CN111658679A - 一种冬虫夏草提取物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种冬虫夏草提取物及其制备方法。该冬虫夏草提取物是以冬虫夏草为原料，经提取制得。所述提取过程为：先在液体中提取，再将提取物用纯水分散，然后用有机溶剂萃取，分别取有机相、水相，即得。该冬虫夏草提取物与多个免疫调节靶点(PD‑1、PD‑L1、TNFR1)具有稳定的、高强度的结合能力，该冬虫夏草提取物还能够有效地阻断293T‑h PD‑L1细胞与PD‑1蛋白的结合，所以，本发明的冬虫夏草提取物可以用来制备包括PD‑1、PD‑L1、TNFR1在内的免疫检查点抑制剂，还可以用来制备治疗包括食管鳞状细胞癌、尿路上皮癌、鳞状非小细胞肺癌在内的多种抗肿瘤药物，应用前景优良。

Description

一种冬虫夏草提取物及其制备方法
技术领域
本发明属于制药领域，特别涉及一种冬虫夏草提取物及其制备方法。
背景技术
免疫治疗是肿瘤治疗的重要手段，其中程序性死亡受体1(programmed celldeath 1,DCD1,PD-1)/程序性死亡受体配体1(programmed cell death 1ligand 1，DCD1LG1，PD-L1)通路抑制药物是目前免疫治疗的热点。PD-1是一种免疫抑制分子，它与配体PD-L1及PD-L2互相作用，可导致肿瘤抗原特异性T细胞凋亡，从而使肿瘤细胞逃脱机体的免疫监控。PD-L1属于B7-H1分子家族，在许多人类肿瘤细胞表面，如肺癌、恶性黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肾细胞癌等中都能够检测到PD-L1的表达，同时研究发现癌组织较正常组织中的PD-L1表达水平明显上调。当肿瘤细胞上高表达的PD-L1与T细胞上的受体PD-1结合时，可传递负性调控信号，诱导T细胞凋亡或导致免疫无能，使肿瘤细胞得以逃避机体的免疫监控和杀伤。而PD-1/PD-L1抑制剂能够阻断PD-1/PD-L1通路，促进效应T细胞的活化及增殖，增强细胞免疫，从而识别并杀伤肿瘤组织。已经有多项研究表明PD-1/PD-L1抑制剂能够达到治疗肿瘤的目的。
以PD-1和PD-L1为靶点的抗体已被美国食品药品管理局(FDA)批准用于治疗多种实体肿瘤。PD-1抑制剂，比如Nivolumab(Opdivo)已被批准用于不可切除或转移性，且对其他治疗药物反应不佳的恶性黑色素瘤及转移性鳞状非小细胞肺癌的治疗。
文献“PD-1/PD-L1抑制剂在晚期胃癌治疗中的临床研究进展”中公开了多种PD-1/PD-L1抑制剂在晚期胃癌的临床研究成果，其中PD-L1抑制剂Avelumab在PD-L1阳性表达的患者的一线及二线治疗中有10％及18.2％的客观缓解率，PD-1抑制剂Pembrolizumab对于PD-L1阳性表达的患者的客观缓解率达22.2％，PD-L1抑制剂Nivolumab单药治疗的客观缓解率达14％。并且，Avelumab等药物在现阶段的研究中表现出可耐受的不良反应，单药治疗的安全性也可接受，在胃癌方面的Ⅲ期随机试验也即将展开。
文献“PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂在肺癌中的研究进展”公开了在肺癌领域中，针对PD1/PD-L1靶点的药物主要有5种，包括抗PD-1单抗(Nivolumab、Pembrolizumab)、抗PD-L1单抗(Atezolizumab、Durvalumab、Avelumab)。其中Pembrolizumab在晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)一线治疗中展示出临床获益。Ib期KEYNOTE001研究发现，Pembrolizumab在初治和经治NSCLC患者中均观察到抗肿瘤活性，安全性可控。对于PD-L1阳性(TPS≥50％)初治的NSCLC，ORR和24个月OS分别达到58％和61％。基于以上结果，KEYNOTE024研究将其用于一线治疗PD-L1(TPS≥50％)、EGFR/ALK阴性的晚期NSCLC。此外，PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂在各项临床试验的成功应用，为包括鳞癌、腺癌和小细胞肺癌在内的多种病理类型肺癌患者均带来了临床获益。
