CN111624334A - 一种利用血浆外泌体检测ad生物标志物的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法及其应用，包括如下步骤：S1，血浆外泌体提取:从‑80℃取出血浆放在4℃温度中溶化,然后取出250μl血浆于无菌离心管，离心去除细胞和细胞碎片,转移上清液于无菌离心管中，加入63μl外泌体沉淀剂进行混匀，放置于4℃温度里30min，然后离心至外泌体为圆饼状贴在管底，吸去上清液，然后将剩余的液体重新1500×g离心5min，吸去瓶里所有液体，不要碰到瓶底的外泌体；S2，酶联免疫吸附实验；S3，拍摄电镜照片：S4，NTA实验。本发明，通过血浆外泌体的提取，采用ELISA的方法定量检测血浆外泌体中的目的病理蛋白。

Description

一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法及其应用

技术领域

本发明涉及外泌体检测技术领域，具体为一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法及其应用。

背景技术

外泌体是一种纳米大小的小囊泡,被体内大多数细胞类型分泌,因为外泌体可以从循环体液中提取出来,他们可以作为神经疾病状态的一个潜在生物标记物.外泌体已经被证明可以在细胞间传播毒性Aβ(β-淀粉样蛋白)和高度磷酸化的tau蛋白，在阿尔茨海默病(Alzheimer disease，以下简称为AD)中导致神经元的丢失。同时，在电镜和NTA下，可以看到与年龄匹配的正常人相比，AD血浆来源的神经元外泌体的形态和数量将会发生变化。在这篇文章中，我们主要用ELISA的方法来检测AD病人和年龄匹配的正常人血浆来源的神经外泌体中Total tau,P-S396-tau和β-amyloid1-42(Aβ1-42)水平的变化，以及在TEM和NTA下外泌体形态和数量的变化。我们发现AD病人血浆来源的神经元外泌体中Total tau,P-S396-tau和Aβ1-42水平均高于年龄匹配的正常人，除此之外，与正常人相比，来源于AD病人的外泌体较小，数量较少。这些在AD病人中血浆来源的神经元外泌体中病理蛋白的变化，以及外泌体形态和数量的变化将可能为AD的早期诊断提供基础。

介绍

AD是最常见的痴呆形式，临床表现为记忆力下降和认知功能的减退，尽管在60岁以下发病率比较小，但是在最近几年有明显的年轻化的趋势,而且发病率随着年龄的增加而增加,影响了超过40％的85岁以上的人群,且没有方法可以治疗或者逆转这个疾病.AD最重要的病理标记是细胞外的淀粉样沉积和细胞内的神经原纤维缠结，分别由淀粉样前体蛋白裂解产物Aβ和微管相关蛋白tau组成。AD的诊断过去依赖模糊的临床诊断或者建立在尸检的基础上。随着科学技术的发展，我们现在可以通过脑脊液检查和PET(正电子断层发射扫描)检查来确立诊断。早在1999年，Andreasen,N.,et al.等人就提出，在人群中脑脊液来源的Aβ1-42的生物变异性很低，在作为诊断AD的生物标记物时具有很强的敏感性，暗示脑脊液来源的Aβ1-42在临床诊断AD中，尤其是早期诊断AD中是非常有价值的生物标记物。但是也存在一些问题，比如，AD病人通常伴随着严重的精神行为异常，这意味着腰穿对他们来讲是非常困难的，PET检查是昂贵的，将会给病人及家属带来更加沉重的经济负担，所以这两个检查都不能广泛用于临床，导致相当一部分AD的临床诊断依旧依赖于临床症状和磁共振检查。需要引起我们关注的是，通过临床症状和物理检查确立的诊断很可能是误诊的，而且大部分人在被发现的时候已经处于晚期阶段，没有药物可以逆转。毫无疑问他们的预后是不令人满意的，所以发现一些创伤小甚至是无创伤的，价格低的能早期诊断AD的新方法就显得格外重要。因为血液比脑脊液更已接近，血液标记物在临床诊断和筛查过程中更具吸引力。然而，由于大脑与外周血之间大脑屏障的存在，只有一小部分大脑中的蛋白质可以进入外周血，因此这部分蛋白质会被较大程度地稀释，而且因为没有膜的保护，他们更容易被酶裂解或者被肝脏清除，导致血液的生物标记物不能像脑脊液一样很好地预测脑中蛋白的变化。这些因素限制了血液样本作为AD潜在的生物标记物来源。但是最近，越来越多关于外泌体的研究让我们看到了希望。

