CN111647512A - 一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法 - Google Patents

一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法。通过菌株分离、母种培养基筛选、培养条件筛选和代料培养基筛选实验，最终以PDA+棉籽壳粉培养基和PDA+麦草粉作为母种培养基，野生稠李蘑菇菌丝体生长速度最佳，分别为2.86 mm/d和3.08 mm/d，菌丝长势亦较强，显著优于其他种类培养基；同时筛选出满足要求的代料培养基2种，完全可以满足开展生物学研究的要求。本发明提供的野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法不仅解决了野生稠李蘑菇菌株在普通马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上生长缓慢，菌丝长势弱，不便于作为菌种进行人工驯化栽培研究的技术问题，而且为野生稠李蘑菇菌种开展人工驯化栽培奠定了技术基础。

Description

一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法
技术领域
本发明涉及食用真菌技术领域，本发明具体涉及一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法的技术领域。
背景技术
食用菌普遍富含蛋白质、多糖和维生素，而脂肪含量低，通常具有提高人体免疫力、改善人体机能、治疗心血管疾病的生理功效，被誉为21世纪的健康食品。随着人民生活水平的提高，人们对新型食用菌品种的需求逐渐增大，因此，新的野生食用菌品种开发成为形势发展的需要。
稠李蘑菇(Agaricuspadanus)是近年在我国新发现的食用菌物种之一，隶属于担子菌门，蘑菇纲，蘑菇目，蘑菇科，蘑菇属(Agaricus)，据文献报道，目前该野生资源仅在中国和意大利有分布，在中国，野生稠李蘑菇仅发现于新疆，是新疆部分地区农牧民经常食用的特色食用菌之一，主要生长于荒漠草原上，常埋在土壤里，一般不露出地面。野生稠李蘑菇子实体中大型，风味独特，营养丰富，鲜食和制干均可，深受当地各族群众喜爱，但目前还未见人工驯化栽培成功的文献报道，因此，野生稠李蘑菇具有很大的驯化栽培前景和科研价值。前期研究发现，野生稠李蘑菇菌株在普通马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上生长缓慢，菌丝长势弱，其菌丝体培养物既难以满足开展生物学研究的要求，也不便于作为菌种进行人工驯化栽培研究，因此，亟待开发野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法。
发明内容
针对野生稠李蘑菇菌株在普通马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上生长缓慢，菌丝长势弱，其菌丝体培养物既难以满足开展生物学研究的要求，也不便于作为菌种进行人工驯化栽培研究的技术现状，本发明旨在于提供一种野生稠李蘑菇菌种分离培养方法。通过菌种分离、母种培养基筛选、培养条件筛选和代料培养基筛选实验，最终形成野生稠李蘑菇菌种的菌种分离与培养方法，利用该分离培养方法培养的稠李蘑菇菌丝体长速较快，菌丝长势较强，完全可以满足开展生物学研究的要求，利用该方法培养的稠李蘑菇菌种也便于开展人工驯化栽培研究，为其奠定了技术基础。
为了达到以上技术目的，本发明采用的技术方案是：一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法，具体包括以下步骤：
(1)按照下述配方制备培养基，按照重量分数计，培养基包括：马铃薯160-240g，葡萄糖15-25g，棉籽壳粉30-70g，琼脂粉15-25g，蒸馏水800-1200mL，所述培养基用棉籽壳粉可换为麦草粉；
(2)在野生稠李蘑菇分布区采集其幼嫩子实体，以未开伞为宜，用报纸或透气袋包裹子实体；
(3)用刷子将子实体表面杂质清理干净，在无菌条件下，用75％酒精仔细擦拭子实体表面进行消毒；