多篇文献“PD-1/PD-L1抑制剂及其生物标志物在食管鳞状细胞癌治疗中的研究进展”、“PD-1/PD-L1抑制剂在晚期尿路上皮癌中的研究进展”、“PD-1/PD-L1抑制剂在结直肠癌中的研究进展”、“PD-1/PD-L1抑制剂在淋巴瘤治疗中的研究进展”、“PD-1/PD-L1通路抑制剂在消化系统肿瘤免疫治疗的研究进展”也分别公开了PD-1/PD-L1抑制剂在治疗食管鳞状细胞癌、晚期尿路上皮癌、结直肠癌、淋巴瘤、消化系统肿瘤等多种肿瘤的免疫药物中取得了令人振奋的进展。所有，研究出更多更加安全、有效的新一代PD-1/PD-L1抑制剂，对制备多种抗肿瘤药物具有非常重要的意义。
除PD-1、PD-L1外，还有多种其它免疫调节靶点受到关注，比如α肿瘤坏死因子(TNFα)家族的蛋白成员作为免疫治疗的调节分子已被确定和开发。TNFα有2个受体：TNFR1和TNFR2，其中TNFR1介导了大部分TNFα的信号功能。TNFα作为重要的炎症因子，广泛参与了多种生理作用，在机体的免疫反应中起关键作用，但是在给予TNFα治疗时，会导致严重的毒副作用。因此寻找新的更加安全、有效、特异的新一代抗TNFα药物受到广泛的关注。
冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫子座和幼虫尸体的干燥复合体。冬虫夏草是我国传统的名贵中药材，具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂等广泛的药理作用，与人参、鹿茸并称“中药三大宝”。
国内外现代药理研究表明，冬虫夏草可通过抑制B16黑色素瘤细胞，人肝癌Hep G2细胞、胃癌细胞、肺癌细胞等肿瘤细胞的生长和增殖，发挥其肿瘤抑制作用。但是，冬虫夏草作为PD-1、PD-L1或TNFR1免疫检查点抑制剂，以及冬虫夏草治疗食管鳞状细胞癌、尿路上皮癌、鳞状非小细胞肺癌的用途还未见报道。。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种能够作为免疫检查点抑制剂的冬虫夏草提取物及其制备方法。
本发明提供了一种冬虫夏草提取物，该提取物是以冬虫夏草为原料，经提取制得。
进一步地，所述提取过程为：先在液体中提取，再将提取物用纯水分散，然后用有机溶剂萃取，分别取有机相、水相，即得。
进一步地，所述液体选自纯水或60～80％的甲醇；料液比为1：(15～25)g/mL；所述提取温度为30～45℃；提取次数为6～12次；每次提取时间为20～40min；
或，
所述在液体中提取的方式为：先在人工胃液中，以料液比1:(15～25)g/mL，于30～45℃下提取4～8次，每次20～40min；再加入人工肠液保温提取2～5次，每次20～40min。
进一步地，所述液体选自纯水或70％的甲醇；料液比为1：20g/mL；所述提取温度为37℃；提取次数为9次；每次提取时间为30min；
或，
所述在液体中提取的方式为：先在人工胃液中，以料液比1:20g/mL，于37℃下提取6次，每次30min；再加入人工肠液保温提取3次，每次30min。
进一步地，所述有机溶剂与纯水的体积比为1：(0.8～1.2)；所述有机溶剂选自酯类、醇类有机溶剂；所述萃取次数为1～5次；
优选地，所述有机溶剂与纯水的体积比为1：1；所述有机溶剂选自乙酸乙酯、正丁醇；所述萃取次数为3次。
进一步地，所述用纯水分散的提取物为干燥后的提取物；和/或，所述提取的方法为超声提取。
本发明还提供了一种制备上述冬虫夏草提取物的方法，所述方法为：以冬虫夏草为原料，经提取制得。
进一步地，所述提取过程为：先在液体中提取，再将提取物用纯水分散，然后用有机溶剂萃取，分别取有机相、水相，即得。
进一步地，所述液体选自纯水或60～80％的甲醇；料液比为1：(15～25)g/mL；所述提取温度为30～45℃；提取次数为6～12次；每次提取时间为20～40min；
或，
所述在液体中提取的方式为：先在人工胃液中，以料液比1:(15～25)g/mL，于30～45℃下提取4～8次，每次20～40min；再加入人工肠液保温提取2～5次，每次20～40min。
进一步地，所述液体选自纯水或70％的甲醇；料液比为1：20g/mL；所述提取温度为37℃；提取次数为9次；每次提取时间为30min；