外泌体是体内大多数细胞分泌的纳米级的小囊泡，可存在于体液中，包括血液，唾液，尿液，脑脊液和乳汁中。神经来源外泌体有其独特的神经特异表面标记物，这使得其能在循环体液中特异地检测出来。外泌体在细胞中的作用在过去几年认为的是细胞垃圾站，现在已经被证明是重要的细胞间信号分子，以及健康和疾病的重要贡献者。

细胞膜内陷形成小的细胞内小泡，逐渐成熟融合形成多泡体，多泡体向内出芽形成腔内小泡。多泡体与溶酶体融合导致其内容物的裂解，与细胞膜融合导致外泌体被释放到细胞外空间。因为外泌体可以自由地穿过血脑屏障，神经元来源的外泌体可以直接反映大脑环境的变化。外泌体内容物包括核酸，蛋白质和脂质，在疾病状态下会发生变化，而且他们的膜可以保护其内容物不被降解。他们可以传播病理性蛋白质，也可以被浓缩来提高检测的敏感性。这些特征使得外泌体成为一个有价值的诊断工具。外泌体已经被证明是在AD中一种联系Aβ和tau分泌与毒性和神经原纤维缠结的多细胞机制。过去的研究已经证明外泌体中P-tau和Aβ的水平在疾病出现临床症状之前很长时间预测到AD的发展。

AD的病理特征之一是大脑实质中毒性Aβ的积累。在β分泌酶切割后，外泌体从早期内体接收APP(β-淀粉样前体蛋白)，由外泌体中的γ分泌酶产生Aβ肽片断。一部分Aβ聚集形成高度不溶的淀粉样斑块，最重要的是Aβ1-42，因为它比其他短的Aβ片断更疏水，更易积累在大脑里。APP正常的非淀粉样转运包括在细胞膜上α分泌酶的切割，留下跨膜的C-末端片断(CTFα)。CTFα被进一步吞噬和转运到早期内体。

到现在为止，外泌体主要通过生物技术来研究，因为它的尺寸太小，所以这是非常有挑战性的。在这篇文章中，我们主要用电镜和一种比较新的技术：NTA(纳米颗粒追踪分析)的方法来观察血浆来源神经外泌体的形态和数量特征。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法，包括如下步骤：

S1，血浆外泌体提取:从-80℃取出血浆放在4℃温度中溶化,然后取出250μl血浆于无菌离心管，离心去除细胞和细胞碎片,转移上清液于无菌离心管中，加入63μl外泌体沉淀剂进行混匀，放置于4℃温度里30min，然后离心至外泌体为圆饼状贴在管底，吸去上清液，然后将剩余的液体重新1500×g离心5min，吸去瓶里所有液体，不要碰到瓶底的外泌体；

S2，酶联免疫吸附实验：在从血浆提取出来的外泌体中加入300μlRIPA蛋白裂解液和3μlcocktail蛋白抑制剂，然后涡旋使沉淀重悬于溶液中，将溶液置于-80℃的温度5min，25℃水浴锅5min，如此重复3个循环，将溶液存放于-80℃的温度中，在需要的时候拿出来在4℃下进行溶化，采用酶联生物的人β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)/人Tau蛋白(Tau)/人磷酸化tau(Ps396-tau)酶联吸附免疫实验试剂盒，分别检测Aβ1-42、Tau、Ps396-tau，严格按照说明书进行实验，从试剂盒中的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃冰箱，设置标准品孔、样本孔和空白孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，样本孔中加入待测样本50μL，空白孔不加，除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃温育60min，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满试剂盒提供的洗涤缓冲液350μL，静置1min，甩去洗涤缓冲液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次，每孔加入50μL试剂盒中的底物A和B，37℃避光孵育15min，每孔加入试剂盒提供的终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值；