(4)将接种好的菌种放置于22-28℃生化培养箱暗培养，待菌丝体长好后，取生长快，无杂菌污染的菌丝块再次移入另一斜面培养基表面，22-28℃培养12d、菌丝长满斜面且无杂菌，即为野生稠李蘑菇菌种母种。
所述步骤(1)中，培养基的制作方法是：先将马铃薯去皮、切成厚度为0.5-1cm左右的片，加1000-1500ml水煮沸30-40min，过滤取汁。然后在此滤液中加入葡萄糖、棉籽壳粉和琼脂粉，小火煮至琼脂溶解，定容至1000ml。将已制备好的培养基趁热分装于试管内，每支10ml，用硅胶塞塞紧试管口，按每10支为一捆，用防潮纸包紧有硅胶塞的一端，放入高压灭菌锅内灭菌，压力1.0-1.5kg/cm2，温度115-121℃，时间30min，取出试管摆斜面，凝固后为母种培养基。
进一步地，所述步骤(1)中培养基，按照重量分数计，包括马铃薯200g，葡萄糖20g，棉籽壳粉50g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL，所述培养基用棉籽壳粉可换为麦草粉；
进一步地，所述步骤(1)高压灭菌锅内灭菌，压力1.2kg/cm2，温度118℃；
进一步地，所述步骤(4)菌种生化箱培养温度为28℃，培养基表面培养温度为25℃培养12d；
本发明通过菌种分离、母种培养基筛选、培养条件筛选和代料培养基筛选实验，最终形成野生稠李蘑菇菌株的菌种分离与培养方法具有以下技术效果：
(1)在稠李蘑菇母种培养基筛选方面，稠李蘑菇母种菌丝体在PDA培养基上的生长速度为1.38mm/d，在其他7种培养基上的生长速度为2.15～3.08mm/d，均高于对照组，其中在PDA+棉籽壳粉培养基和PDA+麦草粉培养基上生长速度最佳，分别为2.86mm/d和3.08mm/d，且长势强，显著高于其他种类培养基。
(2)在稠李蘑菇代料培养基筛选方面，以棉籽壳培养基为基础培养基，稠李蘑菇菌丝在稠李蘑菇代料培养基在菌丝体生长速度方面，稠李蘑菇菌丝体除了在木屑培养基上无法生长外，在其他8种培养基上均能生长，生长速度为0.66～2.95mm/d，其中在棉籽壳培养基和棉籽壳+麦草培养基上生长速度最佳，分别为2.53mm/d和2.95mm/d，显著高于其他代料培养基，且菌丝体长势均较强。这完全可以满足开展生物学研究的要求，利用该方法培养的稠李蘑菇菌种也便于开展人工驯化栽培研究，为其奠定了技术基础。
附图说明：
图1本发明中温度和pH值对稠李蘑菇菌种生长速度的影响曲面图。
图2本发明中温度和湿度对稠李蘑菇菌种生长速度的影响曲面图。
图3本发明中pH值和湿度对稠李蘑菇菌种生长速度的影响曲面图。
图4本发明中温度和pH值对稠李蘑菇菌种菌丝长势的影响曲面图。
图5本发明中温度和湿度对稠李蘑菇菌种菌丝长势的影响曲面图。
图6本发明中pH值和湿度对稠李蘑菇菌种菌丝长势的影响曲面图。
具体实施方式：
下面举实施例说明本发明，但是本发明并不限于下述的实施例。
一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法，本发明选用的马铃薯、葡萄糖、棉籽壳粉、琼脂粉、麦草粉、蒸馏水，均可通过公共渠道购买，工艺中所采用的设备和仪器均为本领域常见的设备。
实施例1：一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法
本发明具体一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法，包括以下步骤：
(1)培养基的制作：先将马铃薯去皮、切成厚度为0.8cm左右的片，加1200ml水煮沸35min，过滤取汁。然后在此滤液中加入葡萄糖、棉籽壳粉和琼脂粉，小火煮至琼脂溶解，定容至1000ml。培养基中按照重量分数计，加入马铃薯200g，葡萄糖20g，棉籽壳粉50g，琼脂粉20g，蒸馏水1000ml。将已制备好的培养基趁热分装于试管内，每支10ml，用硅胶塞塞紧试管口，按每10支为一捆，用防潮纸包紧有硅胶塞的一端，放入高压灭菌锅内灭菌，压力1.2kg/cm2，温度118℃，时间30min，取出试管摆斜面，凝固后为母种PDA+棉籽壳粉斜面培养基；
(2)在野生稠李蘑菇分布区采集其幼嫩子实体，以未开伞为宜，用报纸或透气袋包裹子实体；
(3)用刷子将子实体表面杂质清理干净，在无菌条件下，用75％酒精仔细擦拭子实体表面进行消毒，在无菌条件下，将子实体掰开，用灼烧杀菌的镊子或手术刀在掰开的新鲜子实体截面上取黄豆粒大小的组织，然后接种至PDA+棉籽壳粉斜面培养基上，盖好试管塞；
