CN111647583A - 一种中性蛋白酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于发酵技术领域，提出了一种中性蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：A、将枯草芽孢杆菌种子液接种至发酵培养基中发酵培养，培养温度为25～28℃，培养时间为14～16h，得到初发酵液；B、向初发酵液中加入补料培养基培养12～15h，得到发酵液；C、将发酵液经絮凝、精滤、超滤浓缩、稳定处理后得到中性蛋白酶成品；发酵培养基的pH值为6.5‑6.8，其包括以下重量份的组分：红薯淀粉30～50份，豆饼粉20～30份，南瓜粉5～10粉，腐殖酸镁1.2～1.5份，络蛋白酸钙0.8～1.2份，磷酸氢二钾0.5～1.2份，氯化氨1～1.5份，硝酸钠1～1.3份，水400～500份。通过上述技术方案，解决了现有技术中由微生物发酵方法生产的中性蛋白酶的酶活力偏低的问题。

Description

一种中性蛋白酶的制备方法
技术领域
本发明属于发酵技术领域，涉及一种中性蛋白酶的制备方法。
背景技术
中性蛋白酶属于一种水解酶，能催化大分子蛋白质水解为小分子肽或氨基酸等产物，促进蛋白质的吸收和利用，由于其催化反应速度快、无工业污染、催化反应条件适应性宽等性质和优点，被广泛的应用于食品、饲料、化妆品、营养保健品、洗涤剂等行业。
生产中性蛋白酶可以从动植物组织中提取，以植物作为蛋白酶的来源会受到一些诸如气候条件、可利用土地面积的大小等因素的影响，而以动物作为蛋白酶的来源,其产量的大小主要依赖可被屠宰牲畜的数量。由于从植物和动物中生产蛋酶具有局限性，为了满足当今世界市场的需要，人们越来越多地把目光投到微生物发酵上。微生物发酵菌种主要枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、米曲霉菌、放线菌等。但是目前由微生物发酵生产中性蛋白酶的方式存在中性蛋白酶的酶活力偏低的问题。
发明内容
本发明提出一种中性蛋白酶的制备方法，解决了现有技术中由微生物发酵方法生产的中性蛋白酶的酶活力偏低的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种中性蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：
A、将枯草芽孢杆菌种子液按照5～8％的接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，培养温度为25～28℃，培养时间为14～16h，得到初发酵液；
B、向初发酵液中加入补料培养基补料，再次培养12～15h，得到发酵液；
C、将发酵液经絮凝、精滤、超滤浓缩、加入稳定剂后得到中性蛋白酶成品；
所述发酵培养基包括以下重量份的组分：
红薯淀粉30～50份，豆饼粉20～30份，南瓜粉5～10粉，腐殖酸镁1.2～1.5份，络蛋白酸钙0.8～1.2份，磷酸氢二钾0.5～1.2份，氯化氨1～1.5份，硝酸钠1～1.3份，水400～500份，
所述发酵培养基的pH值为6.5-6.8。
作为进一步的技术方案，所述补料培养基包括以下重量份的组分：
甲醇0.5～1.5份，胡萝卜粉8～15份，虾壳粉5～10份，葡萄糖10～15份，甘油二酯0.5～1.2份。
作为进一步的技术方案，所述絮凝具体为：向发酵液中加入絮凝剂进行絮凝，所述絮凝剂的添加量为发酵液体积的1.5％～2％。
作为进一步的技术方案，所述絮凝剂由质量比为(0.5～1.2)：3的珍珠岩与硅藻土组成。
作为进一步的技术方案，所述精滤具体为：向发酵液中加入海藻酸钠，经边框精滤机精滤，获得澄清滤液。
作为进一步的技术方案，所述海藻酸钠的加入量为发酵液体积的2％。
作为进一步的技术方案，所述超滤具体为用10000分子量超滤膜对澄清滤液进行超滤浓缩，得到浓缩液。
作为进一步的技术方案，所述稳定剂由质量比为4：1的甘油与甘氨酸组成。
作为进一步的技术方案，所述稳定剂的加入量为超滤浓缩后的浓缩液体积的15％。
本发明的工作原理及有益效果为：
1、本发明中，采用枯草芽孢杆菌发酵生产中性蛋白酶，通过对发酵过程中的发酵培养基和补料培养基的配方进行优化改进，显著提高了中性蛋白酶的酶活力，使得生产得到的发酵液中中性蛋白酶的酶活高至29574～29713U/mL，有效解决了现有技术中由微生物发酵方法生产的中性蛋白酶的酶活力偏低的问题。此外，本发明的制备方法得到的中性蛋白酶的耐热性显著提高，适宜在40～50℃下使用。