S3，拍摄电镜照片：将外泌体沉淀重悬于30μLPBS中，然后取出10μL并在90μLPBS中稀释，将3μL滴于电子显微镜中带有碳膜的铜网上，1分钟后，吸去多余的液体并滴入一滴磷钨酸染料溶液，1分钟后，再次吸走多余的液体，使样品风干，将完全干燥的铜网安装在Philips-FEI TecnaiTlO的TEM(FEI T12)下，然后拍照；

S4，NTA实验：将源自血浆的外泌体沉淀重悬于300uL PBS中，将所得混合物稀释100倍上机，NanoSight LM10(NanoSight Ltd.，Amesbury，United Kingdom)使用精细聚焦的激光束通过玻璃棱镜引入稀释100倍的样品中；

每个样本运行3次，每次捕获两个60s视频图像，每个实验中的所有分析设置都保持不变，从NTA获得的尺寸分布曲线，在视频重复中对每个样本取平均值，然后在样本之间取平均值以确定代表性的尺寸分布曲线。

优选的，所述步骤S1中的上清液转移、去除和吸去瓶里所有液体均是通过移液枪实现的。

优选的，所述去除细胞和细胞碎片的离心条件为3000×g速度下离心15min。

优选的，所述外泌体沉淀剂为ExoQuickTM SBI外泌体沉淀剂。

优选的，所述加入63μl外泌体沉淀剂进行混匀的方法为将无菌管进行颠倒和轻弹无菌管管壁。

优选的，所述步骤S1中的4℃温度和步骤S2中-80℃温度均是通过恒温冰箱实现的。

优选的，所述血浆外泌体的样本来源于医院，所述血浆外泌体的样本数量为16个，所述16个样本包括8个来源于神经内科门诊的病人样本和8个来源于体检中心的健康对照样本，所述16个样本的参与者均进行神经心理评估和APOE分型测试。

优选的，所述板条上设置标准品孔、样本孔和空白孔的数量分别为6个、7个和1个。

优选的，所述离心至外泌体为圆饼状贴在管底的条件为1500×g离心30min。

本发明所述的利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法在AD病人检测中应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明通过血浆外泌体的提取，采用ELISA的方法定量检测血浆外泌体中的目的病理蛋白；

2、本发明同时配合电镜和NTA，可以对血浆来源的外泌体进行粒径和形貌的鉴定；

3、本发明相比较于脑脊液检查和PET检查，具有无创，低廉，早期筛查等优点，可以广泛用于临床，为早期AD的诊断提供依据。

附图说明

图1为血浆来源神经外泌体的电镜照片；

图2为本发明的正常人和AD病人中血浆来源神经外泌体的总数量以及外泌体直径范围在30-100nm范围内的外泌体数量的柱状图；

图3为本发明的在正常人和AD中直径范围在30-100nm的血浆来源神经外泌体数量的柱状图；

图4为本发明的正常人和AD病人血浆来源神经外泌体在10分位，50分位，90分位的数量，n＝4AD,n＝4对照柱状图；

图5为本发明在正常人中血浆来源神经元外泌体的波峰图；

图6为本发明在AD病人中血浆来源神经元外泌体的波峰图；

图7为本发明正常人中血浆来源神经元外泌体的视频图像；

图8为本发明在AD病人中血浆来源神经元外泌体的视频图像；

图9为AD病人与年龄匹配的正常人血浆来源的神经元外泌体的病理蛋白的比较图；

图10为AD病人与年龄匹配的正常人血浆病理蛋白的比较图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-10，本发明提供一种技术方案：一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法，包括如下步骤：

