CN111693623A - 一种高效液相法测定米力农中基因毒性杂质的方法 - Google Patents

一种高效液相法测定米力农中基因毒性杂质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效液相法测定米力农中基因毒性杂质的方法，属于分析化学技术领域。本发明的方法以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱温为28～32℃；以磷酸氢二钾溶液‑乙腈为流动相，流速为0.95～1.05mL/min，pH7.4～7.6，其中磷酸氢二钾溶液与乙腈体积比为81∶19～79∶21；紫外检测器的检测波长为210nm，在上述条件下检测米力农生产和贮存过程中可能会产生的基因毒性杂质4‑甲基吡啶氮氧化物和1，6‑二氢‑2‑甲基‑6‑氧代‑[3，4′‑双吡啶‑(1′‑N‑氧化物)]‑5‑甲腈。经过系统的方法学验证，本发明的方法可作为检测米力农药品中以上杂质含量是否合格的有效方法。

Description

一种高效液相法测定米力农中基因毒性杂质的方法
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，更具体地说，涉及一种高效液相法测定米力农中基因毒性杂质的方法。
背景技术
米力农化学名称为：2-甲基-6-氧-1，6-二氢-3，4’双吡啶-5甲腈，分子式：C12H9N3O，分子量：211.22，类白色或微黄色结晶性粉末；无臭。在水或乙醇中几乎不溶，在稀盐酸中略溶。临床上用于慢性充血性心力衰竭，顽固性心力衰竭。
目前米力农中已知两种遗传毒性杂质。根据米力农工艺路线，起始物料4-甲基吡啶在生产和贮存过程中可能会产生遗传毒性杂质4-甲基吡啶氮氧化物(命名为：杂质III)；终产品米力农在生产和贮存过程中可能会产生遗传毒性杂质米力农氮氧化物(命名为：杂质IV)。米力农及其基因毒性杂质III、IV的结构式如下：
Figure BDA0002542336700000011
遗传毒性(Genotoxcity)是指遗传物质中任何有害变化引起的毒性，而不考虑诱发该变化的机制，又称为基因毒性。遗传毒性杂质(Genotoxic Impurities，GTIs)是指能引起遗传毒性的杂质，包括致突变性杂质和其它类型的无致突变性杂质。其主要来源于原料药的生产过程，如起始原料、反应物、催化剂、试剂、溶剂、中间体、副产物、降解产物等。致突变性杂质(Mutagenic Impurities)指在较低水平时也有可能直接引起DNA损伤，导致DNA突变，从而可能引发癌症的遗传毒性杂质。本发明建立一种能够有效、简便、快捷检测米力农原料药中基因毒性杂质的方法，制定了控制策略，保证广大患者的用药安全性。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效液相法测定米力农中基因毒性杂质的方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种高效液相法测定米力农中基因毒性杂质的方法，采用高效液相法对米力农中的基因毒性杂质的含量进行检测，所述的基因毒性杂质为杂质III和杂质IV，所述的米力农、杂质III和杂质IV的化学结构式如下：
Figure BDA0002542336700000021
进一步地，所述的方法包括如下步骤：
(1)用流动相配置米力农、杂质III、杂质IV各自的梯度浓度溶液，用流动相配置待测样品溶液；
(2)设置高效液相检测条件；
(3)进行高效液相检测，记录色谱图，制作标曲，计算待测样品中杂质III、杂质IV各自的含量。
进一步地，所述高效液相法中液相色谱仪的检测波长为210nm。
进一步地，采用以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱温为28～32℃；以磷酸氢二钾溶液-乙腈为流动相，所述的流动相流速为0.95～1.05mL/min，pH7.4～7.6，其中磷酸氢二钾溶液与乙腈体积比为81∶19～79∶21。
进一步地，所述磷酸氢二钾溶液与乙腈体积比为80∶20。
进一步地，所述的流动相的pH值为7.5，流速为1.0mL/min。
进一步地，所述的色谱柱长250mm，内径4.6mm，填料粒径5μm。
进一步地，所述的色谱柱型号为E16100612或E16100615。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明的方法以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱温为28～32℃；以磷酸氢二钾溶液-乙腈为流动相，流速为0.95～1.05mL/min，pH7.4～7.6，其中磷酸氢二钾溶液与乙腈体积比为81∶19～79∶21；紫外检测器的检测波长为210nm，在上述条件下检测米力农生产和贮存过程中可能会产生的基因毒性杂质4-甲基吡啶氮氧化物(杂质III)和1，6-二氢-2-甲基-6-氧代-[3，4′-双吡啶-(1′-N-氧化物)]-5-甲腈(杂质IV)。系统的方法学验证结果显示，本发明的方法检测上述杂质的灵敏度极好，稳定性强，可作为检测米力农药品中杂质III和IV含量是否符合药典规定的有效方法。
