-LAMP5-1,sh-LAMP5-2Molm13的小鼠，肿瘤大小明显比对照组要小；而且，通过统计发现，肿瘤的生长情况均明显较对照组要慢(图3B)，肿瘤最终的重量也较轻(图3C)。这些结果说明，LAMP5-AS1同样具有促进MLL-R白血病的成瘤，并且影响这类白血病细胞的生长，预示着LAMP5-AS1可能作为治疗这类白血病潜在的靶标。随后，进一步利用尾静脉注射模型探索LAMP5-AS1对小鼠器官的浸润能力。Log-rank(Mantel-Cox)Test生存曲线分析发现，敲低LAMP5-AS1的小鼠组生存率高于对照组(图3D)。这说明特异性靶向高表达的LAMP5-AS1可能是潜在治疗MLL-R白血病的一个策略。
实施例3 LAMP5-AS1靶向MLL融合蛋白
无论从细胞水平还是体外小鼠实验，LAMP5-AS1均显著的影响MLL融合基因白血病细胞的功能。那么，该lncRNA是否能直接调控MLL融合蛋白的表达从而参与到该类疾病中的呢？为了研究这个问题，通过在THP1和MV4-11细胞中RNA干扰抑制LAMP5-AS1，检测了MLL融合蛋白的表达水平。通过实验结果发现，在MLL细胞系中敲低LAMP5-AS1，MLL-AF9和MLL-AF4的蛋白水平显著降低，但MLL融合蛋白的mRNA并没有显著效果(图4A和B)，提示LAMP5-AS1很可能是通过介导MLL融合蛋白的稳定性或者降解发挥作用。另一方面，在shRNA Molm13皮下接种的NOD-SCID小鼠肿瘤样品中，我们也发现敲低LAMP5-AS1，体内的MLL-AF9的蛋白水平显著降低(图4C)。
实施例4 LAMP5-AS1调控MLL融合蛋白自噬降解
接下来探讨LAMP5-AS1是否调控了MLL-R白血病细胞的自噬通路？首先我们通过siRNA干扰技术，在上述ML白血病细胞系THP1中，敲除LAMP5-AS1，利用免疫荧光技术及双光子共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscopy，LSCM)观察LC3b聚集变化。实验结果，敲除LAMP5-AS1的THP1,LC3点状聚集明显比对照组较多；包埋电镜切片，透射电镜(transmission electron microscopy，TEM)结果显示在敲低LAMP5-AS1和LAMP5的THP1细胞系中，自噬小泡明显积累更多(图A和B)。随后，敲低LAMP5-AS1，利用western blot技术检测LC3b(自噬发生的指示剂)二型的积累变化。如图5C所示，无论在THP1还是MV4-11细胞系中，LC3二型积累相比较于对照组明显增多。说明敲除LAMP5-AS1能够促使MLL融合基因细胞自噬增强。这个结果认为，在MLL融合基因细胞系中，LAMP5-AS1具有潜在抑制自噬的能力。
为了进一步检测LAMP5-AS1在MLL-R白血病细胞系中对自噬的动态调控过程，我们购买了mRFP-GFP-LC3串列的慢病毒。通过慢病毒感染技术筛选获得mRFP-GFP-LC3外源表达的稳定细胞株：MV4-11和Molm13。我们通过siRNA干扰技术敲低LAMP5-AS1利用LSCM检测mRFP-LC3B(红色)及mRFP-GFP-LC3(黄色)分布及积累情况。细胞中mRFP(红色)(GFP在自噬溶酶体中会被低PH淬灭)越多，表明自噬越强。然后，在自噬抑制剂(巴弗洛霉素，bafilomycin)处理的情况下，观测自噬积累情况。实验结果如图6所示，LAMP5-AS1，细胞中mRFP(红色)显著增多,当用巴弗洛霉素在MV4-11和Molm13细胞中，分别敲低处理时，自噬体与溶酶体融合受抑制，自噬体中mRFP-GFP-LC3(黄色)积累增多。这些结果说明在MLL-R白血病细胞系中，敲低LAMP5-AS1，细胞自噬会发生明显的变化，进一步阐明了LAMP5-AS1和LAMP5对自噬的抑制功能。
为了验证MLL融合基因被自噬降解，我们在自噬抑制剂巴弗洛霉素和奎宁，和自噬促进剂蕾帕霉素处理的THP1和MV4-11细胞中，检测融合基因的蛋白水平。我们发现，在自噬抑制剂巴弗洛霉素和奎宁处理下，MLL-AF9和MLL-AF4蛋白水平显著升高，而在蕾帕霉素处理下，融合基因蛋白水平则显著下降，暗示我们MLL融合基因是通过自噬通路降解(图7A)。此外，我们发现在敲低LAMP5-AS1的MLL-R白血病细胞系中，MLL-AF9蛋白水平显著下降，当在巴弗洛霉素的情况下，MLL-AF9的蛋白水平具有明显回升(图7B)。这些结果说明，在MLL-R白血病细胞系中，融合蛋白是通过LAMP5-AS1调控的自噬途径降解。
序列表
<110> 中山大学
<120> 长链非编码RNA LAMP5-AS1在MLL-R白血病中的应用
<141> 2020-05-26
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<400> 10
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<210> 11
<211> 58
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 11
aattcaaaaa gaggcaagac gaagaaagtt ctcttgaaac tttcttcgtc ttgcctcg 58
Claims (10)
1.SEQ ID NO:1所述的长链非编码RNA LAMP5-AS1作为诊断标记物在制备MLL-R白血病诊断产品中的应用。
2.一种MLL-R白血病诊断产品，其特征在于，包含检测长链非编码RNA LAMP5-AS1表达量的引物。
3.根据权利要求2所述的MLL-R白血病诊断产品，其特征在于，所述引物包含上游引物和下游引物，其序列依次如SEQ ID NO:2～3所示。
4.根据权利2或3所述的MLL-R白血病诊断产品，其特征在于，所述产品为试剂、芯片或试剂盒。
5.SEQ ID NO:1所述的长链非编码RNA LAMP5-AS1作为治疗靶点在筛选或制备用于治疗MLL-R白血病药物中的应用。
6.SEQ ID NO:1所述的长链非编码RNA LAMP5-AS1的抑制剂在制备用于治疗MLL-R白血病药物中的应用。
7.一种MLL-R白血病治疗药物，其特征在于，含有抑制长链非编码RNA LAMP5-AS1表达的抑制剂。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述抑制剂为抑制长链非编码RNA LAMP5-AS1表达的siRNA或shRNA。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述siRNA选自siRNA-1或siRNA-2中的一种或多种，siRNA-1序列如SEQ ID NO:4～5所示，siRNA-2序列如SEQ ID NO:6～7所示。
10.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述shRNA选自shRNA-1或shRNA-2中的一种或多种，shRNA-1序列如SEQ ID NO:8～9所示，shRNA-2序列如SEQ ID NO:10～11所示。
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