S1，血浆外泌体提取:从-80℃取出血浆放在4℃温度中溶化,然后取出250μl血浆于无菌离心管，离心去除细胞和细胞碎片,转移上清液于无菌离心管中，加入63μl外泌体沉淀剂进行混匀，放置于4℃温度里30min，然后离心至外泌体为圆饼状贴在管底，吸去上清液，然后将剩余的液体重新1500×g离心5min，吸去瓶里所有液体，不要碰到瓶底的外泌体；

S2，酶联免疫吸附实验：在从血浆提取出来的外泌体中加入300μlRIPA蛋白裂解液(购于碧云天，编号P0013B)和3μlcocktail蛋白抑制剂(购于bimake，产品号B14001)，然后涡旋使沉淀重悬于溶液中，将溶液置于-80℃的温度5min，25℃水浴锅5min，如此重复3个循环，将溶液存放于-80℃的温度中，在需要的时候拿出来在4℃下进行溶化，采用酶联生物的人β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)/人Tau蛋白(Tau)/人磷酸化tau(Ps396-tau)酶联吸附免疫实验试剂盒，分别检测Aβ1-42、Tau、Ps396-tau。严格按照说明书进行实验，从试剂盒中的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃冰箱，设置标准品孔、样本孔和空白孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，样本孔中加入待测样本50μL，空白孔不加，除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃温育60min，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满试剂盒提供的洗涤缓冲液350μL，静置1min，甩去洗涤缓冲液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次，每孔加入50μL试剂盒中的底物A和B，37℃避光孵育15min，每孔加入试剂盒提供的终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值；

S3，拍摄电镜照片：将外泌体沉淀重悬于30μLPBS中，然后取出10μL并在90μLPBS中稀释，将3μL滴于电子显微镜中带有碳膜的铜网上，1分钟后，吸去多余的液体并滴入一滴磷钨酸染料溶液，1分钟后，再次吸走多余的液体，使样品风干，将完全干燥的铜网安装在Philips-FEI TecnaiTlO的TEM(FEI T12)下，然后拍照；

S4，NTA实验：将源自血浆的外泌体沉淀重悬于300uL PBS中，将所得混合物稀释100倍上机，NanoSight LM10(NanoSight Ltd.，Amesbury，United Kingdom)使用精细聚焦的激光束通过玻璃棱镜引入稀释100倍的样品中；

每个样本运行3次，每次捕获两个60s视频图像，每个实验中的所有分析设置都保持不变，从NTA获得的尺寸分布曲线，在视频重复中对每个样本取平均值，然后在样本之间取平均值以确定代表性的尺寸分布曲线。

具体的，步骤S1中的上清液转移、去除和吸去瓶里所有液体均是通过移液枪实现的。

具体的，去除细胞和细胞碎片的离心条件为3000×g速度下离心15mi n。

具体的，外泌体沉淀剂为ExoQuickTM SBI外泌体沉淀剂。

具体的，加入63μl外泌体沉淀剂进行混匀的方法为将无菌管进行颠倒和轻弹无菌管管壁。

具体的，步骤S1中的4℃温度和步骤S2中-80℃温度均是通过恒温冰箱实现的。

具体的，血浆外泌体的样本来源于医院，血浆外泌体的样本数量为16个，16个样本包括8个来源于神经内科门诊的病人样本和8个来源于体检中心的健康对照样本，16个样本的参与者均进行神经心理评估和APOE分型测试。

