CN111714506A - 二硫酸鼠李五糖及衍生物在抗骨质疏松中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例提供二硫酸鼠李五糖及衍生物在抗骨质疏松中的应用，将所述二硫酸鼠李五糖或者所述二硫酸鼠李五糖衍生物应用于抗骨质疏松的药物，或者将所述二硫酸鼠李五糖或者所述二硫酸鼠李五糖衍生物应用于抗骨质疏松的功能食品。所述二硫酸鼠李五糖能用以抑制破骨细胞的生长；也能用以抑制RANKL诱导的MMP‑9以及CTSK的产生。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种二硫酸鼠李五糖及衍生物在抗骨质疏松中的应用。
背景技术
骨质疏松症是骨强度下降导致骨折危险性升高的一种骨骼疾病。破骨细胞是人体唯一的骨吸收细胞，与骨质疏松症的发生密切相关，近年来对于破骨细胞与骨吸收有了较深入的研究，并研发了多种抗骨吸收的靶向药物。骨吸收抑制剂又称为抗骨吸收剂，通过降低骨吸收治疗骨质疏松症。此类药物治疗可以使骨量升高1.2％～8.0％，却使新发骨折危险性降低 30％～61％，可能是因为骨吸收抑制剂可以维持骨小梁的完整性，或通过增加皮质骨的厚度来发挥作用。目前已发现的骨吸收抑制剂有RANKL的单克隆抗体Denosumab、Wnt信号传导拮抗剂Romosozumab、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)拮抗剂、白细胞介素 -6(interleukin-6，IL-6)受体拮抗剂Tocilizumab、组织蛋白酶K抑制剂Odanacatib、Src激酶抑制剂Saracatinib等，为骨质疏松的防治开辟了新的途径。但是并未见任何从海洋天然糖类化合物中发现的防治骨质疏松的天然产物的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供二硫酸鼠李五糖及衍生物在抗骨质疏松中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的一方面提供二硫酸鼠李五糖在抗骨质疏松中的应用。
本发明的另一方面提供二硫酸鼠李五糖衍生物在抗骨质疏松中的应用。
可选的，将所述二硫酸鼠李五糖或者所述二硫酸鼠李五糖衍生物应用于抗骨质疏松的药物，或者将所述二硫酸鼠李五糖或者所述二硫酸鼠李五糖衍生物应用于抗骨质疏松的功能食品。
可选的，所述二硫酸鼠李五糖用以抑制破骨细胞的生长。
可选的，所述抑制二硫酸鼠李五糖用以抑制RANKL诱导的MMP-9以及 CTSK的产生。
可选的，所述二硫酸鼠李三糖是以礁膜或者浒苔为原料，经化学降解和超滤以及凝胶柱分离方法制备而得；其分子结构为α -L-Rhap-(2SO4)-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap--(1→3)-α -L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap(2SO4)，是通过1,3糖苷键与鼠李糖(Rha)键连接形成，分子量为908.84Da。
可选的，其特征在于，所述二硫酸鼠李五糖分子结构式如下：
可选的，所述二硫酸鼠李五糖衍生物包括：以包含二硫酸鼠李五糖为母核的硫酸化衍生物、以包含二硫酸鼠李五糖为母核的磷酸化衍生物，以及以包含二硫酸鼠李五糖为母核的乙酰化衍生物。
可选的，所述二硫酸鼠李五糖的用量为50-300mg/kg。
可选的，所述二硫酸鼠李五糖的制备方法，包括如下步骤：
1)、将绿藻礁膜或者浒苔配成水溶液；
2)、采用稀盐酸加入到步骤1)中水溶液中，加热，并搅拌、降解，采用NaOH调节PH值为中性；
3)、将步骤2)得到的溶液进行浓缩、醇沉，上清液经超滤膜截留，截留部分经旋转仪浓缩后，再通过凝胶色谱柱进行脱盐处理；
5)、然后采用Bio-Gel P6色谱柱分离纯化，洗脱液以硫酸苯酚法检测其糖含量，并绘制洗脱曲线；
6)、收集峰尖部分，冻干即得二硫酸鼠李五糖。
本发明的有益效果在于：
1、本发明提供二硫酸鼠李五糖及衍生物在抗骨质疏松中的应用。
2、本发明的发明人在前期大量筛选的基础之上，发现特定结构的天然二硫酸鼠李糖对成骨细胞没有任何毒副作用的前提下，可显著的抑制破骨细胞的增殖，并下调破骨细胞特异性基因的表达。这表明天然寡糖类化合物二硫酸鼠李糖具有潜在的抗骨质疏松的作用。