2、本发明中，发酵培养基中除了发酵中必须的碳源和氮源外，还加入了南瓜粉、腐殖酸镁、络蛋白酸钙，显著提高了发酵液中中性蛋白酶的酶活力。南瓜粉中含有丰富的氨基酸、维生素、葡萄糖、无机盐等营养物质，促使枯草芽孢杆菌菌体快速生长，从而促进了发酵产镁量，同时，南瓜粉中还含有丰富的锌，提高了发酵过程中中性蛋白酶的稳定性，从而提高了中性蛋白酶的酶活力。腐殖酸镁与络蛋白酸钙相互配伍，进一步促进枯草芽孢杆菌发酵产酶，同时，提高了中性蛋白酶的稳定性，因此，提高了中性蛋白酶的酶活力。
3、本发明中，在发酵14～16小时后加入补料培养基进行补料，补料培养基由甲醇、胡萝卜粉、虾壳粉、葡萄糖、甘油二酯组成，一方面，发酵14～16小时后，发酵培养基中的营养物质消耗过大，菌体生长速度下降，补料培养基中胡萝卜粉与虾壳粉、葡萄糖相互配伍，补充发酵过程所需的营养物质，从而促进菌体快速生长；另一方面，发酵过程中生产得到的中性蛋白酶不稳定，极易自溶，造成了中性蛋白酶酶活力的明显降低，而补料培养基中甲醇、胡萝卜粉、虾壳粉与甘油二酯协同配伍，大大的降低了中性蛋白酶的自溶，显著提高了发酵过程中中性蛋白酶的热稳定性，从而显著提高了中性蛋白酶的酶活力和热稳定性。
4、本发明中，将发酵液经絮凝、精滤、超滤浓缩、加入稳定剂后得到中性蛋白酶成品，絮凝剂中珍珠岩与硅藻土相互配伍，有效去除了发酵液中除中性蛋白酶外的杂菌及杂质，再通过精滤、超滤浓缩、加入稳定剂等操作，显著提高了中性蛋白酶成品的纯度。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述枯草芽孢杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏CICC 10071。
枯草芽孢杆菌的种子液由以下步骤得到：
取冷藏枯草芽孢杆菌冷藏菌株，用接种针挑取菌种接种到装有无菌水的试管中，震荡15min，然后用无菌吸管取0.5mL菌液加到斜面培养基上，置于30℃恒温培养箱中培养20h；将培养后得到的菌液转接到灭过菌的种子培养基上培养，在35℃振荡培养18小时，得到枯草芽孢杆菌种子液。其中，斜面培养基包括以下重量份的组分：牛肉膏5份，蛋白胨10份，葡萄糖15份，琼脂16份，磷酸氢二钠0.5份，氯化钠2份，氯化钙1.5份，水1000份，斜面培养基的pH值为7；种子培养基包括以下重量份的组分：红薯淀粉3份，豆饼粉5份，磷酸氢二钠0.5份，氯化钾1份。
实施例1
一种中性蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：
A、将枯草芽孢杆菌种子液按照5％的接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养基包括以下重量份的组分：红薯淀粉40份，豆饼粉25份，南瓜粉7粉，腐殖酸镁1.3份，络蛋白酸钙1份，磷酸氢二钾0.7份，氯化氨1.2份，硝酸钠1.1份，水450份，发酵培养基的pH值为6.6；培养温度为27℃，培养时间为14h，得到初发酵液；
B、向初发酵液中加入补料培养基补料，补料培养基包括以下重量份的组分：甲醇1份，胡萝卜粉10份，虾壳粉8份，葡萄糖14份，甘油二酯1.2份，再次培养15h，得到发酵液；
C、向发酵液中加入絮凝剂进行絮凝，得到絮凝后的发酵液；其中，絮凝剂由质量比为1：3的珍珠岩与硅藻土组成，絮凝剂的添加量为发酵液体积的1.5％；
将絮凝后的发酵液中加入海藻酸钠，经边框精滤机精滤，获得澄清滤液；海藻酸钠的加入量为发酵液体积的2％；
用10000分子量超滤膜对澄清滤液进行超滤浓缩，得到浓缩液；
向浓缩液中加入15％浓缩液体积的稳定剂，得到中性蛋白酶成品，其中，稳定剂由质量比为4：1的甘油与甘氨酸组成。
实施例2
一种中性蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：
A、将枯草芽孢杆菌种子液按照6％的接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养基包括以下重量份的组分：红薯淀粉40份，豆饼粉25份，南瓜粉7粉，腐殖酸镁1.3份，络蛋白酸钙1份，磷酸氢二钾0.7份，氯化氨1.2份，硝酸钠1.1份，水450份，发酵培养基的pH值为6.6；培养温度为27℃，培养时间为15h，得到初发酵液；
B、向初发酵液中加入补料培养基补料，补料培养基包括以下重量份的组分：甲醇1份，胡萝卜粉10份，虾壳粉8份，葡萄糖14份，甘油二酯1.2份，再次培养15h，得到发酵液；