具体的，板条上设置标准品孔、样本孔和空白孔的数量分别为6个、7个和1个，在标准品孔中分别加入试剂盒中标准品1、标准品2、标准品3、标准品4、标准品5、标准品6。

具体的，离心至外泌体为圆饼状贴在管底的条件为1500×g离心30min。

本发明所述的利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法在AD病人检测中应用。

APOEε4位点是AD主要的基因风险因素。在之前的研究中进行PET检查评估皮脂淀粉样沉积的MCI病人，淀粉样沉积阳性的病例CSFAβ42较低，淀粉样沉积阴性的病例CSFAβ42水平正常，与ε4状态无关。拥有ε4基因位点的认知正常的老年人比不带此种基因变异型的认知正常的老年人CSFAβ42低，在年轻人中CSFAβ与APOEε4分型五相关性。说明在大脑存在淀粉样沉积的前提下，ε4分型对体液中Aβ的作用才能显现出来。相反，CSF tau的水平不依赖于ε4分型。本研究中所用的样本的APOE分型不包含ε4，所以暂不考虑其对病理蛋白的影响。

图1血浆来源神经外泌体的电镜照片：A，B：来自两个正常人血浆来源的神经外泌体在200nm下的电镜照片；C，D：来自两个AD病人血浆来源的神经外泌体在200nm下的电镜照片n＝2AD,n＝2对照。

根据TEM的结果，我们可以看出来自AD病人和正常对照的血浆神经来源的外泌体都是环形的。与年龄匹配的正常人相比，来自AD病人的外泌体相对比较聚集，尺寸相对较小，尽管具体的尺寸未准确测量。这些不同可以帮我们区分外泌体来自于AD病人或是正常对照(图1)。尽管之前的研究显示在准备TEM的过程中，外泌体可能已经皱缩，尺寸已经发生变化，用这种方法测量的外泌体尺寸较小，但在TEM下来自AD病人和正常人外泌体形态之间的差异仍然可以为AD的诊断提供一些依据。

由图7和图8可知，NTA结果显示了正常人血浆来源神经元外泌体(38.5-595.75nm)的直径范围要大于AD病人(28.5nm-559.75nm)。正常人血浆来源神经元外泌体的总数量(436807943±1360034908个)大于AD病人(2768912375±618061911.8个)，且具有统计学意义。细胞外囊泡基于他们的大小通常被分为3种类型：凋亡小体(500nm–3μm)，微管(100nm–1μm)和外泌体(30–100nm)，所以我们比较了30-100nm的外泌体的数量。AD病人血浆来源的神经元外泌体直径在30-100nm的外泌体数量(1592655928±287015079.5个)明显多于正常人(292330745±270811280.4个)，且结果具有统计学意义(Figure2)。对于直径在30-100nm的外泌体数量占外泌体总数的比例，AD病人直径在30-100nm的外泌体数量占外泌体总数的比例(0.498330399±0.003598078)明显大于正常人(0.100717521±0.111464267c)，且结果具有统计学意义(p＝0.003607<0.05)。AD病人血浆来源神经元外泌体的直径平均数(129.45±3.323401872nm)明显低于正常对照(186.475±12.68105542nm)，结果具有统计学意义(p＝0.0050544<0.05)。AD病人血浆来源神经元外泌体的直径众数(61.05±2.61629509nm)明显低于正常对照(121.175±52.98115231nm)，结果具有统计学意义(p＝0.077232656<0.1)(Figure3)。AD病人血浆来源神经元外泌体的直径的10分位(55.975±5.939696962nm)和50分位(100.1±1.414213562nm)数明显小于正常对照(97.875±30.78943271nm,170.25±12.62339099nm)，结果具有统计学意义，(p＝0.053179<0.05,p＝0.0045948<0.05)。AD病人外泌体直径的90分位数(253.4±10.74802307nm)有小于正常对照(292±22.71944835nm)的趋势，但结果不具有统计学意义(p＝0.1407317>0.1)(Figure4)。对于检测的外泌体的总蛋白来讲，AD病人外泌体的蛋白总量(23.05±2.61629509g/ul)小于正常人(30.5±6.257795139g/ul)，结果不具有统计学意义(p＝0.14046>0.05)。结合之前提到的外泌体的数量，AD病人外泌体中蛋白质的聚集是不能排除的。

