CN110095554A - 高效液相色谱分析米力农有关物质的方法 - Google Patents

Abstract

一种高效液相色谱分析米力农有关物质的方法，以C18反相色谱柱，以pH6.5～8.5的磷酸氢二钾溶液为流动A相，以水/乙腈体积比30∶70～60∶40为流动B相实施洗脱，经一次上样即对米力农及其16种杂质实现检测。与现有技术相比，本发明提供的方法，不仅能检出更多的杂质，还对各种杂质有良好的灵敏度。具体应用时，根据各批次样品的检测结果，制定关键杂质的限度，极大的提高了实际生产过程中的经济适用性。

Description

高效液相色谱分析米力农有关物质的方法

技术领域

本发明涉及一种对化合物合成中涉及的杂质进行分析的方法，尤其涉及一种分析米 力农相关物质的方法。

背景技术

米力农，英文名称为Milrinone，化学名称为为1，6-二氢-2-甲基-6-氧代-[3，4′双吡 啶]-5-甲腈，分子式为C₁₂H₉N₃O，分子量为211.22，CAS号为78415-72-2，结构式如下：

在制造药品的有效活性分子过程中，杂质是影响产品的关键质量属性。杂质的结构、 理化性质和毒性情况复杂，因此有关物质的检查研究常常是药品研发中的难点之一。药 品在临床使用过程中产生的不良反应除了与主成分的药理活性有关，与杂质的影响也密 不可分。为保证临床安全用药，必须严格控制药品中的杂质。

目前中国药典(2015)，美国药典(USP40-NF35)收载的米力农有关物质检查的方法色谱条件相同。色谱柱均采用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸氢二钾溶液(取 磷酸氢二钾2.7g，加水800ml溶解后，加三乙胺2.4ml，用磷酸调pH值至7.5)与乙腈 (80：20)为流动相，检测波长为220nnn。中国药典的方法对仅对两个已知杂质(杂质 I：[1，6-二氢-2-甲基-6-氧代-(3，4′-二吡啶)-5-甲酰胺]，杂质II：[1，6-二氢-2-甲基-6-氧代-(3，4′- 二吡啶)-5-甲酸甲酯])进行了限度的规定，其他均为未知杂质；美国药典中也仅有一个已 知杂质(杂质A：[1，6-二氢-2-甲基-6-氧代-(3，4′-二吡啶)-5-甲酰胺])，且根据该方法，杂质W1，6-二氢-2-甲基-6-氧代-(3，4′-二吡啶)-5-酰亚胺酸乙酯的保留时间为108分钟。上述两个方 法对杂质的检出能力有限，对产品的质量控制有待进一步提高。因此必须寻找一种更加 适用的米力农有关物质的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对米力农合成过程中存在的各项杂质进行一步检测的方 法，使得米力农有关物质的检测更可靠，提高药品的安全性和有效性。

本发明提供的米力农相关物质的检测方法，涉及的各项杂质如下：

一种高效液相色谱分析米力农有关物质的方法，C8反相色谱柱(如：AgilentZORBAX SB-C₈柱，规格为：250×4.6mm，填料粒径5μm)，以pH6.5～8.5的磷酸氢二钾溶液(优先选择pH7.5)为流动A相，以水/乙腈体积比30：70～60：40为流动B相，并按如下方式 实施洗脱：

先以82v/v％流动A相和18v/v％流动B相共混形成洗脱流动相，洗脱20分钟；

再经第一次线性洗脱20分钟，其间增加洗脱流动相中流动B相的含量至40v/v％，同时减少流动A相含量至65v/v％；

接着，以60v/v％流动A相和40v/v％流动B相共混形成的洗脱流动相，洗脱10分钟；

然后，第二次线性洗脱10分钟，其间增加流动B相含量至80v/v％，同时减少流动 A相含量至20v/v％；

之后，以20v/v％流动A相和80v/v％流动B相共混形成的洗脱流动相，洗脱5分钟；

又经第三次线性洗脱5分钟，其间增加流动A相含量至80v/v％，同时减少流动B 相含量至20v/v％；

最后，以80v/v％流动A相和20v/v％流动B相共混形成的洗脱流动相，洗脱5分钟。

本发明提供的高效液相色谱分析米力农有关物质的方法，检测波长为 220nm～270nm。

本发明提供的高效液相色谱分析米力农有关物质的方法，分析中所用色谱柱的柱温 设定为25℃～35℃。

本发明提供的高效液相色谱分析米力农有关物质的方法，分析中洗脱流动相的流速 设定为1.0ml/min～1.5ml/min。

本发明提供的高效液相色谱分析米力农有关物质的方法，米力农主峰与各杂质峰的 分离度≥1.5，各杂质峰间的分离度≥1.2。

本发明提供的高效液相色谱分析米力农有关物质的方法，的峰 位置重叠。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明提供的高效液相色谱分析米力农有关物质的方法，对9个杂质纳入质量标准及 监测方法，同时对13种杂质实现了经一次上样柱层析的定性和定量检测，提高了检测的 效率。

