CN111675773A - 一种可控分子量范围的壳聚糖制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可控分子量范围的壳聚糖制备方法及其应用。本发明以甲壳素为原料，经粉碎、过筛，加入高浓度碱溶液中，混合均匀，经冷冻融化，加热保温，清洗，再次加入高浓度碱溶液中，混合均匀，加热保温，清洗，干燥制得壳聚糖，其脱乙酰度≥90％；细胞毒性小于1级，皮内反应小于1.0，无致敏反应，产品质量符合组织工程医疗产品标准，可用于医疗产品、消杀产品、化妆品和食品添加剂等领域。本发明通过保温温度及保温时间控制，实现壳聚糖的分子量控制，无需制备成壳聚糖再进行降解来控制分子量，可以制备不同分子量范围的壳聚糖。

Description

一种可控分子量范围的壳聚糖制备方法及其应用

技术领域

本发明属于材料技术领域，涉及一种壳聚糖制备方法，具体涉及一种可控制分子量范围的壳聚糖制备方法。

背景技术

甲壳素是广泛存在于甲壳类、昆虫外壳和真菌细胞壁中的天然多糖，其资源量仅次于纤维素，资源极丰富。然而直到1811年，才被法国的一位研究自然科学史的HenriBraconnot发现。1859年，法国人C.Rouget将甲壳素(Chitin)与盐酸共煮，发现了壳聚糖(Chitosan)。动物甲壳素的分子量在100～200万，由于有序结构的存在，使得甲壳素的溶解性能较差，不溶于一般溶剂，这种状况当甲壳素通过脱乙酰化为壳聚糖时会明显改观，这时由于游离氨基产生，溶解性能大大提高，可溶解于稀酸。

近20多年来，壳聚糖研究成果硕果累累。从最初的污水处理剂转变为高附加值的具有生物活性的新材料和新产品，其在医学、生物工程、食品、化妆品、农业等领域已得到广泛应用。不同分子量的壳聚糖具有不同的功能特点，分子量大于100万的壳聚糖，改性后具有粘弹性，主要用于手术防粘连、关节腔润滑等医疗产品；50万～100万分子量的壳聚糖具有很好的成膜性，主要用于止血材料和敷料的制备，如止血颗粒、止血海绵等；1万～50万分子量的壳聚糖具有很好的抗抑菌性能、保湿性能，主要用于消杀产品、化妆品、食品的抗抑菌和保鲜以及创面修复；小于1万分子量的壳聚糖具有一定的药理活性功能，如免疫调节、抗肿瘤、降血脂、调节血糖、改善肝脏和心肺功能等。

目前，壳聚糖的分子量控制制备方法有酸降解法、氧化降解法、物理降解和生物酶降解。

CN1167713将各种脱乙酰度的壳聚糖充分溶解于盐酸中，缓慢加入次氯酸钠-过氧化氢的氧化剂，室温下反应，生成低分子量水溶性壳聚糖。

CN102702390将原料壳聚糖溶解在酸性离子液体水溶液中，加热反应，反应结束后，降解产物用氢氧化钾或氢氧化钠溶液调节pH值至8-10，乙醇或丙酮沉淀、洗涤、真空干燥获得低分子量壳聚糖，分子量范围为5万～12万。

CN102477106将经过精制的高分子量壳聚糖的固体或溶液，用γ射线进行辐照降解，降解产物经溶解、脱色等后处理步骤得到小分子量或水溶性壳聚糖，分子量范围为1万～6万。

刘廷国(华中农业大学刘廷国2008年的硕士论文：冻融法制备水溶性壳聚糖中低温脱乙酰与高温热分解的机理及动力学)采用碱液冻融循环处理甲壳素，并结合均相脱乙酰反应，不引入任何基团，制备了1种脱乙酰度约50％，分子量约30万，pH12以下冷水可溶的水溶性壳聚糖。冷冻过程中冰晶的形成和生长可破坏甲壳素分子间氢键作用，降低分子结构规整性，破坏凝聚态结构并使其结晶度下降。但该方法制备的壳聚糖脱乙酰度低，限制其应用。

综上所述：现有的降解方法存在以下不足：

1)酸降解法产品分子量分布较宽，降解时间长，副产物多，提纯困难；氧化降解法，降解过程的后期常常伴有褐变反应，副产物多，提纯困难；酶降解法，专一性酶价格昂贵难以商业化。

2)以上降解方法均是以壳聚糖为原料进行降解，一方面受壳聚糖分子量限制，只能制备更小分子量的壳聚糖，而制备大分子的壳聚糖需要以甲壳素为起始原料；另一方面，降解过程添加各种化学试剂，用于医疗、消杀、化妆品、食品等人用领域，对产品的化学残留要求较高，后续提纯更加困难，增加了整体的成本。

《YY T 0606.7-2008组织工程医疗产品第7部分壳聚糖》要求壳聚糖的生物学性能指标按照GB/T 16886进行评价，包括：细胞毒性、皮内反应、致敏反应等。

