CN110187101A - 一种尿液外泌体elisa的检测方法及其应用 - Google Patents

一种尿液外泌体elisa的检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种外泌体检测的ELISA方法，还提供一种检测尿液外泌体的ELISA检测方法在阿尔茨海默病的评估和防治方面的应用。本方法具有可靠、快速、经济地无创检测外泌体的特点，本发明的检测方法也不需要昂贵且精密的实验仪器，具有很大的应用前景。

Description

一种尿液外泌体ELISA的检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种尿液外泌体ELISA的检测方法及其应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种中枢神经系统变性病，其特征性病理标记是细胞外的淀粉样沉积和细胞内的神经原纤维缠结，分别由淀粉样前体蛋白裂解产物Aβ和微管相关蛋白tau组成。临床上阿尔茨海默病患者主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、语言障碍等。
阿尔茨海默病的诊断过去依赖模糊的临床诊断或者建立在尸检的基础上，随着科学技术的发展，现在可以通过脑脊液检查和PET检查来确立诊断。由于阿尔茨海默病患者通常伴随着严重的精神行为异常，这意味着腰椎穿刺对他们来讲是非常困难的，此外PET检查价格比较昂贵，将会给病人及家属带来更加沉重的经济负担。所以这两个检查均不能广泛应用于临床，导致相当一部分阿尔茨海默病的临床诊断依旧依赖于临床症状和磁共振检查。但是通过临床症状和物理检查确立的诊断结果不够准确，而且大部分人在被发现的时候已经处于晚期阶段，没有药物可以逆转。
外泌体是体内大多数细胞分泌的纳米级的小囊泡，可存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液、乳汁等。神经来源外泌体有其独特的神经特异表面标记物，这使得其能在循环体液中特异地被检测出来。细胞膜内陷形成小的细胞内小泡，逐渐成熟融合形成多泡体，多泡体向内出芽形成腔内小泡。多泡体与溶酶体融合导致其内容物的裂解，与细胞膜融合导致外泌体被释放到细胞外空间。因为外泌体可以自由地穿过血脑屏障进入血液，然后经肾脏进入尿液，神经来源外泌体可以直接反映大脑环境的变化。由于外泌体内容物包括核酸、蛋白质、脂质，所以在疾病状态下外泌体的形态和数量会发生变化，而且它们的膜可以保护其内容物不被降解，因此，它们可以传播病理性蛋白质，也可以被浓缩来提高检测的敏感性，这些特征使得外泌体成为一个有价值的诊断工具。外泌体已经被证明可以在细胞间传播毒性Aβ和高度磷酸化的tau，在阿尔茨海默病中导致神经元的丢失。多年的研究表明外泌体中Aβ和tau的水平在疾病出现临床症状之前很长时间能够预测到阿尔茨海默病的发展。
因此，发展一种能够可靠、快速、经济地无创检测外泌体尤其是阿尔茨海默病患者来源的外泌体的方法非常必要。
发明内容
针对背景技术中存在的问题，本发明提供了一种尿液外泌体ELISA的检测方法及其应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种尿液外泌体ELISA的检测方法，包括如下具体步骤：
(1)收集健康志愿者/阿尔茨海默病患者尿液样本，并将其存放于超低温冰箱里，保存备用；
(2)从超低温冰箱里取出健康志愿者/阿尔茨海默病患者尿液样本，在2-6℃条件下解冻，然后将尿液样本分别转移到试管中，离心，去除细胞和细胞碎片，将上清液分别转移到无菌试管中；
(3)在步骤(2)的上清液中各加入经Exo Quick提取的外泌体沉淀，通过反转或轻弹试管使其混合均匀，在低温冰箱中冷藏过夜，离心，吸取上清液，再次离心，去除所有的上清液，注意吸取上清液的过程中不要触碰到试管底部的白色外泌体沉淀；
(4)在步骤(3)的白色外泌体沉淀中加入蛋白裂解液和蛋白抑制剂，涡旋，将沉淀重悬于溶液中，将溶液置于超低温冰箱里放置5min，然后置于25℃水浴锅中5min，如此重复数次，将溶液存放于超低温冰箱里，在需要的时候拿出来溶化；
(5)从在室温条件下平衡后的铝箔袋中取出所需板条，在板条上设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品，样本孔中加入待测样本，标准品孔和样本孔中分别加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体，用封板膜封住标准品孔和样本孔，置于水浴锅或恒温箱中温育一定时间后，弃去液体，吸水纸上拍干，在标准品孔和样本孔中加满洗涤液，静置，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗涤板条数次；
(6)在步骤(5)中的标准品孔和样本孔中分别加入健康志愿者尿液来源的外泌体、阿尔茨海默病患者尿液来源的外泌体，避光孵育一定时间后，在标准品孔和样本孔中均加入终止液，15min内在450nm波长处测定各孔的OD值，对尿液来源的神经元外泌体中的3种蛋白质进行检测，包括Aβ42、P-S396-Tau、Aβ1-42，除了所用的检测试剂不同，检测步骤均相同。