或，
所述在液体中提取的方式为：先在人工胃液中，以料液比1:20g/mL，于37℃下提取6次，每次30min；再加入人工肠液保温提取3次，每次30min。
进一步地，所述有机溶剂与纯水的体积比为1：(0.8～1.2)；所述有机溶剂选自酯类、醇类有机溶剂；所述萃取次数为1～5次；
优选地，所述有机溶剂与纯水的体积比为1：1；所述有机溶剂选自乙酸乙酯、正丁醇；所述萃取次数为3次。
进一步地，所述用纯水分散的提取物为干燥后的提取物；和/或，所述提取的方法为超声提取。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物，它是由上述冬虫夏草提取物，以及药学上可接受的载体制备而成。
“免疫检查点抑制剂”是一种通过拮抗免疫检查点蛋白，促进T细胞活化，进而产生抗肿瘤免疫效应的制剂。
通过实验证明，本发明提供的冬虫夏草提取物与多个免疫调节靶点(PD-1、PD-L1、TNFR1)具有稳定的、高强度的结合能力，该冬虫夏草提取物还能够有效地阻断293T-h PD-L1细胞与PD-1蛋白的结合，阻断PD-1/PD-L1信号通路。本发明的冬虫夏草提取物可以制备包括PD-1、PD-L1、TNFR1在内的免疫检查点抑制剂，应用前景优良。
此外，根据现有技术的记载可知，PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂能够有效治疗包括食管鳞状细胞癌、尿路上皮癌、鳞状非小细胞肺癌在内的多种肿瘤，所以，本发明的冬虫夏草提取物还可以用来制备治疗食管鳞状细胞癌、尿路上皮癌、鳞状非小细胞肺癌的抗肿瘤药物，应用前景优良。
另外，如背景技术中所述，PD-1抑制剂，比如Nivolumab(Opdivo)已被美国食品药品管理局(FDA)批准用于不可切除或转移性，且对其他治疗药物反应不佳的转移性鳞状非小细胞肺癌的治疗。因此，本发明的冬虫夏草提取物作为免疫检查点抑制剂，在治疗耐药性的转移性鳞状非小细胞肺癌中也具有很好的优势。
本发明的冬虫夏草提取物制备方法简单、成本低、安全无毒，适合工业化生产。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明冬虫夏草提取物抑制PD-1与PD-L1结合的FACS测试结果。。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
其中，冬虫夏草可购于成都市北京同仁堂(光华店)，产品规格：3号，净含量10g，产品批号20180701。将冬虫夏草使用高速粉碎机打成细粉，备用。
实施例1本发明冬虫夏草提取物的制备
1、称取2g冬虫夏草粉末，以70％甲醇为溶剂，料液比1:20g/mL，置于37℃下保温超声提取9次，每次30min。将提取液抽滤后浓缩，产物编号为S1；
2、称取1g冬虫夏草粉末，照《中国药典》配制人工胃液与人工肠液，使用半仿生提取法，以料液比1:20g/mL，先加入人工胃液置于37℃下保温超声提取6次，每次30min，然后加入人工肠液再于37℃下保温超声提取3次，每次30min。将提取液抽滤后浓缩，产物编号为S2；
3、称取1g冬虫夏草粉末，以纯水为溶剂，料液比1:20g/mL，置于37℃下保温超声提取9次，每次30min。将提取液抽滤后浓缩，产物编号为S3；
4、将上述S1-S3样品分别以75mL纯水分散，依次使用等体积乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，合并3次萃取液后减压蒸干，得到萃取浸膏，加上剩余水相，共得到9个样品，分别编号为S1A，S1B，S1C，S2A，S2B，S2C，S3A，S3B，S3C(A：乙酸乙酯萃取相；B：正丁醇萃取相；C：水相)。将S1A，S1B，S2A，S2B，S3A，S3B六个样品分别转移至2mL离心管中，自然干燥后称得重量；将S1C，S2C，S3C三个样品置于-80℃冰箱中冷冻过夜，使用冷冻干燥机冻干样品称得重量。结果如表1所示。
表1所得冬虫夏草提取物的重量
Figure BDA0002402875990000051
对照例1对照样品S4的制备
