CN113151466A - 长链非编码RNA uc002ubt.1在ALL白血病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了长链非编码RNA uc002ubt.1在ALL白血病中的应用，具体的，通过对ALL白血病样品以及正常骨髓样品进行基因芯片测序，发现ALL白血病中长链非编码RNA uc002ubt.1显著高表达。高表达的uc002ubt.1与病人八年生存率呈显著负相关，而uc002ubt.1在B‑ALL和T‑ALL中的表达具有显著差异性，可用于B‑ALL和T‑ALL白血病分型的区分和鉴定，同时uc002ubt.1可作为诊断标记物和/或治疗靶点在制备ALL白血病诊断和分型产品发挥作用。

Description

长链非编码RNA uc002ubt.1在ALL白血病中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及长链非编码RNA uc002ubt.1在ALL白血病中的应用。

背景技术

急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)是儿童最常见的恶性肿瘤，同时也是导致儿童因癌症死亡的主要原因。急性淋巴细胞白血病(Acutelymphoblastic leukemia,ALL)是儿童最常见的恶性肿瘤，同时也是导致儿童因癌症死亡的主要原因。急性淋巴细胞白血病可以分为B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)和T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)。虽然近些年来，儿童治疗方案的不断优化和应用大大提高了患者的5年生存率，但是仍有15％的儿童因为肿瘤的复发或难治性导致其预后较差。因此，迫切需要寻找新的生物标志物，用于早期诊断和预后评估以及药物靶标，以提高儿童ALL的整体治疗效果。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是长度大于200个核苷酸的RNA分子，在肿瘤等多种疾病发生过程中发挥着重要的作用。许多研究表明，异常表达的lncRNA可以在转录水平、转录后水平以及翻译水平等各方面调节基因的表达，从而导致乳腺癌、肝癌、胰腺癌和结直肠癌等癌症的发生发展。据报道，在儿童白血病中，lnc-THADA-4,lnc-ACOT9-1和lnc-NRIR可能可以作为粒单细胞白血病的新的治疗靶标。有研究表明Lnc-CCDC26,lnc-DARS-AS1和lnc-SNHG14在儿童急性髓系白血病中发挥癌基因的作用。此外，有lncRNA基因表达谱研究表明，有些lncRNA与儿童ALL相关，并有望作为新的分子标志物。最近，部分lncRNA也被证明与儿童ALL的发病机制、预后以及治疗效果有关。然而儿童ALL的详细机制很大程度上都是未知的。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供长链非编码RNAuc002ubt.1作为诊断标记物在制备ALL白血病诊断产品中的应用。

本发明的另一目的在于提供长链非编码RNA uc002ubt.1作为治疗靶点在筛选或制备用于治疗儿童ALL白血病药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：本发明发现一个在ALL白血病中特异性高表达，而在正常生理条件下低表达的lncRNA，uc002ubt.1。uc002ubt.1的基因座位为人第2号染色体的正义DNA链上，其基因覆盖从162101250bp到162105241bp的范围，可以转录出长度为2013nt的lncRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明通过对ALL白血病样品以及正常骨髓样品进行基因芯片测序，发现一个在ALL白血病中特异性高表达的lncRNA,uc002ubt.1。进一步地，在B-ALL和T-ALL白血病和正常样品中进行qRT-PCR验证，结果发现uc002ubt.1在B-ALL和T-ALL中的表达具有显著差异性，说明uc002ubt.1可以用于B-ALL和T-ALL白血病分型的区分和鉴定。

进一步，利用ROC曲线分析证实，uc002ubt.1能够显著地区分B-ALL白血病和T-ALL白血病病人样品；生存曲线分析得出低表达的uc002ubt.1八年生存率显著升高，预示着uc002ubt.1具有作为ALL白血病的分类器及预后指示器的潜在临床作用。

为了研究uc002ubt.1在B-ALL和T-ALL中的重要性，针对uc002ubt.1设计了特异的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)，并在B-ALL细胞系和T-ALL细胞系中检测其敲低效率，结果发现在T-ALL细胞系中，敲低uc002ubt.1会抑制细胞的生长，促进细胞的凋亡。相反，在B-ALL细胞系中，敲低uc002ubt.1会促进细胞的生长，抑制细胞的凋亡。进一步，在T-ALL细胞系中发现敲低uc002ubt.1会上调其临近基因TANK的表达，说明了uc002ubt.1可能通过影响临近基因的变化在B-ALL和T-ALL中发挥不同的作用。