附图说明
图1为系统适用性试验图谱图；
图2为米力农-酸破坏图谱图；
图3为米力农-碱破坏图谱图；
图4为米力农-光破坏图谱图；
图5为米力农-热解破坏图谱图；
图6为米力农-氧化破坏图谱图；
图7为米力农杂质III标准曲线图
图8为米力农杂质IV标准曲线图；
图9为米力农标准曲线图；
图10为米力农-对照品溶液稳定性0H试验结果图谱图；
图11为米力农-对照品溶液稳定性8H试验结果图谱图；
图12为米力农-耐用性-原条件试验结果图谱图；
图13为米力农-耐用性-不同比例(81∶19)试验结果图谱图；
图14为米力农-耐用性-不同比例(79∶81)试验结果图谱图；
图15为米力农-耐用性-不同流速(0.95mL/min)试验结果图谱图；
图16为米力农-耐用性-不同流速(1.05mL/min)试验结果图谱图；
图17为米力农-耐用性-不同温度(28℃)试验结果图谱图；
图18为米力农-耐用性-不同温度(32℃)试验结果图谱图；
图19为米力农-耐用性-不同pH(7.4)试验结果图谱图；
图20为米力农-耐用性-不同pH(7.6)试验结果图谱图；
图21为米力农-耐用性-不同柱子(E16100615)试验结果图谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1：建立高效液相法测定米力农中基因毒性杂质的方法
仪器及检测波长：液相色谱仪，紫外检测器检测波长210nm：
色谱柱：用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂(长250mm，内径4.6mm，填料粒径5μm)；
流动相：磷酸氢二钾溶液(取磷酸氢二钾2.7g，加水800mL溶解后，加三乙胺2.4mL，用磷酸调节pH值至7.5)-乙腈(80∶20)；
流速：1.0mL/min；
柱温及进样量：柱温30℃，进样量20μL；
系统适用性试验：
取米力农与米力农杂质III、IV对照品适量，用流动相溶解并稀释制成每1mL中含米力农20μg、米力农杂质III3μg、米力农杂质IV3μg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液。
取米力农、杂质III、杂质IV对照品适量，用流动相配制米力农浓度为200μg/mL和杂质III、杂质IV浓度均为30μg/mL各单一贮备液；分别吸取贮备液适量，配制成米力农浓度为20μg/mL和杂质III、杂质IV浓度均为3μg/mL各单一定位溶液；
取样品，用流动相溶解并制成每1mL中约含2mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取此溶液1mL，置10mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
具体试验操作：
分别取各单一定位溶液、系统适用性溶液和对照溶液各20μL注入高效液相色谱仪，检测波长为210nm，记录色谱图，进行检测，考察各成分的出峰时间及分离情况。
遗传毒性杂质的限度制定：
根据米力农注射液用法用量，成人的总剂量不应超过1.13mg/kg/天，按成人正产体重70公斤计，最大日剂量应不超过79.1mg。
米力农为正性肌力药，直接作用于心脏，属短期用药，如长期用药可致死。2个潜在基因毒性杂质：米力农杂质III、杂质IV，按照ICH指导原则中短期用药的最严格的限度标准TTC(10μg/day)，计算限度：
Figure BDA0002542336700000041
Figure BDA0002542336700000051
因此从药品安全性考虑，我们将杂质III和杂质IV的限度分别初步拟定为0.012％。
实施例2：高效液相法测定米力农中基因毒性杂质的方法的验证
本实施例中对实施例1建立的高效液相法测定米力农中基因毒性杂质的方法进行系统的方法学验证，包括系统适用性、破坏性试验、标准曲线及线性范围试验、定量限和检测限试验、进样精密度、对照品溶液稳定性、供试品溶液稳定性、重复性、准确度试验(加样回收率)、中间精密度、耐用性试验等验证试验，具体如下：
(1)系统适用性
取米力农(以下简称本品)、杂质III、杂质IV对照品适量，用流动相配制米力农浓度为200μg/mL和杂质III、杂质IV浓度均为30μg/mL各单一贮备液；分别吸取贮备液适量，配制成米力农浓度为20μg/mL和杂质III、杂质IV浓度均为3μg/mL各单一定位溶液；再分别吸取贮备液适量，配制成米力农为20μg/mL和杂质III、杂质IV均为3μg/mL混合溶液，作为系统适用性溶液；分别取各单一定位溶液和系统适用性溶液各20μL注入高效液相色谱仪，检测波长为210nm，记录色谱图，进行检测，考察各成分的出峰时间及分离情况。结果见下表1，图谱见图1，结果表明：在210nm检测波长下，杂质III、杂质IV、米力农之间的分离度均大于1.5，符合验证要求。