3、本发明实施例中，二硫酸鼠李五糖能显著抑制破骨细胞的生长和功能，有效抑制RANKL诱导的MMP-9以及CTSK的产生，且同时对成骨细胞没有任何毒副作用。RANKL诱导破骨细胞分化可以上调破骨细胞标记基因，如基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinase，MMP-9)、CTSK、抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acidphosphatase,TRAc P) 等，这些标记基因在破骨细胞的形成和功能的活化中扮演着重要的角色。
4、本发明实施例属于海洋药物领域，具体涉及一种二硫酸鼠李糖在制备抗骨质疏松药物中的应用。二硫酸鼠李糖是以绿藻礁膜或者浒苔为原料，经化学降解和超滤以及凝胶柱分离方法制备而得；其分子结构为α -L-Rhap-(2SO4)-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap--(1→3)-α -L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap(2SO4)。本发明实施例产品来源于海藻多糖，具有资源丰富、易于产业化，安全有效等诸多优点，在抗骨质疏松方面具有广阔的开发应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例中二硫酸鼠李五糖的二级质谱图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明的一实施例提供二硫酸鼠李五糖在抗骨质疏松中的应用。
具体的，将所述二硫酸鼠李五糖应用于抗骨质疏松的药物或者功能食品。
具体应用方式为：将二硫酸鼠李五糖直接作为药物或者功能食品进行食用。
具体的用法用量为：每天1-3次，以二硫酸鼠李五糖的用量计，每次 20-750mg。所述二硫酸鼠李五糖的用量为50-300mg/kg。
本发明的另一实施例提供二硫酸鼠李五糖衍生物在抗骨质疏松中的应用。
具体的，将所述二硫酸鼠李五糖衍生物应用于抗骨质疏松的药物或者功能食品。
具体应用方式为：将二硫酸鼠李五糖衍生物直接作为药物或者功能食品进行食用。
具体的用法用量为：每天1-3次，以二硫酸鼠李五糖的用量计，每次 20-750mg。所述二硫酸鼠李五糖的用量为50-300mg/kg。
本发明实施例中，所述二硫酸鼠李五糖能显著抑制破骨细胞的生长和功能，有效抑制RANKL诱导的MMP-9以及CTSK的产生，且同时对成骨细胞没有任何毒副作用。RANKL诱导破骨细胞分化可以上调破骨细胞标记基因，如基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinase，MMP-9)、CTSK、抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acidphosphatase,TRAc P) 等，这些标记基因在破骨细胞的形成和功能的活化中扮演着重要的角色。
本发明实施例中，所述二硫酸鼠李五糖衍生物包括：以包含二硫酸鼠李五糖为母核的硫酸化衍生物、以包含二硫酸鼠李五糖为母核的磷酸化衍生物，以及以包含二硫酸鼠李五糖为母核的乙酰化衍生物。
本发明的还一实施例提供二硫酸鼠李糖五糖的制备方法
所述二硫酸鼠李糖五糖是以绿藻礁膜或者浒苔为原料，经化学降解和超滤以及凝胶柱分离方法制备而得；其分子结构为α-L-Rhap-(2SO4)-(1 →3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap--(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α -L-Rhap(2SO4)，是通过1,3糖苷键与鼠李糖(Rha)键连接形成，分子量为908.84 Da。
二硫酸鼠李糖五糖的制备方法，具体包括如下步骤：
1)、将绿藻礁膜或者浒苔配成1-10wt％水溶液；
2)、采用0.2-1.0wt％稀盐酸加入到步骤1)中水溶液中，加热到 60-80℃，并搅拌、降解4-6小时，采用NaOH调节PH值为中性；
3)、将步骤2)得到的溶液进行浓缩、醇沉，上清液经500Da超滤膜截留，截留部分经旋转仪浓缩后，再通过凝胶色谱柱Sephadex G10进行脱盐处理；
5)、然后采用Bio-Gel P6色谱柱分离纯化，洗脱液以硫酸苯酚法检测其糖含量，并绘制洗脱曲线；
6)、收集峰尖部分，冻干即得二硫酸鼠李五糖。
以下为具体实施例。
实施例1