(4)将接种好的菌种放置于28℃生化培养箱暗培养，待菌丝体长好后，取生长快，无杂菌污染的菌丝块再次移入另一斜面培养基表面，25℃培养12d，菌丝长满斜面且无杂菌，即为野生稠李蘑菇菌种母种。
实施例2：一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法
本发明具体一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法，包括以下步骤：
(1)培养基的制作：先将马铃薯去皮、切成厚度为0.8cm左右的片，加1200ml水煮沸35min，过滤取汁。然后在此滤液中加入葡萄糖、麦草粉和琼脂粉，小火煮至琼脂溶解，定容至1000ml。培养基中按照重量分数计，加入马铃薯200g，葡萄糖20g，麦草粉50g，琼脂粉20g，蒸馏水1000ml。将已制备好的培养基趁热分装于试管内，每支10ml，用硅胶塞塞紧试管口，按每10支为一捆，用防潮纸包紧有硅胶塞的一端，放入高压灭菌锅内灭菌，压力1.2kg/cm2，温度118℃，时间30min，取出试管摆斜面，凝固后为母种PDA+麦草粉斜面培养基；
(2)在野生稠李蘑菇分布区采集其幼嫩子实体，以未开伞为宜，用报纸或透气袋包裹子实体；
(3)用刷子将子实体表面杂质清理干净，在无菌条件下，用75％酒精仔细擦拭子实体表面进行消毒，在无菌条件下，将子实体掰开，用灼烧杀菌的镊子或手术刀在掰开的新鲜子实体截面上取黄豆粒大小的组织，然后接种至PDA+棉籽壳粉斜面培养基上，盖好试管塞；
(4)将接种好的菌种放置于28℃生化培养箱暗培养，待菌丝体长好后，取生长快，无杂菌污染的菌丝块再次移入另一斜面培养基表面，25℃培养12d、菌丝长满斜面且无杂菌，即为野生稠李蘑菇菌种母种。
实施例3：一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法
本发明具体一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法，包括以下步骤：
(1)培养基的制作：先将马铃薯去皮、切成厚度为0.8cm左右的片，加1200ml水煮沸35min，过滤取汁。然后在此滤液中加入葡萄糖、麦草粉和琼脂粉，小火煮至琼脂溶解，定容至1000ml。在此滤液中按照重量分数计，加入马铃薯240g，葡萄糖15g，棉籽壳粉70g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，其中棉籽壳粉可用麦草粉替换。将已制备好的培养基趁热分装于试管内，每支10ml，用硅胶塞塞紧试管口，按每10支为一捆，用防潮纸包紧有硅胶塞的一端，放入高压灭菌锅内灭菌，压力1.2kg/cm2，温度118℃，时间30min，取出试管摆斜面，凝固后为母种PDA+麦草粉斜面培养基；
(2)在野生稠李蘑菇分布区采集其幼嫩子实体，以未开伞为宜，用报纸或透气袋包裹子实体；
(3)用刷子将子实体表面杂质清理干净，在无菌条件下，用75％酒精仔细擦拭子实体表面进行消毒，在无菌条件下，将子实体掰开，用灼烧杀菌的镊子或手术刀在掰开的新鲜子实体截面上取黄豆粒大小的组织，然后接种至PDA+棉籽壳粉斜面培养基上，盖好试管塞；
(4)将接种好的菌种放置于28℃生化培养箱暗培养，待菌丝体长好后，取生长快，无杂菌污染的菌丝块再次移入另一斜面培养基表面，25℃培养12d、菌丝长满斜面且无杂菌，即为野生稠李蘑菇菌种母种。
实施例4：一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法
本发明具体一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法，包括以下步骤：
培养基的制作：先将马铃薯去皮、切成厚度为0.8cm左右的片，加1200ml水煮沸35min，过滤取汁。然后在此滤液中加入葡萄糖、棉籽壳粉和琼脂粉，小火煮至琼脂溶解，定容至1200ml。在此滤液中按照重量分数计，加入马铃薯160g，葡萄糖25g，棉籽壳粉50g，琼脂粉25g，蒸馏水1200ml，其中棉籽壳粉可用麦草粉替换。将已制备好的培养基趁热分装于试管内，每支10ml，用硅胶塞塞紧试管口，按每10支为一捆，用防潮纸包紧有硅胶塞的一端，放入高压灭菌锅内灭菌，压力1.2kg/cm2，温度118℃，时间30min，取出试管摆斜面，凝固后为母种PDA+棉籽壳粉斜面培养基。