因此，总的来说，AD病人血浆来源神经外泌体数量小于正常人，且AD来源的外泌体尺寸总体上小于正常人。与年龄匹配的正常人相比，AD病人血浆来源的神经元外泌体中总蛋白的量与正常人之间无统计学意义。AD病人血浆来源神经外泌体直径范围小于正常人，直径在30-100nm的外泌体数量明显多于正常人，且结果具有统计学意义。

同时，观察以血浆来源神经元外泌体直径为横坐标，数量为纵坐标绘制的波峰图，可以看出，AD病人外泌体的图像一般只有一个峰，且峰出现得比较早，然而正常人外泌体图像一般是多峰的，且第一个峰出现得比较晚，预示着AD病人血浆来源神经元外泌体直径较小且相对集中，正常人外泌体的直径较大，且分布比较广，大直径可能集中在几个特定的范围.正如我们从NTA视频图上看到的那样，正常人来源的外泌体比AD病人来源外泌体运动更快，且外泌体更加饱满。这些不同对诊断AD是有意义的。

由图10可知，在总体上AD病人血浆病理蛋白Total Tau,P-S396-Tau和Aβ1-42的含量水平高与年龄相近的正常人(p＝0.862144>0.1,p＝0.563601>0.1,p＝0.63585>0.1,n＝5AD,n＝5control)。

我们用ELISA试剂盒来定量测量血浆来源神经元外泌体的病理蛋白，Total Tau,P-S396-Tau和Aβ1-42的水平。结果显示与年龄匹配的正常人相比，AD病人血浆来源神经元外泌体中Total Tau,P-S396-Tau和Aβ1-42的水平明显高于正常人，且结果具有统计学意义(p＝0.048654<0.05,p＝0.004038<0.05,p＝0.052742<0.05,n＝20AD,n＝20control)。因此可能表明AD病人血浆来源的神经元外泌体中可能存在这些病理蛋白的聚集。同时，我们也可以直接测量AD病人血浆中这些病理蛋白的水平。AD病人血浆中Total Tau,P-S396-Tau和Aβ1-42的水平高于正常人，但是结果不具有统计学意义(p＝0.862144>0.1,p＝0.563601>0.1,p＝0.63585>0.1,n＝5AD,n＝5control)(Figure6)。此外，可以看出在AD病人和年龄匹配的正常人中，血浆中病理蛋白的水平高于血浆来源神经元外泌体中蛋白的浓度，说明这些病理蛋白除了通过外泌体途径从大脑转移到外周血之外，还可能存在一些其它的方式，例如，通过转运蛋白和一些我们尚不知道方式。过去的研究已经表明，以后转化为AD的轻度认知功障碍患者可通过脑脊液中Aβ1-42的升高和tau的降低来辨认。这些研究暗示，脑脊液中Aβ1-42和tau在检测AD的早期阶段是有价值的。此外，AD两大病理特征之一是Aβ沉积形成的老年斑。之前的研究已经表明，Aβ1-42的外泌体水平从临床前的较高水平到诊断AD是的更高水平，预示着外泌体中Aβ1-42的水平作为一个生物标记物是有价值的,且具有比较好的特异性。Tau是一种微管相关蛋白，tau病变包含20余种疾病，包括AD，进行性核上性麻痹，额颞叶痴呆和帕金森病相关染色体17(FTDP-17)，其特征在于丝状tau的细胞内积累。因此，尽管tau水平在疾病中的变化比较大，有较高的敏感性，但特异性不太好，所以单独使用时不能作为诊断AD的生物标记物。然而，这三种蛋白质的联合可以很大地提高AD诊断的敏感性和特异性。