因此，有必要开发一种新的壳聚糖制备技术，以甲壳素为原料，在脱乙酰化制备壳聚糖的过程中，控制反应条件，制备1万-150万不同分子量的壳聚糖，降低生产成本，且产品质量符合组织工程医疗产品标准。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种可控分子量范围的壳聚糖制备方法及其应用。本发明以甲壳素为原料，经粉碎、过筛，加入高浓度碱溶液中，混合均匀，经冷冻融化，加热保温，清洗，再次加入高浓度碱溶液中，混合均匀，加热保温，清洗，干燥步骤，生产的壳聚糖可达到医用级标准，细胞毒性小于1级，皮内反应小于1.0，无致敏反应，产品质量符合组织工程医疗产品标准。本发明通过保温温度及保温时间控制，实现壳聚糖的分子量控制，无需制备成壳聚糖再进行降解来控制分子量，可以制备不同分子量范围的壳聚糖。

本发明的技术方案是：一种可控分子量范围的壳聚糖制备方法，其特征是，包括以下步骤：

1)以甲壳素为原料，经粉碎、过筛，加入高浓度碱溶液中搅拌均匀，于不高于-18℃温度下冷冻，冷冻时间≥4小时；常温融化后，保温反应；用水清洗到中性，沥干；

2)然后再加入高浓度碱溶液中搅拌均匀，保温反应，用水清洗到中性，干燥。

其中，制备不同分子量范围的壳聚糖，步骤1)和2)所采用的保温反应温度及总保温时间分别为：

制备超过100万分子量壳聚糖时，保温反应温度≤80℃，总保温时间1h～4h；

制备50万～100万分子量壳聚糖时，保温反应温度80℃～85℃，总保温时间4h～8h；

制备10万～50万分子量壳聚糖时，保温反应温度85℃～90℃，总保温时间8h～10h；

制备1万～10万分子量壳聚糖时，保温反应温度90℃～95℃，总保温时间10h～24h。

优选的，所述步骤(1)和步骤(2)的高浓度碱溶液为氢氧化钠或氢氧化钾的水溶液，浓度为30％～52％(w/w)。

优选的，所述步骤(1)甲壳素和高浓度碱溶液的质量比为1:1～1:10，优选1:5～1:10，优选；步骤(1)与步骤(2)的高浓度碱溶液的质量比为1:1～1.5:1。

优选的，所述甲壳素的粉碎，颗粒大小应能通过20目筛。

优选的，在制备分子量大于100万的壳聚糖时，在保温过程中加氮气保护。

优选的，干燥温度为50～80℃。

本发明所制备的壳聚糖，其脱乙酰度≥90％；细胞毒性小于1级，皮内反应小于1.0，无致敏反应，产品质量符合组织工程医疗产品标准。

本发明的优点：

1、以甲壳素为原料，在脱乙酰的过程中，通过保温温度及保温时间控制，实现壳聚糖的分子量控制，无需制备成壳聚糖再进行降解来控制分子量，可以制备分子量1万～150万内的不同分子量范围的壳聚糖；

2、本制备工艺所需的试剂种类少(仅涉及碱溶液)，后续的提纯过程更加简单(水洗即可)，产品安全性好；

3、本制备工艺生产的壳聚糖可达到医用级标准，细胞毒性小于1级，皮内反应小于1.0，无致敏反应，可用于医疗产品、消杀产品、化妆品和食品添加剂等领域。

具体实施方式

甲壳素生产商：桓台县金湖甲壳制品有限公司，生产甲壳素的原料为阿拉斯加雪蟹壳，甲壳素为白色片状，灰分小于1％，水分10％。

实施例1

配制45％(w/w)浓度氢氧化钠溶液。将甲壳素粉碎，过20目筛，取筛下物100g，加入45％氢氧化钠溶液600g，搅拌均匀，充氮气，-18℃冷冻4h，常温融化后，75℃保温1小时，用水清洗到中性，沥干，再加入45％氢氧化钠溶液500g，搅拌均匀，充氮气，75℃保温2小时，用水清洗到中性，60℃干燥。

对比例1

配制45％(w/w)浓度氢氧化钠溶液。将甲壳素粉碎，过20目筛，取筛下物100g，加入45％氢氧化钠溶液600g，搅拌均匀，充氮气，75℃保温3小时，用水清洗到中性，60℃干燥。

实施例2

配制45％(w/w)浓度氢氧化钾溶液。将甲壳素粉碎，过60目筛，取筛下物100g，加入45％氢氧化钾溶液600g，搅拌均匀，-18℃冷冻4h，常温融化后，80℃保温2小时，用水清洗到中性，沥干，再加入45％氢氧化钾600g溶液，搅拌均匀，80℃保温2小时，用水清洗到中性，60℃干燥。

实施例3

配制50％(w/w)浓度氢氧化钠溶液。将甲壳素粉碎，过60目筛，取筛下物100g，加入50％氢氧化钠溶液500g，搅拌均匀，-18℃冷冻4h，常温融化后，80℃保温2小时，用水清洗到中性，沥干，再加入50％氢氧化钠溶液500g，搅拌均匀，充氮气，80℃保温3小时，用水清洗到中性，60℃干燥。