与现有技术相比，本发明提供的方法，不仅能检出更多的杂质，还对各种杂质有良好的灵敏度。具体应用时，根据各批次样品的检测结果，制定关键杂质的限度，极大的 提高了实际生产过程中的经济适用性。

与现有技术相比，本发明提供的方法对多种杂质进行分离和检测，保障米力农终产 品的质量，提高了产品的安全性。

与现有技术相比，本发明提供的方法对米力农合成过程中产生的9个关键性杂质进 行分析和控制，保障米力农终产品的质量。

附图说明

图1为本发明的方法应用于米力农检测一实施例的色谱图。

图2为本发明的方法于系统适用性一实施例的色谱图。

具体实施方式

以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非 限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解， 可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围， 其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本实施例中，对米力农合成过程中可能存在的杂质进行了深入的分析，并鉴定了20个杂 质。其中的杂质来源，各杂质与中国药典，美国药典的比对详见表1。

表1米力农杂质谱分析汇总表

对上述杂质进一步分析，杂质E和杂质V无法获得对照品，杂质K和杂质L紫外下无吸 收，杂质O和杂质F出峰时间与杂质S重合，杂质I不出峰。一方面，杂质F和杂质O均为 起始原料的杂质，限度均控制在0.1％以下，且多批起始原料中均未检出。另一方面，即便存在少量的杂质O，也会在米力农的合成中，生成杂质Q，继而生成杂质S，生成的杂质Q及 杂质S均能在本实施例的分析方法中得以控制。最后，杂质I在中间体得以控制，后续合成 过程不会产生杂质I，本实施例分析方法也无需进行分析和控制。综上，即使杂质O和杂质F 出峰时间与杂质S重合，杂质I未检出，不会对终产品米力农的质量造成影响。

实施例1分析方法建立

仪器：Agilent 1100/1260高效液相色谱仪

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C₈(250×4.6mm，5μm)

流动相A：pH 7.5的磷酸氢二钾溶液(取磷酸氢二钾2.7g，加水800ml溶解后，加三乙 胺2.4ml，用磷酸调pH值至7.5)

流动相B：水-乙腈(50∶50)

流速为1ml/min；柱温为30℃；检测波长为260nm；进样量20μl。

洗脱程序如下表2，所得谱图参见图1，实现了13中杂质的表征，其中4种杂质为本产 品非关键杂质，未纳入本实施例的方法中，但本方法仍能对未体现的杂质有效检出。

表2

系统适用性试验溶液配制：精密称取米力农对照品、杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品、杂质D对照品、杂质H对照品、杂质S对照品、杂质T对照品、杂质U对 照品和杂质W对照品各适量，溶剂溶解后稀释制成每1ml含米力农约2.0mg，各已知杂质均 约为1μg的溶液，作为系统适用性试验溶液。

灵敏度溶液的配制：精密量取系统适用性试验溶液1ml，置200ml量瓶中，溶剂稀释至 刻度，摇匀，再精密量取1ml，置20ml量瓶中，溶剂稀释至刻度，摇匀，作为灵敏度溶液(0.025％)。

供试品溶液的配制：取本品约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂[磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钾2.7g，加水800ml溶解后，加三乙胺2.4ml，磷酸调节pH值至7.5)/乙腈(80：20)] 约5ml，80℃水浴加热溶解(必要时超声)后，自然冷至室温后溶剂稀释至刻度，摇匀，即 得供试品溶液(1～2mg/ml)。

对照溶液的配制：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，溶剂稀释至刻度，摇匀， 再精密量取1ml，置20ml量瓶中，溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液(0.05％)。

测定：取空白溶剂，系统适用性溶液，灵敏度溶液，对照溶液，供试品溶液各20μl，分 别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。