取与实施例1中步骤2所用相同质量的冬虫夏草粉末、相等体积的人工胃液置于37℃下保温超声提取6次，每次30min，然后加入人工肠液再于37℃下保温超声提取3次，每次30min。将提取液抽滤后浓缩，干燥称重(重量参见表1)，作为空白对照，编号为S4。
以下结合试验例说明本发明冬虫夏草提取物的有益效果。
试验例1利用BIAcore SPR检测本发明冬虫夏草提取物对多个靶点的体外结合亲和力
1、试验方法
(1)测试样的准备：
将实施例1制备得到的S1A，S1B，S1C，S2A，S2B，S2C，S3A，S3B，S3C，以及对照例1制备得到的S4，分别干燥、称取1mg，使用20μL DMSO溶解10个样品，分别取1μL样品溶于99μLPBS中，配制成浓度为500μg/mL，转移至1.5ml离心管备用，将样品依次编号为CS1-CS10；
(2)BIAcore SPR检测：
i.仪器及试剂的准备：将配制好的PBS用0.22μm滤膜过滤，并超声15min去除气泡，主要目的是避免试剂堵塞通道。打开BIAcore仪器以及相关软件，用过滤好的PBS冲洗管路。温度设置为25℃，流速设置为10μL/min。
ii.靶蛋白的配制：将50μg PD-1D用200μL纯水溶解为浓度0.25mg/mL，将100μgPD-L1、用200μL纯水溶解为浓度0.5mg/mL，将50μg TNFR1用100μL纯水溶解为浓度0.5mg/mL，对照三种蛋白的等电点(PI)寻找合适的偶联pH值，PD-1：PI＝8.62、PD-L1：PI＝6.35、TNFR1：PI＝7.29，因此将三种蛋白分别取6μl溶于54μL pH5.5和pH5.0的醋酸钠溶液于1.5mL离心管中备用。
iii.靶蛋白与芯片预富集：当仪器的基线稳定后，准备预富集上样，因此将三种蛋白分别取配好的靶蛋白溶液进样。一段时间后，观察靶蛋白与芯片的反应单位(ResponseUnit,RU)值，最终通过数据比较，确定PD-1的最适pH为5.0，PD-L1的最适pH为5.5，TNFR1的最适pH为5.5。
iv.靶蛋白与芯片正式偶联：正式偶联分三步。第一步：活化。取100μL的NHS和100μL的EDC于离心管中，上样时间7min，流速为10μL/min，以活化CM5芯片表面的葡聚糖。第二步：偶联。将靶蛋白10μl加入90μl最适pH醋酸钠溶液于1.5mL离心管中，混匀后，上样时间7min，流速为10μL/min。第三步：封闭。取150μl封闭液(ETH)离心于1.5mL离心管中，上样时间7min，流速为10μL/min，用于封闭芯片表面没有与蛋白结合的区域。PD-1与芯片的RU值为3422.4，PD-L1与芯片的RU值为9927.8，TNFR1与芯片的RU值为6146.5。
v.SPR检测：取配制好的样品，离心去除气泡，进样1min，流速设置为30μL/min，记录RU值。为了考察实验的重现性，在CS1-CS10样品进样结束之后，对CS1、CS2、CS3进行重复测试，标记为CS1R、CS2R、CS3R。RU数值的大小能够反映样品中的小分子化合物和靶蛋白的结合效率。
vi.再生：当药物与靶蛋白有RU值时，二者先结合后解离，先后使用pH为3.0、2.5、2.0、1.5的甘氨酸(Glycine)解离30s，流速30μL/min，有的药物难解离，用5mM的NaOH解离与靶蛋白结合的药物，直到RU值小于50，然后进行下一个样品检测。
2、试验结果
对CS1-CS10十个样品进行了多靶点(PD-1、PD-L1、TNFR1)的BIAcore SPR检测，并且对实验进行重现性考察。表2为冬虫夏草提取物中的十个样品(CS1-CS10)与靶蛋白的体外RU值，用来表示冬虫夏草提取物与靶蛋白的作用强度；表3为冬虫夏草提取物中的十个样品(CS1-CS10)与靶蛋白体外结合两分钟之后的RU值，用来表示冬虫夏草提取物与靶蛋白产生体外结合的稳定性。
表2冬虫夏草-提取物多靶点SPR检测结果
Figure BDA0002402875990000071
根据表2中BIAcore SPR检测结果发现，本发明制得的冬虫夏草提取物对多个靶蛋白(PD-1、PD-L1、TNFR1)都具有体外结合亲和力。其中，与CS10样品和水相提取物(CS3、CS6、CS9)相比，有机相提取物(CS1、CS2、CS4、CS5、CS7、CS8)的RU值显著提高。特别是CS1、CS2、CS4、CS7，同时对多个靶蛋白(PD-1、PD-L1、TNFR1)都表现出优异的体外结合能力。