因此，本发明首先提供长链非编码RNA uc002ubt.1作为诊断标记物在制备ALL白血病诊断产品中的应用。以及检测长链非编码RNA uc002ubt.1表达量的试剂在制备备ALL白血病诊断产品中的应用。

本发明还提供一种ALL白血病诊断产品，包含检测长链非编码RNA uc002ubt.1表达量的引物。

优选地，所述引物包含上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:2所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO:3所示。

优选地，所述产品为试剂、芯片或试剂盒等。

本发明证实利用siRNA技术敲低uc002ubt.1，发现T-ALL白血病细胞系增殖减弱，凋亡增多。相反，在B-ALL白血病细胞系增殖增强，凋亡减少。表明抑制uc002ubt.1的表达可以抑制T-ALL白血病细胞肿瘤生长，促进B-ALL白血病细胞肿瘤生长。此外，通过ROC曲线分析证实，发现uc002ubt.1能够显著地区分B-ALL白血病和T-ALL白血病病人样品。

因此，本发明的另一目的是提供长链非编码RNA uc002ubt.1作为治疗靶点在筛选或制备用于治疗ALL白血病药物中的应用。

同时还提供所述的长链非编码RNA uc002ubt.1的抑制剂在制备用于治疗ALL白血病药物中的应用。

一种ALL白血病治疗药物，含有抑制长链非编码RNA uc002ubt.1表达的抑制剂。

优选地，还包含药学上可接受的载体。

优选地，所述抑制剂为抑制长链非编码RNA uc002ubt.1表达的siRNA。

优选地，所述siRNA的正向序列如SEQ ID NO:4所示；所述siRNA的反向序列如SEQID NO:5所示。

本发明的有益效果在于：本发明首次发现证实了一个lncRNA uc002ubt.1在ALL白血病中高表达，而且uc002ubt.1的表达在B-ALL和T-ALL中的表达具有显著的差异性，提示其可作为B-ALL和T-ALL分型的指标；uc002ubt.1的高表达与病人生存率呈显著负相关；细胞增殖和凋亡的结果表明敲低uc002ubt.1的表达可显著抑制T-ALL细胞的增殖和促进B-ALL细胞的增殖；表明uc002ubt.1可作为ALL诊断标记物和/或治疗靶点在ALL白血病的诊断和疾病分型中发挥作用，uc002ubt.1能够指示该病的诊断和预后。

附图说明

图1是本发明的LncRNA在11名儿童B-ALL和11名T-ALL患者及6例健康对照骨髓样品中的聚类分析；

图2是本发明的uc002ubt.1在B-ALL、T-ALL及健康对照骨髓样品中的qRT-PCR验证(A)；uc002ubt.1在B-ALL和T-ALL中的诊断价值(B)；uc002ubt.1在不同表达的白血病患者中的8年生存率(C)；

图3是本发明的敲低uc002ubt.1抑制Jurkat细胞的增殖(A)并促进Supb15细胞的增殖(B)；

图4是本发明的敲低uc002ubt.1促进Jurkat的细胞的凋亡(A)并抑制Supb15细胞的凋亡(B)；

图5是本发明的敲低uc002ubt.1会上调其临近基因TANK的表达。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得，所用引物序列均由Invitrogen公司合成。

实施例1

uc002ubt.1表达分析及其临床价值评估：

本发明发现一个在ALL白血病中特异性高表达，而在正常生理条件下低表达的lncRNA，uc002ubt.1，为了探讨lncRNA在B-ALL和T-ALL中的功能，发明人在中山大学附属第一医院中收集了11例T-ALL、11例B-ALL和6个正常对照骨髓样品进行lncRNA基因芯片测序。所有样品收集均受中山大学道德委会批准并获得病人知情同意。利用无监督的聚类分析，将差异表达的lncRNA用热图表示，并且将lncRNA按T-ALL、B-ALL和正常对照进行分类(如图1所示)。进一步发现了uc002ubt.1在ALL白血病中特异性高表达，且在B-ALL和T-ALL中的表达具有显著的差异性。因此发明人在中山大学附属第一医院中收集了64例B-ALL、43例T-ALL以及8例正常对照骨髓样品进行进一步验证。通过提取RNA并采用qRT-PCR技术对uc002ubt.1进行特异性检测。结果与基因芯片的数据一致，uc002ubt.1在T-ALL中的表达量显著高于在B-ALL中的表达量(如图2A所示)。说明uc002ubt.1可以用于B-ALL和T-ALL白血病分型的区分和鉴定。