C、向发酵液中加入絮凝剂进行絮凝，得到絮凝后的发酵液；其中，絮凝剂由质量比为1：3的珍珠岩与硅藻土组成，絮凝剂的添加量为发酵液体积的1.5％；
将絮凝后的发酵液中加入海藻酸钠，经边框精滤机精滤，获得澄清滤液；海藻酸钠的加入量为发酵液体积的2％；
用10000分子量超滤膜对澄清滤液进行超滤浓缩，得到浓缩液；
向浓缩液中加入15％浓缩液体积的稳定剂，得到中性蛋白酶成品，其中，稳定剂由质量比为4：1的甘油与甘氨酸组成。
实施例3
一种中性蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：
A、将枯草芽孢杆菌种子液按照8％的接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养基包括以下重量份的组分：红薯淀粉40份，豆饼粉25份，南瓜粉7粉，腐殖酸镁1.3份，络蛋白酸钙1份，磷酸氢二钾0.7份，氯化氨1.2份，硝酸钠1.1份，水450份，发酵培养基的pH值为6.6；培养温度为27℃，培养时间为16h，得到初发酵液；
B、向初发酵液中加入补料培养基补料，补料培养基包括以下重量份的组分：甲醇1份，胡萝卜粉10份，虾壳粉8份，葡萄糖14份，甘油二酯1.2份，再次培养15h，得到发酵液；
C、向发酵液中加入絮凝剂进行絮凝，得到絮凝后的发酵液；其中，絮凝剂由质量比为1：3的珍珠岩与硅藻土组成，絮凝剂的添加量为发酵液体积的1.5％；
将絮凝后的发酵液中加入海藻酸钠，经边框精滤机精滤，获得澄清滤液；海藻酸钠的加入量为发酵液体积的2％；
用10000分子量超滤膜对澄清滤液进行超滤浓缩，得到浓缩液；
向浓缩液中加入15％浓缩液体积的稳定剂，得到中性蛋白酶成品，其中，稳定剂由质量比为4：1的甘油与甘氨酸组成。
实施例4
一种中性蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：
A、将枯草芽孢杆菌种子液按照6％的接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养基包括以下重量份的组分：红薯淀粉30份，豆饼粉30份，南瓜粉5粉，腐殖酸镁1.2份，络蛋白酸钙1.2份，磷酸氢二钾0.5份，氯化氨1份，硝酸钠1份，水400份，发酵培养基的pH值为6.8；培养温度为27℃，培养时间为14h，得到初发酵液；
B、向初发酵液中加入补料培养基补料，补料培养基包括以下重量份的组分：甲醇0.5份，胡萝卜粉15份，虾壳粉5份，葡萄糖15份，甘油二酯1.2份；
C、向发酵液中加入絮凝剂进行絮凝，得到絮凝后的发酵液；其中，絮凝剂由质量比为1：3的珍珠岩与硅藻土组成，絮凝剂的添加量为发酵液体积的1.5％；
将絮凝后的发酵液中加入海藻酸钠，经边框精滤机精滤，获得澄清滤液；海藻酸钠的加入量为发酵液体积的2％；
用10000分子量超滤膜对澄清滤液进行超滤浓缩，得到浓缩液；
向浓缩液中加入15％浓缩液体积的稳定剂，得到中性蛋白酶成品，其中，稳定剂由质量比为4：1的甘油与甘氨酸组成。
实施例5
一种中性蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：
A、将枯草芽孢杆菌种子液按照5～8％的接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养基包括以下重量份的组分：红薯淀粉50份，豆饼粉20份，南瓜粉10粉，腐殖酸镁1.5份，络蛋白酸钙0.8份，磷酸氢二钾1.2份，氯化氨1.5份，硝酸钠1.3份，水500份，发酵培养基的pH值为6.5；培养温度为25℃，培养时间为14h，得到初发酵液；
B、向初发酵液中加入补料培养基补料，补料培养基包括以下重量份的组分：甲醇1.5份，胡萝卜粉8份，虾壳粉10份，葡萄糖10份，甘油二酯0.5份，再次培养15h，得到发酵液；
C、向发酵液中加入絮凝剂进行絮凝，得到絮凝后的发酵液；其中，絮凝剂由质量比为(0.5～1.2)：3的珍珠岩与硅藻土组成，絮凝剂的添加量为发酵液体积的1.8％；
将絮凝后的发酵液中加入海藻酸钠，经边框精滤机精滤，获得澄清滤液；海藻酸钠的加入量为发酵液体积的2％；
用10000分子量超滤膜对澄清滤液进行超滤浓缩，得到浓缩液；
向浓缩液中加入15％浓缩液体积的稳定剂，得到中性蛋白酶成品，其中，稳定剂由质量比为4：1的甘油与甘氨酸组成。
实施例6
一种中性蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：