表3冬虫夏草提取物多靶点结合稳定性SPR检测结果
Figure BDA0002402875990000072
根据表3中BIAcore SPR检测结果发现，冬虫夏草提取物与靶蛋白体外结合两分钟之后，仍然对靶蛋白具有良好的体外结合亲和力。其中，与CS10样品和水相提取物(CS3、CS6、CS9)相比，有机相提取物(CS1、CS2、CS4、CS5、CS7、CS8)的RU值显著提高。特别是CS1、CS2、CS4、CS7，同时对多个靶蛋白(PD-1、PD-L1、TNFR1)都表现出稳定的、高强度的体外结合能力，可以作为有效的PD-1、PD-L1和TNFR1抑制剂，在作为通过免疫调节来治疗肿瘤的药物中具有非常好的潜力。
试验例2流式细胞术(FACS)检测本发明冬虫夏草提取物对PD-1/PD-L1的抑制作用
1、试验方法
(1)材料及来源
细胞系：293T-h PD-L1，贴壁细胞；培养基：DMEM+10％FBS；胎牛血清FBS(Gbico,Cat#10099-141)；DMEM(HyClone,Cat#SH3002201)；PBS(Solarbio,Cat#P1020)；胰酶(Gbico,Cat#25200072)；FACS Buffer(PBS+1％BSA)；PE anti-human IgG Fc Antibody(Biolegend,Cat#409304)；Human PD-1融合蛋白(Acro，cat#PD1-H5257)。
(2)仪器及来源
生物安全柜，Thermo Scientific，Model 1300Series A2；CO2培养箱，ThermoScientific，Model 3100Series；倒置显微镜，Olympus，CKX41SF；流式细胞仪，Millipore，Guava easyCyte 8HT；冰箱，Thermo Scientific，900SERIES。
(3)待测样品的配置
将实施例1制备得到的S1A干燥、称取1mg，使用DMSO溶解，配置成10g/L的母液，将样品命名为190228D1(见表5)，然后备用，进行FACS测试。
(4)FACS测试步骤
A、细胞收集：
a)收获处于对数生长期的细胞并用台盼蓝排斥法检测细胞活力，确保细胞活力在90％以上。
b)1000r/min速度下，离心5min后，弃上清；
c)使用PBS洗涤细胞一次；
d)使用FACS Buffer重悬细胞，并计数；
e)使用FACS Buffer配制密度为6.25×106cells/mL的细胞悬液；
f)向96孔板中分别加入80μL的细胞悬液；
g)96孔板中细胞分组为：
1.空白对照组(Blank Control，不加一抗、二抗和待测样品)
2.二抗对照组(2nd Ab Control，不加一抗和待测样品，加二抗)
3.阳性对照组(PD1-hFC，加一抗和二抗，不加待测样品)
4.实验组(190228D1，加一抗、二抗和待测样品)。
B、抗体孵育及检测
a)向实验组中加入10μL 10×梯度浓度的待测样品，使终浓度为500mg/L。其他对照组中加入等体积的FACS Buffer；
b)混匀后，阳性对照组和实验组中加入10μL 10×浓度的PD1-hFC蛋白，终浓度为：1μg/ml；其他对照组中加入等体积的FACS Buffer；
c)混匀后，放于4℃避光孵育40min；
d)使用FACS Buffer洗涤细胞3次，每次400μL，1000r/min速度下，离心5min，最后使用100μL FACS Buffer重悬细胞；
e)向实验组、二抗对照组和阳性组中加入5μL的PE标记的二抗，空白对照组加入等体积的FACS Buffer；
f)混匀后，放于4℃避光孵育40min；
g)使用FACS Buffer洗涤细胞3次，每次400μL，1000r/min速度下，离心5min，最后使用250μL FACS Buffer重悬细胞；
h)流式细胞仪检测YEL-HLog(Excitation Laser：488nm Blue Laser)。
C、数据处理
用FlowJo软件分析FACS数据。
2、试验结果
FACS测试结果如图1所示，可以看出与阳性对照组相比，实验组的荧光强度显著降低(P＜0.05)，说明本发明制备的冬虫夏草提取物能够有效地阻断293T-h PD-L1细胞与PD-1蛋白的结合，阻断PD-1/PD-L1信号通路。