将绿藻浒苔藻粉配成1-10wt％水溶液，采用0.5wt％稀盐酸加热到 70℃后搅拌降解5小时，然后用0.1M的NaOH中和为PH7.0，浓缩醇沉，上清液经500Da超滤膜截留，截留部分经旋转仪浓缩后，再通过凝胶色谱柱Sephadex G10进行脱盐处理，然后采用Bio-Gel P6分离纯化，洗脱液以硫酸苯酚法检测其糖含量，并绘制洗脱曲线，收集峰尖部分，冻干即得二硫酸鼠李糖五糖。
所制得的二硫酸鼠李五糖结构式如下：
取寡糖样品(二硫酸鼠李五糖)加入0.05M的NaBH4于冰箱4℃中反应过夜，以1：1乙酸水调PH为7.0。采用AG50W-X8对反应后的寡糖样品进行蒸馏水洗脱，然后浓缩冻干。在质谱分析过程中，以氮气为吹干气体和喷雾气体，流速为250L/h，以乙腈：水＝1:1(V/V)为流动相进行质朴分析。在二级质谱中，需要锥孔电压80eV，氩气作为碰撞气体，流速为15L/h。同时，保持碰撞能量保持在20-50eV交换时，得到最佳序列信息。离子源和溶剂挥发峰温度分别为80℃和150℃。
二硫酸鼠李糖五糖的二级质谱如图1所示。在其钠离子加合物的分子离子峰m/z929的CID-ES-MS/MS中，其线性连接方式可以通过来自糖环之间糖苷键断裂的碎片离子(m/z 225)，(m/z 243)，(m/z 371)， (m/z 389)，(m/z 517)，(m/z 535)，(m/z 663)和(m/z681)来确定。同时也存在环内断裂产生的碎片离子(m/z 285)，(m/z 315)，(m/z 431)， (m/z 461)，(m/z 577)，(m/z 607)，(m/z 723，-SO3Na)，(m/z 825) 和(m/z 855)，其中(m/z723)碎片离子是在失去一分子SO3Na的基础上产生的。根据二硫酸鼠李糖二级质谱序列分析方法，推出结构为：α -L-Rhap-(2SO4)-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap--(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap(2SO4)。
实验测试1：二硫酸鼠李糖五糖对成骨细胞的影响
采用实施例1所制备的二硫酸鼠李糖五糖进行测试。具体步骤为：
(1)细胞培养：hFOB 1.19成骨细胞，采用D-MEM/F-12培养基 (GIBCO,货号12400024，添加L-glutamine 150mg/L,NaHCO3 1.5g/L)，
(2)将细胞接种于完全培养液中(含有100U/mL青霉素、100U/mL 链霉素和10％FBS)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)将每孔6000个细胞种植于96孔板中，放入恒温细胞培养箱孵育24h后，加入不同浓度的二硫酸鼠李糖五糖，于恒温细胞培养箱继续孵育72h。结束后每孔加入20μl(5mg/ml)MTT溶液，培养箱继续二硫酸鼠李糖五糖孵育4h。结束后，除去液体，每孔加入150μlDMSO溶液,混匀放入37℃培养箱20孵育20min。最后，酶标仪A540nm处测量吸光值。每次三个平行，实验重复三次。
实验结果如表1所示，在50-800μmol/L浓度时对成骨细胞的生长没有任何影响。
表1二硫酸鼠李糖五糖对hFOB 1.19成骨细胞的影响
| 组别(μmol/L) | 细胞存活比率 |
| 对照组 | 1.00±0.02 |
| 50 | 1.12±0.01* |
| 100 | 1.08±0.03* |
| 200 | 1.06±0.02 |
| 400 | 1.01±0.01 |
| 800 | 1.00±0.01 |
| 1000 | 0.99±0.02 |
注：n＝9,x±SD，与模型组相比，*P<0.05,***P<0.001
实验测试2：二硫酸鼠李糖五糖对破骨细胞的影响
(1)细胞培养：将C2C12细胞接种于DMEM完全培养液中(含有 100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(2)将每孔8000个细胞种植于96孔板中，放入恒温细胞培养箱孵育12h，然后加入不同浓度二硫酸鼠李五糖的放入恒温细胞培养箱继续孵育24h。孵育结束后更换培养基，每孔加入RANKL 50ng/ml,隔天换液，培养箱继续孵育96小时后，提取RNA，进行CTSK和MMP-9的mRNA荧光定量RT-PCR分析。实验重复三次。