实施例4

配制35％(w/w)浓度氢氧化钠溶液。将甲壳素粉碎，过70目筛，取筛下物100g，加入35％氢氧化钠溶液碱液1000g，搅拌均匀，-18℃冷冻4h，常温融化后，90℃保温2小时，用水清洗到中性，沥干，再加入35％氢氧化钠溶液1000g，搅拌均匀，90℃保温6小时，用水清洗到中性，80℃干燥。

实施例5

配制45％(w/w)浓度氢氧化钠溶液。将甲壳素粉碎，过70目筛，取筛下物100g，加入45％氢氧化钠溶液1000g，搅拌均匀，-18℃冷冻4h，常温融化后，95℃保温搅拌2小时，用水清洗到中性，沥干，再加入45％氢氧化钠溶液1000g，搅拌均匀，95℃保温搅拌12小时，用水清洗到中性，80℃干燥。

实施例6

脱乙酰度检测，参照《YY T 0606.7-2008组织工程医疗产品第7部分壳聚糖》标准中脱乙酰度测定法进行检验。

粘均分子量测定：

样品配制：准确称取0.05g壳聚糖，溶解于混合溶剂(0.2mol/L氯化钠-0.1mol/L醋酸)中，定容至50mL，此溶液经3号玻璃砂芯漏斗过滤后即得。

特性粘度测定：移液管量取10.0mL壳聚糖溶液至乌氏粘度计粘度计内，放入25±0.1℃水浴槽内，恒温20min后，测量流出时间t。用稀释法配制不同浓度梯度的壳聚糖溶液，并测量溶液流出的时间。

溶液的特性粘度计算公式：

η_sp＝η_r-1＝(t-t₀)/t₀

t为溶液流出的时间，

t₀为溶剂流出时间。

根据Huggins公式η_sp/C＝[η]+k[η]²C可以求出聚合物的极限粘数[η]。将η_sp/C对浓度C作图，外推至C为0处，截距即为极限粘数[η]。再根据Mark-Houwink公式[η]＝KM^α可计算出粘均分子量M，式中K、α为常数，本实验采用K＝1.81×10^-3，α＝0.93。

表1实施例1-5的脱乙酰度及粘均分子量实验结果

实施例7

壳聚糖应按照GB/T16886.1的要求进行生物学评价，对细胞毒性、皮内反应、致敏反应进行检测评价，应不释放出对人体有不良作用的物质。

表2实施例1与对比例1的技术指标比较

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围。

Claims (8)

1.一种可控分子量范围的壳聚糖制备方法，其特征是，包括以下步骤：

1)以甲壳素为原料，经粉碎、过筛，加入高浓度碱溶液中搅拌均匀，于不高于-18℃温度下冷冻，冷冻时间≥4小时；常温融化后，保温反应；用水清洗到中性，沥干；

2)然后再加入高浓度碱溶液中搅拌均匀，保温反应，用水清洗到中性，干燥；

其中，制备不同分子量范围的壳聚糖，步骤1)和2)所采用的保温反应温度及总保温时间分别为：

制备超过100万分子量壳聚糖时，保温反应温度≤80℃，总保温时间1h～4h；

制备50万～100万分子量壳聚糖时，保温反应温度80℃～85℃，总保温时间4h～8h；

制备10万～50万分子量壳聚糖时，保温反应温度85℃～90℃，总保温时间8h～10h；

制备1万～10万分子量壳聚糖时，保温反应温度90℃～95℃，总保温时间10h～24h。

2.如权利要求1所述的一种可控分子量范围的壳聚糖制备方法，其特征是，所述步骤(1)和步骤(2)的高浓度碱溶液为氢氧化钠或氢氧化钾的水溶液，质量浓度为30％～52％。

3.如权利要求1所述的一种可控分子量范围的壳聚糖制备方法，其特征是，步骤(1)甲壳素和高浓度碱溶液的质量比为1:1～1:10；步骤(1)与步骤(2)的高浓度碱溶液的质量比为1:1～1.5:1。

4.如权利要求3所述的一种可控分子量范围的壳聚糖制备方法，其特征是，步骤(1)甲壳素和高浓度碱溶液的质量比为1:5～1:10。

5.如权利要求1所述的一种可控分子量范围的壳聚糖制备方法，其特征是，所述甲壳素的粉碎，颗粒大小能通过20目筛。

6.如权利要求1所述的一种可控分子量范围的壳聚糖制备方法，其特征是，所述在制备分子量大于100万的壳聚糖时，在保温反应过程中加氮气保护。

7.如权利要求1所述的一种可控分子量范围的壳聚糖制备方法，其特征是，所述干燥温度为50～80℃。

8.权利要求1-7中任一项所述的方法制备的壳聚糖，其脱乙酰度≥90％；细胞毒性小于1级，皮内反应小于1.0，无致敏反应。