通过提取RNA并采用qRT-PCR技术对uc002ubt.1进行特异性检测。结果如图2A所示，其用到的qRT-PCR的引物序列如下：

正向引物序列：5’-AGAGCTTCAGCATCCTCGTG-3’(SEQ ID NO：2)；

反向引物序列：5’-CTGCTGCGTGGAGGATACAA-3’(SEQ ID NO：3)。

为了进一步评估uc002ubt.1在ALL白血病中的意义，利用ROC曲线分析证实，uc002ubt.1能够显著地区分B-ALL白血病和T-ALL白血病病人样品(如图2B所示)；随后利用Log-rank(Mantel-Cox)Test生存曲线，检验uc002ubt.1对于ALL白血病的预后指示作用。实验结果如图2C所示，uc002ubt.1低表达具有更高的无白血病生存率，这些结果预示着，uc002ubt.1具有潜在区分B-ALL白血病和T-ALL白血病的能力，高表达的uc002ubt.1在白血病疾病中同样是一个危险因素，是治疗白血病的潜在靶标。

实施例2

uc002ubt.1在B-ALL和T-ALL白血病中的功能鉴定：

为了解决uc002ubt.1在B-ALL和T-ALL白血病调控中的核心问题，本实施例拟进一步研究uc002ubt.1对ALL白血病中的功能。选取B-ALL细胞系，SUP-B15和T-ALL细胞系，Jurkat为研究对象。通过siRNA干扰技术，为此针对uc002ubt.1设计了特异的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)。通过siRNA干扰技术，为uc002ubt.1设计1条siRNA序列。

siRNA的正向序列：5’-CCAGCAAGGUUUAUGGUUUTT-3’(SEQ ID NO：4)；

siRNA的反向序列：5’-AAACCAUAAACCUUGCUGGTT-3’(SEQ ID NO：5)。

在上述的两个细胞系中分别敲低uc002ubt.1，利用CCK-8实验检测细胞的增殖情况。结果如图3A和图3B所示，在敲低uc002ubt.1的情况下，T-ALL的细胞生长受到抑制，相反，促进了B-ALL细胞的生长。这说明，uc002ubt.1在B-ALL和T-ALL中发挥着不同的功能。在上述的两个细胞系中分别敲低uc002ubt.1，利用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。结果如图4所示，在敲低uc002ubt.1的情况下，T-ALL的细胞凋亡增多，相反，B-ALL细胞的凋亡减少。这也说明，uc002ubt.1在B-ALL和T-ALL中发挥着不同的功能。进一步在T-ALL细胞系中发现敲低uc002ubt.1会上调其临近基因TANK的表达，结果如图5所示，说明了uc002ubt.1可能通过影响临近基因的变化在B-ALL和T-ALL中发挥不同的作用(如图5所示)。

因此，本发明首先提供长链非编码RNA uc002ubt.1作为诊断标记物在制备ALL白血病诊断和分型产品中的应用。以及检测长链非编码RNA uc002ubt.1表达量的试剂在制备ALL白血病诊断产品中的应用。