(2)在野生稠李蘑菇分布区采集其幼嫩子实体，以未开伞为宜，用报纸或透气袋包裹子实体；
(3)用刷子将子实体表面杂质清理干净，在无菌条件下，用75％酒精仔细擦拭子实体表面进行消毒，在无菌条件下，将子实体掰开，用灼烧杀菌的镊子或手术刀在掰开的新鲜子实体截面上取黄豆粒大小的组织，然后接种至PDA+棉籽壳粉斜面培养基上，盖好试管塞；
(4)将接种好的菌种放置于28℃生化培养箱暗培养，待菌丝体长好后，取生长快，无杂菌污染的菌丝块再次移入另一斜面培养基表面，25℃培养12d、菌丝长满斜面且无杂菌，即为野生稠李蘑菇菌种母种。
实施例5：一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法
本发明具体一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法，包括以下步骤：
(1)培养基的制作：先将马铃薯去皮、切成厚度为0.8cm左右的片，加1200ml水煮沸35min，过滤取汁。然后在此滤液中加入葡萄糖、麦草粉和琼脂粉，小火煮至琼脂溶解，定容至1000ml。在此滤液中按照重量分数计，加入马铃薯200g，葡萄糖20g，棉籽壳粉30g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，其中棉籽壳粉可用麦草粉替换。将已制备好的培养基趁热分装于试管内，每支10ml，用硅胶塞塞紧试管口，按每10支为一捆，用防潮纸包紧有硅胶塞的一端，放入高压灭菌锅内灭菌，压力1.2kg/cm2，温度118℃，时间30min，取出试管摆斜面，凝固后为母种PDA+麦草粉斜面培养基。
(2)在野生稠李蘑菇分布区采集其幼嫩子实体，以未开伞为宜，用报纸或透气袋包裹子实体；
(3)用刷子将子实体表面杂质清理干净，在无菌条件下，用75％酒精仔细擦拭子实体表面进行消毒，在无菌条件下，将子实体掰开，用灼烧杀菌的镊子或手术刀在掰开的新鲜子实体截面上取黄豆粒大小的组织，然后接种至PDA+棉籽壳粉斜面培养基上，盖好试管塞；
(4)将接种好的菌种放置于28℃生化培养箱暗培养，待菌丝体长好后，取生长快，无杂菌污染的菌丝块再次移入另一斜面培养基表面，25℃培养12d、菌丝长满斜面且无杂菌，即为野生稠李蘑菇菌种母种。
实施例6：一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法
本发明具体一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法，包括以下步骤：
培养基的制作：先将马铃薯去皮、切成厚度为0.8cm左右的片，加1200ml水煮沸35min，过滤取汁。然后在此滤液中加入葡萄糖、棉籽壳粉和琼脂粉，小火煮至琼脂溶解，定容至1300ml。在此滤液中按照重量分数计，加入马铃薯220g，葡萄糖15g，棉籽壳粉50g，琼脂粉25g，蒸馏水1300ml。将已制备好的培养基趁热分装于试管内，每支10ml，用硅胶塞塞紧试管口，按每10支为一捆，用防潮纸包紧有硅胶塞的一端，放入高压灭菌锅内灭菌，压力1.2kg/cm2，温度118℃，时间30min，取出试管摆斜面，凝固后为母种PDA+棉籽壳粉斜面培养基。
(2)在野生稠李蘑菇分布区采集其幼嫩子实体，以未开伞为宜，用报纸或透气袋包裹子实体；
(3)用刷子将子实体表面杂质清理干净，在无菌条件下，用75％酒精仔细擦拭子实体表面进行消毒，在无菌条件下，将子实体掰开，用灼烧杀菌的镊子或手术刀在掰开的新鲜子实体截面上取黄豆粒大小的组织，然后接种至PDA+棉籽壳粉斜面培养基上，盖好试管塞；
(4)将接种好的菌种放置于28℃生化培养箱暗培养，待菌丝体长好后，取生长快，无杂菌污染的菌丝块再次移入另一斜面培养基表面，25℃培养12d、菌丝长满斜面且无杂菌，即为野生稠李蘑菇菌种母种。
实施例7：一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法
本发明具体一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法，包括以下步骤：