表1杂质定位及分离度
Figure BDA0002542336700000052
(2)破坏性试验
1)供试品溶液制备
破坏前溶液：称取米力农原料约20mg，置10mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为破坏前溶液。
酸破坏溶液：称取米力农原料约20mg，置10mL量瓶中，加1mol/L盐酸溶液1mL，放置4小时，加1mol/L氢氧化钠溶液1mL中和，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为酸破坏溶液。
碱破坏溶液：称取米力农原料约20mg，置10mL量瓶中，加1mol/L氢氧化钠溶液1mL，放置4小时，加1mol/L盐酸溶液1
高温破坏溶液：称取米力农原料约20mg，置10mL量瓶中，加少量流mL中和，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为碱破坏溶液。动相溶解，在100℃水浴中放置4小时，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为高温破坏溶液。
光照破坏溶液：称取米力农原料约20mg，置10mL量瓶中，加少量流动相溶解，在紫外灯下照射8小时，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为光照破坏溶液。
氧化破坏溶液：称取米力农原料约20mg，置10mL量瓶中，加少量流动相溶解，加3％双氧水1mL，放置2小时，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为氧化破坏溶液。
2)测定
分别取上述供试品溶液20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，用归一化法计算各杂质峰的量，同时检查各对应空白溶液。结果见下表2，图谱见图2～图6。
表2米力农破坏性试验杂质谱分析
Figure BDA0002542336700000061
Figure BDA0002542336700000071
注：杂质1～杂质12均为未知杂质，其编号按照破坏性试验产生的杂质出峰时间先后。
3)主峰纯度检测
对各种破坏条件下的供试品溶液，采用二极管阵列测定，进行了峰纯度研究，结果如表3所示，显示符合要求。
表3米力农峰纯度结果
试验条件 破坏前 酸破坏 碱破坏 光照破坏 加热破坏 氧化破坏
纯度因子 987 984 984 987 988 988
4)物料平衡考察
物料平衡考察结果如表4所示，表明：通过样品物料平衡数据分析，本品主峰破坏减少量与其归一化含量下降基本一致，各相同浓度的样品经不同条件破坏后检出的总峰面积基本相似，说明本色谱条件能将降解杂质均有效地检出。
表4物料平衡考察结果
Figure BDA0002542336700000072
Figure BDA0002542336700000081
5)破坏性试验结果说明
(A)在各破坏条件产生的降解产物与主峰能完全分离，从保留时间看，降解物也不干扰已知杂质的测定。
(B)降解试验：本品经过光照、酸碱及高温破坏，各杂质均基本无变化，氧化破坏杂质IV明显增大(2.621％)，未知杂质12明显增大(0.316％)，未知杂质3、4均略有增大(0.106％和0.121％)。
(C)破坏样品经峰纯度检测，峰纯度均大于980。
(D)物料平衡考察结果，主峰破坏减少量与其归一化含量下降基本一致，样品经不同条件破坏后检出的总峰面积基本一致，说明本色谱条件能将降解杂质有效检出。
(E)本品降解试验运行至主成分保留时间的4.5倍，在主成分之后均无降解杂质，因此，参照药典标准，将本品谱图运行时间定为主成分保留时间的2倍。
(3)标准曲线及线性范围试验
1)线性关系
取米力农和米力农杂质III、杂质IV单一成分溶液(浓度为200μg/mL)，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成每1mL中含米力农为8μg和杂质III、杂质IV为1.2μg的混合溶液，作为贮备液。按表配制线性溶液，结果见下表。
表5线性溶液配制
Figure BDA0002542336700000082
Figure BDA0002542336700000091
精密量取上述溶液各20μL分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，以峰面积A为纵坐标、浓度C为横坐标作线性回归，结果如图7～9和表6～8所示，结果表明：米力农杂质III在0.010～0.613μg/mL范围内，峰面积与测定浓度呈良好线性关系；米力农杂质IV在0.009～0.607μg/mL范围内，峰面积与测定浓度呈良好线性关系。
表6米力农杂质III标准曲线及线性方程
Figure BDA0002542336700000092
表7米力农杂质IV标准曲线及线性方程
Figure BDA0002542336700000093