A、将枯草芽孢杆菌种子液按照6％的接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养基包括以下重量份的组分：红薯淀粉30份，豆饼粉20份，南瓜粉10粉，腐殖酸镁1.2份，络蛋白酸钙1份，磷酸氢二钾0.8份，氯化氨1。5份，硝酸钠12份，水450份，发酵培养基的pH值为6.6；培养温度为28℃，培养时间为16h，得到初发酵液；
B、向初发酵液中加入补料培养基补料，补料培养基包括以下重量份的组分：甲醇0.8份，胡萝卜粉12份，虾壳粉6份，葡萄糖15份，甘油二酯0.9份，再次培养13h，得到发酵液；
C、向发酵液中加入絮凝剂进行絮凝，得到絮凝后的发酵液；其中，絮凝剂由质量比为(0.5～1.2)：3的珍珠岩与硅藻土组成，絮凝剂的添加量为发酵液体积的2％；
将絮凝后的发酵液中加入海藻酸钠，经边框精滤机精滤，获得澄清滤液；海藻酸钠的加入量为发酵液体积的2％；
用10000分子量超滤膜对澄清滤液进行超滤浓缩，得到浓缩液；
向浓缩液中加入15％浓缩液体积的稳定剂，得到中性蛋白酶成品，其中，稳定剂由质量比为4：1的甘油与甘氨酸组成。
实施例7
一种中性蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：
A、将枯草芽孢杆菌种子液按照6％的接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养基包括以下重量份的组分：红薯淀粉45份，豆饼粉24份，南瓜粉8粉，腐殖酸镁1.5份，络蛋白酸钙1.2份，磷酸氢二钾0.5份，氯化氨1份，硝酸钠1份，水500份，发酵培养基的pH值为6.5；培养温度为25℃，培养时间为16h，得到初发酵液；
B、向初发酵液中加入补料培养基补料，补料培养基包括以下重量份的组分：甲醇1.3份，胡萝卜粉14份，虾壳粉9份，葡萄糖11份，甘油二酯0.8份，再次培养12～15h，得到发酵液；
C、向发酵液中加入絮凝剂进行絮凝，得到絮凝后的发酵液；其中，絮凝剂由质量比为(0.5～1.2)：3的珍珠岩与硅藻土组成，絮凝剂的添加量为发酵液体积的1.5％～2％；
将絮凝后的发酵液中加入海藻酸钠，经边框精滤机精滤，获得澄清滤液；海藻酸钠的加入量为发酵液体积的2％；
用10000分子量超滤膜对澄清滤液进行超滤浓缩，得到浓缩液；
向浓缩液中加入15％浓缩液体积的稳定剂，得到中性蛋白酶成品，其中，稳定剂由质量比为4：1的甘油与甘氨酸组成。
对比例1
本对比例与实施例1的区别仅在于发酵培养基中未加入南瓜粉。
对比例2
本对比例与实施例1的区别仅在于发酵培养基中未加入腐殖酸镁。
对比例3
本对比例与实施例1的区别仅在于发酵培养基中未加入络蛋白酸钙。
对比例4
本对比例与实施例1的区别仅在于发酵培养基中未加入腐殖酸镁和络蛋白酸钙。
对比例5
本对比例与实施例1的区别仅在于补料培养基中未加入胡菠萝粉和虾壳粉。
对比例6
本对比例与实施例1的区别仅在于补料培养基中未加入甲醇和甘油二酯。
实施例1～7及对比例1～4的制备方法得到的发酵液的用福林酚法检测中性蛋白酶的酶活力，检测结果如下：
表1实施例1～7及对比例1～6的制备方法得到的发酵液中中性蛋白酶的酶活力
组别 酶活力U/mL
实施例1 29652
实施例2 29586
实施例3 29713
实施例4 29627
实施例5 29574
实施例6 29665
实施例7 29708
对比例1 26159
对比例2 24183
对比例3 23472
对比例4 22764
对比例5 22591
对比例6 24722
从表1中数据可以看出，与对比例1～6相比，实施例1～7的方法得到的发酵液中中性蛋白酶的酶活高至29574～29713U/mL，说明本发明的中性蛋白酶的制备方法显著提高了中性蛋白酶的酶活力，有效解决了现有技术中的由微生物发酵方法生产的中性蛋白酶的酶活力偏低的问题。
与实施例1～7相比，对比例1～7的方法得到的酶活力均较低，这是由于对比例1～7的方法中，对比例1的发酵培养基未加入南瓜粉，对比例2的发酵培养基未加入腐殖酸镁，对比例3的发酵培养基中未加入络蛋白酸钙，对比例4的发酵培养基中未加入腐殖酸镁和络蛋白酸钙，对比例5的补料培养基中未加入胡菠萝粉和虾壳粉，对比例6的补料培养基中未加入甲醇和甘油二酯，说明本发明通过对发酵过程中发酵培养基和补料培养基的配方进行优化改进，显著提高了中性蛋白酶的酶活力。
将实施例1得到的中性蛋白酶(酶活力29652U/mL)在不同温度下进行耐热性测试，测试结果如下：
表2实施例1得到的中性蛋白酶耐热性测试结果