AD是以认知下降为特征，通常诊断是建立在临床特征和MRI的基础上，因此药物干预通常作用于中枢神经系统大量神经元死亡之后。迫切地需要预测性的生物标记物。大多数神经退行性疾病是以细胞内或者细胞外蛋白质积聚为特征的，其中一个就是AD。神经退行性疾病特征是潜伏期比较长，明显的神经症状之前神经病理学和神经退行性变化就已出现。Andreasen,N.,等人首先提出AD病人中CSF-Aβ1-42的水平低于年龄匹配的正常人，在轻度痴呆患者中也是一样。后来也提到Aβ蛋白病的触发在痴呆之前15年或者更长的时间，从临床前阶段到具有阈值可检测的淀粉样蛋白沉积和CSF P-tau蛋白异常升高的临床表观AD的进展时间估计长达17年。这些研究均提示Aβ和tau水平作为早期诊断AD生物标记物的重要价值。本研究显示血浆来源的神经元外泌体中病理蛋白Total Tau,P-S396-Tau和Aβ1-42的水平高于年龄匹配的正常人，且结果具有显著地统计学意义，方法也相对简单易行，敏感性和特异性较好，干扰因素较小。正如之前文献提到的那样，Total tau,P-S396-tau和Aβ1-42的外泌体水平在AD和AMCI之间无明显差异，暗示这些病理蛋白的外泌体水平的增加发生在临床过程的早期。他们从人的血浆中分离神经来源的外泌体，并证明在认知正常的患者中P-S396-Tau的水平已经升高，但在10年后发展成AD。他们观察到Aβ1-42的外泌体水平在临床前AD中升高，甚至比症状性AD更高。当然除此之外，还有一些其它的研究也提出了一些意见。例如，Aβ42被发现在AD的早期和中期升高，然后随着疾病的发展下降。相反，在AD的早期和中期，Aβ的水平下降。Aβ42/Aβ40的下降或者是Aβ40水平的上升与转换成AD相关。此外，Aβ42水平在抑郁组比年龄那个匹配的正常人显著升高，意味着Aβ42不仅在AD病人中增加，也在其它神经系统疾病中增加。将Aβ42原纤维注射到转基因小鼠的脑中导致杏仁核中从神经元投射到注射部位的NFT数量增加五倍，表明Aβ42原纤维可以加速体内NFT的形成。这些变化也有利于AD的诊断。

外泌体研究领域是一个新生的且迅速发展的领域，不断引起人们的关注。TEM和NTA用于测量外泌体的形态和大小分布。我们可以看到在AD和年龄匹配的正常人血浆来源的神经元外泌体都是环状的。与AD病人来源的外泌体相比，在电镜下正常人来源的外泌体是较分散和均一的，直径相对较大。AD病人中血浆来源神经元外泌体的数量明显小于正常对照，外泌体的大小整体上小于正常人。在NTA下，AD血浆来源的神经元外泌体的直径范围下于正常对照。

因为外泌体可以自由地穿过血脑屏障，所以外泌体可以被视为中枢神经系统状态的直接读数。此外，外泌体可以被浓缩，显著提高了检测的灵敏性。许多循环蛋白质和核酸在外周血中被稀释，并且由于BBB在分子运输中的严格调节，循环细胞因子，蛋白质或核酸的检测仅估计身体的整体炎症状态。除了蛋白质外，包含在外泌体中的各种RNA也可能是AD早期阶段的潜在的生物标记物。此外，血浆来源的外泌体的miRNA测序揭示了在AD病人与健康人之间miRNA的差异表达。

虽然在一些研究中外泌体似乎对神经退行性疾病有害，但越来越多的证据表明它们也具有可能在神经退行性疾病中发挥有用的作用。神经细胞中外泌体分泌的上调显着降低了Aβ的细胞外水平。Yuyama,Sun等人提出，上调神经元分泌的外泌体的分泌显著降低细胞外的Aβ的水平，etal的报告显示N2a来源的外泌体有中和Aβ造成的突出可塑性紊乱。

外泌体已经被证明有传播疾病和阻碍疾病的能力，可以作为AD早期诊断的生物标记物，但是外泌体的研究仍然处于初级阶段，然而我们相信外泌体最终会给患者带来益处。在将来，外泌体可能是治疗这种退行性疾病的钥匙。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法，其特征在于包括如下步骤：