表8米力农标准曲线及线性方程
Figure BDA0002542336700000094
Figure BDA0002542336700000101
2)校正因子计算
根据上述标准曲线绘制结果测得斜率K，根据公式计算校正因子
Figure BDA0002542336700000102
表8校正因子测定结果
杂质名称 f
杂质III 0.60
杂质IV 0.93
表8为校正因子测定结果，该结果表明，本品杂质校正因子均在0.2～5.0范围内，根据2015版药典四部通则中药品杂质分析指导原则，本品杂质III可用加校正因子的0.1％自身对照法计算其含量，杂质IV按自身对照法计算其含量。
(4)定量限和检测限试验
取混合溶液，用稀释法测其定量限(S/N＝10)、检测限(S/N＝3)。试验结果表明，在本色谱条件下，米力农与杂质III、IV检测限、定量限符合有关物质检查要求。结果见下表10，表中结果说明，各杂质定量限浓度均在报告限度0.05％以下，即表明采用上述色谱条件可有效地检出上述各物质。
表10检测限、定量限
Figure BDA0002542336700000103
(5)进样精密度
取各单一溶液，用流动相溶解并稀释制成每1mL中含米力农为2μg和杂质III、IV为0.3μg的混合溶液，重复进样6针，分别计算其RSD，考察其精密度。结果见下表。
表11进样精密度检查结果
次数 A<sub>杂质IV</sub> A<sub>杂质III</sub> A<sub>米力农</sub>
1 32.9454 49.94495 200.26752
2 32.8925 49.61835 198.32349
3 33.0043 49.58917 198.07343
4 32.8746 49.44762 200.01768
5 33.0288 48.69132 201.89696
6 33.0234 49.92415 198.66484
平均 32.9615 49.5359 199.5407
RSD％ 0.20 0.92 0.73
结果表明：在此色谱条件下，米力农及杂质III、IV进样精密度良好。
(6)对照品溶液稳定性
取进样精密度项溶液，分别于0、2、4、6、8小时进样，记录峰面积，分别计算其RSD，考察其日内稳定性。结果见下表，图谱见图10～图11。
表12对照品溶液稳定性
次数 A<sub>杂质IV</sub> A<sub>杂质III</sub> A<sub>米力农</sub>
0小时 34.06261 50.15181 197.45251
2小时 34.01122 50.24874 198.02708
4小时 33.9623 49.96145 197.80637
6小时 33.68418 49.97234 197.26318
8小时 33.64213 49.95569 198.17065
平均 33.87249 50.05801 197.74396
RSD％ 0.58 0.27 0.19
结果表明：各杂质在流动相中8小时内较稳定，日内误差较小。
(7)供试品溶液稳定性
取本品适量，加流动相配制成2mg/mL的供试品溶液，分别于0、2、4、6、8小时进样，记录峰面积，分别计算其RSD，考察其日内稳定性。结果见下表13。
表13供试品溶液稳定性
Figure BDA0002542336700000111
Figure BDA0002542336700000121
结果表明：样品在流动相中8小时内较稳定，日内误差较小。
(8)重复性
取米力农，按照实施例1中方法，重复测定6次。见表。
表14重复性测定结果
次数 杂质IV％ 杂质III％
1 0.0030 未检出
2 0.0033 未检出
3 0.0026 未检出
4 0.0032 未检出
5 0.0032 未检出
6 0.0030 未检出
平均 0.0031 /
结论：本法测定有关物质重复性良好。
(9)准确度试验(加样回收率)
取米力农杂质III、IV溶液(浓度为200μg/mL)，用流动相稀释至刻度，摇匀，制成每1mL中分别含米力农杂质III、IV为1.5μg的混合溶液，作为杂质贮备液。分别取米力农原料约20mg，精密称定，置10mL量瓶，分别杂质贮备液1mL(0.05％浓度)、2mL(0.1％浓度)、3mL(0.15％浓度)，加流动相溶解稀释至刻度，作为供试品溶液，各浓度供试品溶液平行配制三份；分别精密吸取20μL供试品溶液及对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见下表。
表15米力农杂质加样回收率
Figure BDA0002542336700000122
Figure BDA0002542336700000131
计算公式：
已知量＝米力农称样量×重复性项下各杂质含量均值
测得量＝测得总量-已知量
回收率＝〔测得加入量/加入量〕×100％
结论：米力农杂质IV加样回收率在94.0～103.8％范围内，平均值为99.5％，米力农杂质III加样回收率在92.1～102.5％范围内，平均值为97.3％，均在可接受的范围内。
(10)中间精密度