温度(℃) 处理时间(h) 处理后酶活力(U/mL)
30 1 27491
35 1 27873
40 1 28466
45 1 28762
50 1 28169
55 1 27576
从上表中数据可以看出，实施例1的制备方法得到的中性蛋白酶在45℃保温1h后酶活力为28762U/mL，与原酶活力29652U/mL相比，在45℃保温1h的酶活力剩余了97％，说明本发明的制备方法得到的中性蛋白酶的耐热性显著提高，适宜在40～50℃下使用。
本发明福林酚法测定中性蛋白酶酶活的具体方法如下：
(1)定义
1g酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH值的条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以u/g(u/mL)。
(2)原理
蛋白酶在一定温度和pH条件下，水解酪素(哺乳类为幼子生长提供氮源的一种蛋白质)底物，产生含有酚基的氨基酸【如：酪氨酸(α-氨基-β-对羟苯基丙酸)，色氨酸(α氨基-β-吲哚基丙酸)等】，在碱性条件下，将福林试剂还原，生成鉬蓝和钨蓝，用分光光度计测定吸光度，计算其酶活力。
(3)试剂和溶液
福林试剂的制备：于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g，钼酸钠(Na2M0O4·2H2O)25g，水700mL，85％磷酸50mL，浓盐酸100mL，小火沸腾10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂(LiSO4)50g，水50mL和数滴浓溴水(99％)，再微沸15min，以除去多余的溴(冷后仍有绿色再加溴水，再微沸除去过量的溴)，冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶中。
使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。
碳酸钠溶液c(Na2CO3)＝0.4mol/L：取无水碳酸钠42.4g，用水溶解并定容至1000mL。
三氯乙酸c(CCl3·COOH)＝0.4mol/L：取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL。
氢氧化钠溶液c＝0.5mol/L：按GB/T 601-2016《化学试剂标准滴定溶液的制备》中规定的方法配制。
盐酸溶液c＝1mol/L及0.1mol/L：按GB/T 601-2016《化学试剂标准滴定溶液的制备》中规定的方法配制：量取90mL盐酸，注入1000mL水中，摇匀，即得1mol/L盐酸；量取9mL盐酸，注入1000mL水中，摇匀，即得0.1mol/L盐酸。
磷酸缓冲液(pH＝7.5)：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)0.5g，加水溶解并定容至1000mL，须用pH计校正。
酪素(酪蛋白)溶液c＝10g/L：称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴)湿润后，加入pH7.5的缓冲液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100mL的容量瓶中，用缓冲液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期3天。
L-酪氨酸标准溶液c＝100ug/mL：称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液；吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸定容至100mL，即得到100ug/mL-酪氨酸标准溶液。
(4)仪器和设备
恒温水浴锅：40±0.2℃
分光光度计：应符合GB9721的规定
(5)分析步骤
标准曲线的绘制
a、L-酪氨酸标准溶液
Figure BDA0002505281490000091
Figure BDA0002505281490000101
b、分别取1.00Ml(须做平行试验)，各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00mL，福林试剂使用溶液1.00mL，置于40±0.2℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm，分别测定其吸光值，以不含酪氨酸的“0”号管为空白，以吸光值A为纵坐标，酪氨酸浓度c为横坐标，绘制标准曲线(此曲线应通过零点)。