组织蛋白酶K(Cathepsin K，CTSK)是一种半胱氨酸蛋白酶，由破骨细胞分泌，对骨吸收过程中的基质胶原的降解至关重要。研究表明，CTSK 启动子仅对破骨细胞有活性。MMP-9(基质金属蛋白酶-9)作为破骨细胞分化成熟的标志,在破骨分化中起着重要作用。
本研究中RANKL处理可显著增加CTSK和MMP-9的表达，而药物处理可以有效抑制RANKL对破骨细胞的诱导分化作用，明显抑制破骨细胞对骨的损伤。
二硫酸鼠李糖五糖对破骨细胞功能相关基因表达的影响，参见表2 所示，这些结果进一步有力的证明了二硫酸鼠李糖对破骨细胞的有效抑制作用。二硫酸鼠李糖五糖可有效抑制CTSK和MMP-9的转录表达。
表2二硫酸鼠李糖五糖对破骨细胞功能相关基因表达的影响
| 组别(μmol/L) | CTSK mRNA | MMP-9mRNA |
| 对照组 | 1.00±0.03 | 1.00±0.01 |
| 模型组 | 2.42±0.05# | 1.95±0.02# |
| 50 | 1.81±0.02* | 1.51±0.01* |
| 100 | 1.52±0.01* | 1.32±0.02* |
| 200 | 1.27±0.02 | 1.18±0.03* |
| 400 | 1.07±0.01* | 0.99±0.01* |
需要说明的是，在整个申请文件中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的试试方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.二硫酸鼠李五糖在抗骨质疏松中的应用。
2.二硫酸鼠李五糖衍生物在抗骨质疏松中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，将所述二硫酸鼠李五糖或者所述二硫酸鼠李五糖衍生物应用于抗骨质疏松的药物，或者将所述二硫酸鼠李五糖或者所述二硫酸鼠李五糖衍生物应用于抗骨质疏松的功能食品。
4.根据权利要求1-3任意所述的应用，其特征在于，所述二硫酸鼠李五糖用以抑制破骨细胞的生长。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抑制二硫酸鼠李五糖用以抑制RANKL诱导的MMP-9以及CTSK的产生。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述二硫酸鼠李三糖是以礁膜或者浒苔为原料，经化学降解和超滤以及凝胶柱分离方法制备而得；其分子结构为α-L-Rhap-(2S04)-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap--(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap(2S04)，是通过1，3糖苷键与鼠李糖(Rha)键连接形成，分子量为908.84Da。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述二硫酸鼠李五糖分子结构式如下：
8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述二硫酸鼠李五糖衍生物包括：以包含二硫酸鼠李五糖为母核的硫酸化衍生物、以包含二硫酸鼠李五糖为母核的磷酸化衍生物，以及以包含二硫酸鼠李五糖为母核的乙酰化衍生物。
9.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述二硫酸鼠李五糖的用量为50-300mg/kg。
10.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述二硫酸鼠李五糖的制备方法包括如下步骤：
1)、将绿藻礁膜或者浒苔配成水溶液；
2)、采用稀盐酸加入到步骤1)中水溶液中，加热，并搅拌、降解，采用NaOH调节PH值为中性；
3)、将步骤2)得到的溶液进行浓缩、醇沉，上清液经超滤膜截留，截留部分经旋转仪浓缩后，再通过凝胶色谱柱进行脱盐处理；
5)、然后采用Bio-Gel P6色谱柱分离纯化，洗脱液以硫酸苯酚法检测其糖含量，并绘制洗脱曲线；
6)、收集峰尖部分，冻干即得二硫酸鼠李五糖。
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-
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