由不同操作人员，于不同时间照重复性试验方法对同一批号样品进行有关物质检查。在210nm波长下检查结果见下表。
表16不同试验人员对测定结果的影响
试验人 YD XYQ YD(不同时间) YD(不同仪器)
仪器编号 CA1212 CA1212 CA1212 CA1209
杂质IV(％) 0.003 0.003 0.004 0.004
杂质III(％) 未检出 未检出 未检出 未检出
结论：本品有关物质检查中间精密度良好。
(11)耐用性试验
取米力农进行有关物质耐用性试验。主要从流动相不同比例、缓冲液不同pH值、不同柱温、不同色谱柱等几个方面验证。图谱见图12～图21。
表17有关物质检查HPLC法的耐用性
Figure BDA0002542336700000141
结论：耐用性试验结果表明，本方法色谱条件参数微小变化对米力农各杂质分离度没有明显影响。
实施例3：高效液相法测定米力农中基因毒性杂质的方法
仪器及检测波长：液相色谱仪，紫外检测器检测波长210nm；
色谱柱：用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂(长250mm，内径4.6mm，填料粒径5μm)；
流动相：磷酸氢二钾溶液(取磷酸氢二钾2.7g，加水800mL溶解后，加三乙胺2.4mL，用磷酸调节pH值至7.5)-乙腈(80∶20)；
流速：1.0mL/min；
柱温及进样量：柱温30℃，进样量20μL；
以实施例1中的方法配制米力农、杂质III和杂质IV的系统适用性溶液；
取样品，用流动相溶解并制成每1mL中约含2mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取此溶液1mL，置10mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
具体试验操作：
分别取系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液各20μL注入高效液相色谱仪，检测波长为210nm，记录色谱图，进行计算，其结果如下表18所示。
表18有关物质检查结果
Figure BDA0002542336700000151
由表18可见，三批样品中的杂质III、杂质IV均符合规定。
综上，使用本发明提供的高效液相色谱法测定米力农中基因毒性杂质的方法，能够快速、有效、准确和可靠的分离检测出米力农原料药中遗传毒性杂质III和IV，有利于提高米力农的产品质量，提高患者用药安全性。

Claims (8)

1.一种高效液相法测定米力农中基因毒性杂质的方法，其特征在于，采用高效液相法对米力农中的基因毒性杂质的含量进行检测，所述的基因毒性杂质为杂质III和杂质IV，所述的米力农、杂质III和杂质IV的化学结构式如下：
Figure FDA0002542336690000011
2.根据权利要求1所述的高效液相法测定米力农中基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
(1)用流动相配置米力农、杂质III和杂质IV的混合线性溶液，用流动相配置待测样品溶液；
(2)设置高效液相检测条件；
(3)进行高效液相检测，记录色谱图，制作标曲，计算待测样品中杂质III、杂质IV各自的含量。
3.根据权利要求1或2所述的高效液相法测定米力农中基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述高效液相法中液相色谱仪的检测波长为210nm。
4.根据权利要求1或2所述的高效液相法测定米力农中基因毒性杂质的方法，其特征在于，采用以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱温为28～32℃；以磷酸氢二钾溶液-乙腈为流动相，所述的流动相流速为0.95～1.05mL/min，pH7.4～7.6，其中磷酸氢二钾溶液与乙腈体积比为81∶19～79∶21。
5.根据权利要求4所述的高效液相法测定米力农中基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述磷酸氢二钾溶液与乙腈体积比为80∶20。
6.根据权利要求4所述的高效液相法测定米力农中基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述的流动相的pH值为7.5，流速为1.0mL/min。
7.根据权利要求4所述的高效液相法测定米力农中基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述的色谱柱长250mm，内径4.6mm，填料粒径5μm。
8.根据权利要求4所述的高效液相法测定米力农中基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述的色谱柱型号为E16100612或E16100615。
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