综上，本发明提供了一种冬虫夏草提取物及其制备方法，该冬虫夏草提取物与多个免疫调节靶点(PD-1、PD-L1、TNFR1)具有稳定的、高强度的结合能力，该冬虫夏草提取物还能够有效地阻断293T-h PD-L1细胞与PD-1蛋白的结合，阻断PD-1/PD-L1信号通路。本发明的冬虫夏草提取物可以用来制备包括PD-1、PD-L1、TNFR1在内的免疫检查点抑制剂，还可以用来制备治疗包括食管鳞状细胞癌、尿路上皮癌、鳞状非小细胞肺癌在内的多种抗肿瘤药物，应用前景优良。

Claims (13)

1.一种冬虫夏草提取物，其特征在于：该提取物是以冬虫夏草为原料，经提取制得。
2.根据权利要求1所述的冬虫夏草提取物，其特征在于：所述提取过程为：先在液体中提取，再将提取物用纯水分散，然后用有机溶剂萃取，分别取有机相、水相，即得。
3.根据权利要求2所述的冬虫夏草提取物，其特征在于：所述液体选自纯水或60～80％的甲醇；料液比为1：(15～25)g/mL；所述提取温度为30～45℃；提取次数为6～12次；每次提取时间为20～40min；
或，
所述在液体中提取的方式为：先在人工胃液中，以料液比1:(15～25)g/mL，于30～45℃下提取4～8次，每次20～40min；再加入人工肠液保温提取2～5次，每次20～40min。
4.根据权利要求3所述的冬虫夏草提取物，其特征在于：所述液体选自纯水或70％的甲醇；料液比为1：20g/mL；所述提取温度为37℃；提取次数为9次；每次提取时间为30min；
或，
所述在液体中提取的方式为：先在人工胃液中，以料液比1:20g/mL，于37℃下提取6次，每次30min；再加入人工肠液保温提取3次，每次30min。
5.根据权利要求2所述的冬虫夏草提取物，其特征在于：所述有机溶剂与纯水的体积比为1：(0.8～1.2)；所述有机溶剂选自酯类、醇类有机溶剂；所述萃取次数为1～5次；
优选地，所述有机溶剂与纯水的体积比为1：1；所述有机溶剂选自乙酸乙酯、正丁醇；所述萃取次数为3次。
6.根据权利要求2～5任一项所述得冬虫夏草提取物，其特征在于：所述用纯水分散的提取物为干燥后的提取物；和/或，所述提取的方法为超声提取。
7.一种制备权利要求1-6任一所述冬虫夏草提取物的方法，其特征在于：所述方法为：以冬虫夏草为原料，经提取制得。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述提取过程为：先在液体中提取，再将提取物用纯水分散，然后用有机溶剂萃取，分别取有机相、水相，即得。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述液体选自纯水或60～80％的甲醇；料液比为1：(15～25)g/mL；所述提取温度为30～45℃；提取次数为6～12次；每次提取时间为20～40min；
或，
所述在液体中提取的方式为：先在人工胃液中，以料液比1:(15～25)g/mL，于30～45℃下提取4～8次，每次20～40min；再加入人工肠液保温提取2～5次，每次20～40min。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述液体选自纯水或70％的甲醇；料液比为1：20g/mL；所述提取温度为37℃；提取次数为9次；每次提取时间为30min；
或，
所述在液体中提取的方式为：先在人工胃液中，以料液比1:20g/mL，于37℃下提取6次，每次30min；再加入人工肠液保温提取3次，每次30min。
11.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂与纯水的体积比为1：(0.8～1.2)；所述有机溶剂选自酯类、醇类有机溶剂；所述萃取次数为1～5次；
优选地，所述有机溶剂与纯水的体积比为1：1；所述有机溶剂选自乙酸乙酯、正丁醇；所述萃取次数为3次。
12.根据权利要求7～11任一项所述的制备方法，其特征在于：所述用纯水分散的提取物为干燥后的提取物；和/或，所述提取的方法为超声提取。
13.一种抗肿瘤药物，它是由权利要求1-6任一项所述冬虫夏草提取物，以及药学上可接受的载体制备而成。
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