上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

SEQ ID NO:1

<110> 广东医科大学

<120> 长链非编码RNA uc002ubt.1在ALL白血病中的应用

<160> 5

<210> 1

<211> 2013

<212> RNA

<213> 人（Human sapiens）

<400> 1

agagtgcccc ggcgtctttc tagcctccgc ctccaggcgg gtgaggaggt gacacctgag 60

aattcctccc tctcacccct gaccctgccg gaaagcgaaa ctgagatgcg ggcattgggc 120

cctgggaagc gtggggaagg ggaaaggaga aagccagaaa atggagaaat taagtccttt 180

ccatggatca ttccttctgt aaacagagat cacaaagcaa gagcttcagc atcctcgtga 240

aaaagacatt ttgttctggg tgtcatcatc tccttccact acagcttgca attggaacaa 300

gcttcacatc ctgggggtgc tgcctatctc tgtcttgatt tctgtctgtc tattcctccc 360

attgacagga atgtcgtttg tatcctccac gcagcagttt gcagaaatcc agcaaggttt 420

atggtttatg ttgcccagca tgtataaaca caacgctctc aaatgctttt taaaaatcta 480

tgaatttgtt agatgtcttc acatcctggt cctcctaccc caattctcaa acacaaagta 540

ctctgttgcc ctattatagt cctgcgatag ttctggctag gattaggttg acggtctaag 600

ccccaagaaa ggcctggcat tttcatagca ggctttcccc agtgctttga gtcttcctct 660

ctcactccct ttttcttttt ccctcggagg agggggtgtt gggggtggga ggtgattagt 720

aaatgtttca ggtaatctgt gaattcttaa tagtcatatt tccgtggtgg aagatctccc 780

tatttctctg atgtgacagg ttacagaaac cttggtgttg ggggttttac agatatttac 840

aagttctagg agtttgaact ttgggtcaag atgttgattc cttttaatgt gcgagggtga 900

aggaggtttt attttgcttt attcttttgg atattatgag atgagattgt atccagtctt 960

ggctgtaacc tataccataa atgcagagct gcaaccatta tttctgtctc tttctccttt 1020

tatcacctac acttctagag atattacttt cagttttatt gcaaatcatc tgtgtcttta 1080

gtttaaacca ttatttttca tataccccag gcacatttcc cttataatga gacaaatttt 1140

agattattaa tgttccacct aaaaggatac tgtacacttt tcattgccaa tatgggcttt 1200

gaagcttaaa tatcaacatt tttataggaa atttacccat gtcaaattta aatatatttg 1260

cttatatttc ttggaaaaaa gattttggat aactatcaat taagcagcca attccatttg 1320

gggtgcagaa aattttgagc cccttgataa gaaggaacaa aatttttcct ctaaataacc 1380

aactctggat cagaaaaact gaacttttct aaatatttat tattaacaaa actttttttt 1440

gtctgattcc actagaagca ttctatgttg tgaacactat aaagttatcc tatgttgtga 1500

acaccataaa gttatgaggg aaaaaatgtc aaatctaaat tttatttaga agtaacatat 1560

tgtttttctg gacttgcaat ccaattcgaa tgcatcgtta gacttttctg ttttcttatg 1620

attaaacaac aatggcttaa aatgatagca agtcaactga aaagttgctt tggaataaaa 1680

caaaagtggg aatgccaact ttcttttctt ctctataact tcattaacat ggttgtatag 1740

acatttgcat gtaaaatgta gctaacaaaa attacacaga agtaaattta gtcctctagt 1800

gcctacctct atggtgaaat cagaccattt ggcatagttt gaagtcttcc aagaagcctg 1860

gtttccacct ggaaaataaa ttactaaatt tgaatgtgtt acttatacta tggtgagttg 1920

tctatctgtt acattttatt ttagtgcata tactagaaat tgtatttagg gtgttctaaa 1980

attgtcatct gtcaaggtag agaattataa taa 2013

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人（Human sapiens）

<400> 2

agagcttcagcatcctcgtg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人（Human sapiens）

<400> 3

ctgctgcgtggaggatacaa 20

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人（Human sapiens）

<400> 4

ccagcaagguuuaugguuutt 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人（Human sapiens）

<400> 5

aaaccauaaaccuugcuggtt 21

Claims (9)

1.SEQ ID NO:1所述的长链非编码RNA uc002ubt.1作为诊断标记物在制备ALL白血病诊断产品中的应用。

2.一种ALL白血病诊断产品，其特征在于：包含检测长链非编码RNA uc002ubt.1表达量的引物。

3.根据权利要求2所述的一种ALL白血病诊断产品，其特征在于：所述引物包含上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:2所示，所述下游引物的序列如SEQ IDNO:3所示。

4.根据权利要求2或3所述的一种ALL白血病诊断产品，其特征在于：所述产品为试剂、芯片或试剂盒。

5.SEQ ID NO:1所述的长链非编码RNA uc002ubt.1作为治疗靶点在筛选或制备用于治疗ALL白血病药物中的应用。

6.SEQ ID NO:1所述的长链非编码RNA uc002ubt.1的抑制剂在制备用于治疗ALL白血病药物中的应用。

7.一种ALL白血病治疗药物，其特征在于：含有抑制长链非编码RNA uc002ubt.1表达的抑制剂。

8.根据权利要求7所述的一种ALL白血病治疗药物，其特征在于：所述抑制剂为抑制长链非编码RNA uc002ubt.1表达的siRNA。

9.根据权利要求8所述的一种ALL白血病治疗药物，其特征在于：所述siRNA的正向序列如SEQ ID NO:4所示；所述siRNA的反向序列如SEQ ID NO:5所示。

Images