结果：空白溶剂对测定无干扰，系统适用性图谱见图2，出峰顺序为杂质U峰、杂质B峰、杂质H峰、杂质A峰、杂质S峰、米力农峰、杂质D峰、杂质T峰、杂质C峰和杂质 W峰。各杂质峰之间的分离度均符合要求，详见表3。

表3

实施例2耐用性试验

微调温度(±5℃)，流速(±20％)，检测波长(±2nm)，流动相比例，起始梯度比例，以评估测定条件参数微小变化时，测定结果不受影响的承受程度。试验结果详见表4。

表4

由表4可知，米力农有关物质的检测方法调整柱温，流速，起始流动相比例，检测波长， 均能满足系统适用性要求，表明该方法耐用性良好。

实施例3检测限

对于已知杂质：配制0.025％供试品浓度(至少为杂质限度浓度的一半)的溶液，若信 噪比S/N不小于10，则将0.025％供试品浓度即作为定量限浓度；配制0.01％供试品浓度的溶 液，若信噪比S/N不小于2，则将0.01％供试品浓度即为检测限浓度；

对于未知杂质：用主成分代替考察单个未知杂质的定量限浓度和检测限浓度。

经检测，杂质U，杂质B，杂质H，杂质A，杂质S，米力农，杂质D，杂质T，杂质 C和杂质W的检测限浓度分别为0.2022μg/ml、0.2010μg/ml、0.2237μg/ml、0.1984μg/ml、 0.1981μg/ml、0.2037μg/ml、0.2072μg/ml、0.1963μg/ml、0.1921μg/ml和0.1914μg/ml。

实施例4专属性

对米力农进行了破坏性降解实验(详见表5)，考察各杂质降解情况。

供试品浓溶液：取本品约400mg，精密称定，至100ml量瓶中，适量40％乙腈水溶液超 声溶解后，稀释至刻度，摇匀得供试品浓溶液(约4mg/m1)。

外标溶液：精密量取供试品浓溶液5ml，置10ml量瓶中，溶剂稀释至刻度，摇匀，即得(约2mg/m1)。

表5

降解结果如下表6。

表6

结果表明：米力农对酸，碱，热，光等均较稳定，对氧化稳定性相对较差。

Claims (9)

1.一种高效液相色谱分析米力农有关物质的方法，其特征在于C8反相色谱柱，以pH6.5～8.5的磷酸氢二钾溶液为流动A相，以水/乙腈体积比30∶70～60∶40为流动B相，并按如下方式实施洗脱：

先以82v/v％流动A相和18v/v％流动B相共混形成洗脱流动相，洗脱20分钟；

再经第一次线性洗脱20分钟，其间增加洗脱流动相中流动B相的含量至40v/v％，同时减少流动A相含量至65v/v％；

接着，以60v/v％流动A相和40v/v％流动B相共混形成的洗脱流动相，洗脱10分钟；

然后，第二次线性洗脱10分钟，其间增加流动B相含量至80v/v％，同时减少流动A相含量至20v/v％；

之后，以20v/v％流动A相和80v/v％流动B相共混形成的洗脱流动相，洗脱5分钟；

又经第三次线性洗脱5分钟，其间增加流动A相含量至80v/v％，同时减少流动B相含量至20v/v％；

最后，以80v/v％流动A相和20v/v％流动B相共混形成的洗脱流动相，洗脱5分钟，并分离如下杂质：

2.根据权利要求1中所述的高效液相色谱分析硫酸特布他林有关物质的方法，其特征在于所述的C8反相柱的规格为：250×4.6mm，填料粒径5μm。

3.根据权利要求1中所述的高效液相色谱分析硫酸特布他林有关物质的方法，其特征在于所述的检测波长为220nm～270nm。

4.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析硫酸特布他林有关物质的方法，其特征在于所述的流动A相为pH7.5。

5.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析硫酸特布他林有关物质的方法，其特征在于所述的色谱柱的柱温设定为25℃～35℃。

6.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析硫酸特布他林有关物质的方法，其特征在于所述的洗脱流动相的流速设定为1.0ml/min～1.5ml/min。

7.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析硫酸特布他林有关物质的方法，其特征在于如下杂质的峰位置重叠：

8.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析硫酸特布他林有关物质的方法，其特征在于所述的米力农主峰与各所述杂质的峰的分离度≥1.5，各所述杂质的峰间的分离度≥1.2。

9.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析硫酸特布他林有关物质的方法，经一次上样，即对13种杂质实现定性和定量的检测。