(1)培养基的制作：先将马铃薯去皮、切成厚度为0.8cm左右的片，加1200ml水煮沸35min，过滤取汁。然后在此滤液中加入葡萄糖、棉籽壳粉和琼脂粉，小火煮至琼脂溶解，定容至1000ml。在此滤液中按照重量分数计，加入马铃薯180g，葡萄糖20g，棉籽壳粉50g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml。将已制备好的培养基趁热分装于试管内，每支10ml，用硅胶塞塞紧试管口，按每10支为一捆，用防潮纸包紧有硅胶塞的一端，放入高压灭菌锅内灭菌，压力1.2kg/cm2，温度118℃，时间30min，取出试管摆斜面，凝固后为母种PDA+棉籽壳粉斜面培养基。
(2)在野生稠李蘑菇分布区采集其幼嫩子实体，以未开伞为宜，用报纸或透气袋包裹子实体；
(3)用刷子将子实体表面杂质清理干净，在无菌条件下，用75％酒精仔细擦拭子实体表面进行消毒，在无菌条件下，将子实体掰开，用灼烧杀菌的镊子或手术刀在掰开的新鲜子实体截面上取黄豆粒大小的组织，然后接种至PDA+棉籽壳粉斜面培养基上，盖好试管塞；
(4)将接种好的菌种放置于28℃生化培养箱暗培养，待菌丝体长好后，取生长快，无杂菌污染的菌丝块再次移入另一斜面培养基表面，25℃培养12d、菌丝长满斜面且无杂菌，即为野生稠李蘑菇菌种母种。
实施例8：一种野生稠李蘑菇菌株分离培养方法的优化
采用Box－Behnken试验设计，以实施例一PDA+棉籽壳粉培养基的配方为基础，通过菌丝体培养实验，探究稠李蘑菇菌丝生长温度(A)、pH值(B)和湿度(C)对稠李蘑菇菌丝生长速度和长势(1表示长势弱，2表示长势一般，3表示长势强)的影响，并建立稠李蘑菇菌丝生长条件与菌丝生长的响应面数学模型，响应面试验因素与水平表见表1，Box-bohnken试验设计与结果见表2。
表1：响应面试验因素水平表
因素 单位 最小值 最大值
温度 ℃ 15 35
pH值 h 4 9
湿度 ％ 70 90
表2：Box-bohnken实验设计结果
Figure BDA0002492428440000121
Figure BDA0002492428440000131
通过DesignExpert8.0.6对表2的实验数据进行拟合，得到采用实施例一培养基配方不同培养条件下分离培养野生稠李蘑菇菌株对应的菌丝生长速度和菌丝长势的试验结果，最终得出采用实施例一野生稠李蘑菇菌种分离培养方法最佳，探究稠李蘑菇菌丝生长温度、pH值和湿度对稠李蘑菇菌丝生长速度和长势的影响模型，模型中各因素交互作用的响应面参见附图1至附图6。
由Box－Behnken试验优化出本发明配方中的最佳稠李蘑菇菌种分离培养条件是实施例一中所用到制备工艺参数，即使用稠李蘑菇菌丝生长温度25℃、pH＝6和相对湿度80％。采用上述优化参数进行了3次平行实验，得到稠李蘑菇菌种菌丝生长速度和长势最佳，平均生长速度达到3.19mm/d。
实施例9：本发明稠李蘑菇菌株分离培养方法与普通培养基培养效果对比
(1)本发明稠李蘑菇母种培养基与普通培养基培养效果对比
本实施例在实施例一至实施例七培养配方及菌丝培养条件的基础上，以PDA培养基为基础培养基，共设置了8个新型稠李蘑菇母种培养基配方如附表3所示，通过菌丝体培养实验，对比分析了菌丝体在各培养基上的生长速度和菌丝长势情况，同时设置普通普通马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)与实施例进行对比，试验结果如表3所示。
表3稠李蘑菇母种培养基配方
Figure BDA0002492428440000141
表4稠李蘑菇菌丝体培养比较实验
序号 培养基名称 生长速度(mm/d) 菌丝长势
1 PDA 1.38c +
2 PDA+草原土 2.35b +++
3 PDA+棉籽壳粉 2.86a +++
4 PDA+小麦粉 2.21bc ++
5 PDA+木屑粉 2.32b +++
6 PDA+大豆粉 2.27b ++
7 PDA+麦草粉 3.08a +++
8 PDA+普通土 2.15bc +
注：1.生长速度后面的小写字母代表显著性差异(P＝0.05)；2.菌丝长势：“+”弱，“++”一般，“+++”强；
以PDA培养基为基础培养基(作为对照)，设置8个新型培养基配方(附表3)，通过菌丝体培养实验，对比分析了菌丝体在各培养基上的生长速度和菌丝长势情况，结果显示如附表4。