S1，血浆外泌体提取:从-80℃取出血浆放在4℃温度中溶化,然后取出250μl血浆于无菌离心管，离心去除细胞和细胞碎片,转移上清液于无菌离心管中，加入63μl外泌体沉淀剂进行混匀，放置于4℃温度里30min，然后离心至外泌体为圆饼状贴在管底，吸去上清液，然后将剩余的液体重新1500×g离心5min，吸去瓶里所有液体，不要碰到瓶底的外泌体；

S2，酶联免疫吸附实验：在从血浆提取出来的外泌体中加入300μlRIPA蛋白裂解液和3μlcocktail蛋白抑制剂，然后涡旋使沉淀重悬于溶液中，将溶液置于-80℃的温度5min，25℃水浴锅5min，如此重复3个循环，将溶液存放于-80℃的温度中，在需要的时候拿出来在4℃下进行溶化，采用酶联生物的人β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)/人Tau蛋白(Tau)/人磷酸化tau(Ps396-tau)酶联吸附免疫实验试剂盒，分别检测Aβ1-42、Tau、Ps396-tau，严格按照说明书进行实验，从试剂盒中的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃冰箱，设置标准品孔、样本孔和空白孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，样本孔中加入待测样本50μL，空白孔不加，除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃温育60min，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满试剂盒提供的洗涤缓冲液350μL，静置1min，甩去洗涤缓冲液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次，每孔加入50μL试剂盒中的底物A和B，37℃避光孵育15min，每孔加入试剂盒提供的终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值；

S3，拍摄电镜照片：将外泌体沉淀重悬于30μLPBS中，然后取出10μL并在90μLPBS中稀释，将3μL滴于电子显微镜中带有碳膜的铜网上，1分钟后，吸去多余的液体并滴入一滴磷钨酸染料溶液，1分钟后，再次吸走多余的液体，使样品风干，将完全干燥的铜网安装在Philips-FEI TecnaiTlO的TEM下，然后拍照；

S4，NTA实验：将源自血浆的外泌体沉淀重悬于300uL PBS中，将所得混合物稀释100倍上机，NanoSight LM10使用精细聚焦的激光束通过玻璃棱镜引入稀释100倍的样品中；

每个样本运行3次，每次捕获两个60s视频图像，每个实验中的所有分析设置都保持不变，从NTA获得的尺寸分布曲线，在视频重复中对每个样本取平均值，然后在样本之间取平均值以确定代表性的尺寸分布曲线。

2.根据权利要求1所述的一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法，其特征在于：所述步骤S1中的上清液转移、吸去和吸去瓶里所有液体均是通过移液枪实现的。

3.根据权利要求2所述的一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法，其特征在于：所述去除细胞和细胞碎片的离心条件为3000×g速度下离心15min。

4.根据权利要求1所述的一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法，其特征在于：所述外泌体沉淀剂为ExoQuickTM SBI外泌体沉淀剂。

5.根据权利要求4所述的一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法，其特征在于：所述加入63μl外泌体沉淀剂进行混匀的方法为将无菌管进行颠倒和轻弹无菌管管壁。

6.根据权利要求3所述的一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法，其特征在于：所述步骤S1中的4℃温度和步骤S2中-80℃温度均是通过恒温冰箱实现的。

7.根据权利要求2所述的一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法，其特征在于：所述血浆外泌体的样本来源于医院，所述血浆外泌体的样本数量为16个，所述16个样本包括8个来源于神经内科门诊的病人样本和8个来源于体检中心的健康对照样本，所述16个样本的参与者均进行神经心理评估和APOE分型测试。

8.根据权利要求1所述的一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法，其特征在于：所述板条上设置标准品孔、样本孔和空白孔的数量分别为6 个、7个和1个。

9.根据权利要求1-8任一项所述的一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法在AD病人检测中的应用。

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