根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(ug)，即为吸光常数K值。其K值应在95～100范围内。
(6)待测酶液的制备
a、滤液根据酶活力用缓冲液稀释至适当浓度，供测定用(稀释至被测吸光值在0.25～0.40范围内)。
b、按下列程序操作：
试管A(空白)
加酶液1.00mL(40±0.2℃)
加三氯乙酸2.00mL(摇匀)
加酪素1.00mL(摇匀)
取出静止10min，过滤
取1.00mL滤液
加碳酸钠溶液5.00mL
加福林试剂使用液1.00mL，(40±0.2℃，显色20min)
于680nm波长，用10mm比色皿测其吸光值
试管B(酶样品，需做三个平行试样)
加酶液1.00mL(40±0.2℃)
加酪素1.00mL(摇匀，40±0.2℃反应10min)
加三氯乙酸2.00mL(摇匀)
取出静止10min，过滤
取1.00mL滤液
加碳酸钠溶液5.00mL
加福林试剂使用液1.00mL，(40±0.2℃，显色20min)
于680nm波长，用10mm比色皿测其吸光值
(7)酶活力计算
X＝A×K×4/10×n
式中：
X----样品的酶活力，u/g(u/mL)；
A----样品平行试验的平均吸光值；
K----吸光常数；
4----反应的总体积；
10---反应时间10min，以1min计；
n----稀释倍数。
所得结果表示至整数，平行试验结果的允许差不得超过3％。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、将枯草芽孢杆菌种子液按照5～8％的接种量接种至发酵培养基中进行发酵培养，培养温度为25～28℃，培养时间为14～16h，得到初发酵液；
B、向初发酵液中加入补料培养基补料，再次培养12～15h，得到发酵液；
C、将发酵液经絮凝、精滤、超滤浓缩、加入稳定剂后得到中性蛋白酶成品；
所述发酵培养基包括以下重量份的组分：
红薯淀粉30～50份，豆饼粉20～30份，南瓜粉5～10粉，腐殖酸镁1.2～1.5份，络蛋白酸钙0.8～1.2份，磷酸氢二钾0.5～1.2份，氯化氨1～1.5份，硝酸钠1～1.3份，水400～500份，
所述发酵培养基的pH值为6.5-6.8。
2.根据权利要求1所述的一种中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述补料培养基包括以下重量份的组分：
甲醇0.5～1.5份，胡萝卜粉8～15份，虾壳粉5～10份，葡萄糖10～15份，甘油二酯0.5～1.2份。
3.根据权利要求1所述的一种中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述絮凝具体为：向发酵液中加入絮凝剂进行絮凝，所述絮凝剂的添加量为发酵液体积的1.5％～2％。
4.根据权利要求3所述的一种中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述絮凝剂由质量比为(0.5～1.2)：3的珍珠岩与硅藻土组成。
5.根据权利要求1所述的一种中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述精滤具体为：向发酵液中加入海藻酸钠，经边框精滤机精滤，获得澄清滤液。
6.根据权利要求5所述的一种中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述海藻酸钠的加入量为发酵液体积的2％。
7.根据权利要求5所述的一种中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述超滤具体为用10000分子量超滤膜对澄清滤液进行超滤浓缩，得到浓缩液。
8.根据权利要求1所述的一种中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述稳定剂由质量比为4：1的甘油与甘氨酸组成。
9.根据权利要求8所述的一种中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述稳定剂的加入量为超滤浓缩后的浓缩液体积的15％。
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