在菌丝体生长速度方面，稠李蘑菇菌丝体在PDA培养基上的生长速度为1.38mm/d，在7种新型培养基上生长速度为2.15～3.08mm/d，均高于对照组，其中在PDA+棉籽壳粉培养基和PDA+麦草粉培养基上，菌丝体生长速度最佳，分别为2.86mm/d和3.08mm/d，显著高于其他种类培养基。
在菌丝长势方面，稠李蘑菇菌丝体在PDA培养基上的长势最弱，在PDA+草原土培养基、PDA+棉籽壳粉培养基、PDA+木屑粉培养基和PDA+麦草粉培养基上长势均较强。
(2)稠李蘑菇代料培养基筛选
以棉籽壳培养基为基础培养基，共设置了9个新型培养基配方(表5)，通过菌丝体培养实验，对比分析了菌丝体在各培养基上的生长速度和菌丝长势情况，其及结果如表6所示。
表5稠李蘑菇母种培养基配方
Figure BDA0002492428440000151
表6稠李蘑菇代料培养基筛选实验
Figure BDA0002492428440000152
Figure BDA0002492428440000161
注：1.生长速度后面的小写字母代表显著性差异(P＝0.05)；2.菌丝长势：“+”弱，“++”一般，“+++”强；
由附表6数据可知，以棉籽壳培养基为基础培养基，稠李蘑菇菌丝在代料培养基上，稠李蘑菇菌丝体除了在木屑培养基上无法生长外，在其他8种培养基上均能生长，生长速度为0.66～2.95mm/d，其中在棉籽壳培养基和棉籽壳+麦草培养基上生长速度最佳，分别为2.53mm/d和2.95mm/d，显著高于其他处理；在菌丝长势方面，稠李蘑菇菌丝体在棉籽壳培养基、棉籽壳+麦草培养基和棉籽壳+大豆粉培养基上的长势均较强，在其他培养基上长势均较弱或一般。适宜野生稠李蘑菇生长的代料培养基配方有2个，分别为：棉籽壳培养基：棉籽壳100g，蛋白胨1.4g，水140g；棉籽壳+麦草培养基：麦草100g，蛋白胨1.4g，水140g。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (3)

1.一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法，其特征在于，所述的野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法包括如下步骤：
（1）按照下述配方制备培养基，按照重量分数计，培养基包括：马铃薯160-240g，葡萄糖15-25 g，棉籽壳粉30-70 g，琼脂粉 15-25g，蒸馏水800-1500mL，所述培养基用棉籽壳粉可换为麦草粉；
（2）在野生稠李蘑菇分布区采集其幼嫩子实体，以未开伞为宜，用报纸或透气袋包裹子实体；
（3）用刷子将子实体表面杂质清理干净，在无菌条件下，用75%酒精仔细擦拭子实体表面进行消毒；
（4）在无菌条件下，将子实体掰开，用灼烧杀菌的镊子或手术刀在掰开的新鲜子实体截面上取黄豆粒大小的组织，然后接种至PDA斜面培养基上，盖好试管塞；
（5）将接种好的菌种放置于25℃生化培养箱暗培养，待菌丝体长好后保藏备用。
2.根据权利要求1所述的一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法，其特征在于，所述步骤（1）中培养基，按照重量分数计，培养基包括马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，棉籽壳粉 50g，琼脂粉 20 g，蒸馏水 1000 mL，所述培养基用棉籽壳粉可换为麦草粉。
3.根据权利要求1所述的一种野生稠李蘑菇菌株的分离培养方法，其特征在于，所述步骤（1）中培养基的制作方法是：先将马铃薯去皮、切成厚度为0.5-1cm左右的片，加1000-1500ml水煮沸30-40min，过滤取汁；在此滤液中加入一定比例的葡萄糖、棉籽壳粉、琼脂粉，小火煮至琼脂溶解，定容至1000ml；将已制备好的培养基趁热分装于使馆内，每支10ml，用硅胶塞塞紧试管口，按每支试管为一捆，用防潮纸包紧有硅胶塞的一端，放入高压灭菌锅内灭菌，压力1.2-1.5kg/cm2，温度115-121℃，时间30-40min，取出试管摆斜面，凝固后为母种培养基。
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