作为本发明一种优选的技术方案，所述超低温冰箱的温度为-80℃，所述低温冰箱的温度为-4℃。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤(2)中离心力为3000×g，离心时间为15minutes。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤(3)中第一次离心的离心力为1500×g，离心时间为30minutes；第二次离心的离心力为1500×g，离心时间为5minutes。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤(4)中涡旋时间为15s。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤(4)中重复3个循环。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤(5)中在37℃水浴锅或恒温箱中温育60minutes。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤(5)中重复洗涤板条5次。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤(6)中孵育温度为37℃，孵育时间为15minutes。
一种检测尿液外泌体的ELISA检测方法在阿尔茨海默病的评估和防治方面的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的检测对象是从人体中排出的尿液，容易获得，而且不会对人体造成任何负担和创伤，本发明的检测方法也不需要昂贵且精密的实验仪器，具有很大的应用前景，可用于检测阿尔茨海默病患者尿液样本中外泌体的含量，本方法具有高度特异性的特点。
附图说明
图1为健康志愿者/阿尔茨海默病患者尿液来源外泌体的透射电子显微镜照片；
图2为健康志愿者/阿尔茨海默病患者尿液来源外泌体的纳米颗粒跟踪分析图；
图3为健康志愿者/阿尔茨海默病患者尿液来源外泌体的粒径测量结果；
图4为健康志愿者/阿尔茨海默病患者尿液来源外泌体的纳米颗粒跟踪分析视频图片；
图5为健康志愿者/阿尔茨海默病患者尿液来源外泌体的病理蛋白分析图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
实施例：
本发明提供一种尿液外泌体ELISA的检测方法，包括如下具体步骤：
(1)收集健康志愿者/阿尔茨海默病患者尿液样本50ml，并将其存放于-80℃冰箱里，保存备用；
(2)从-80℃冰箱里取出健康志愿者/阿尔茨海默病患者尿液样本，在4℃条件下解冻，然后取尿液样本各10ml分别转移到试管中，在离心力为3000×g的条件下离心15minutes，去除细胞和细胞碎片，将上清液分别转移到无菌试管中；
(3)在步骤(2)的上清液中各加入2ml经Exo Quick提取的外泌体沉淀，通过反转或轻弹试管使其混合均匀，在-4℃下冷藏过夜，在离心力为1500×g的条件下离心30minutes，离心之后，吸取上清液，再次在离心力为1500×g的条件下离心5minutes，去除所有的上清液，注意吸取上清液的过程中不要触碰到试管底部的白色外泌体沉淀；
(4)在步骤(3)的白色外泌体沉淀中加入300μl蛋白裂解液和3μl蛋白抑制剂，涡旋15s，将沉淀重悬于溶液中，将溶液置于-80℃冰箱里放置5minutes，然后置于25℃水浴锅中5minutes，如此重复3次，将溶液存放于-80℃冰箱里，在需要的时候拿出来溶化；
(5)从在室温条件下平衡20minutes后的铝箔袋中取出所需板条，在板条上设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl，样本孔中加入待测样本50μl，标准品孔和样本孔中分别加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μl，用封板膜封住标准品孔和样本孔，置于37℃水浴锅或恒温箱中温育60minutes，弃去液体，吸水纸上拍干，在标准品孔和样本孔中加满350μl洗涤液，静置1minute，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗涤板条5次；
(6)在步骤(5)中的标准品孔和样本孔中分别加入50μl健康人尿液来源的外泌体、50μl阿尔茨海默病病人尿液来源的外泌体，37℃避光孵育15minutes后，在标准品孔和样本孔中均加入50μl终止液，15min内在450nm波长处测定各孔的OD值，对尿液来源的神经元外泌体中的3种蛋白质进行检测，包括Aβ42、P-S396-Tau、Aβ1-42，除了所用的检测试剂不同，检测步骤均相同。
请参阅图1-5，一种检测尿液外泌体的ELISA检测方法在阿尔茨海默病的评估和防治方面的应用，本发明使用透射电子显微镜(TEM)、纳米颗粒跟踪分析(NTA)等技术手段对获得的尿液外泌体进行表征，具体表征结果分别如下：
(1)透射电子显微镜(TEM)照片：
如图1所示，根据TEM的结果，我们可以看出健康志愿者和阿尔茨海默病患者的尿液来源的外泌体都是环形的。与年龄匹配的健康志愿者相比，阿尔茨海默病患者的外泌体相对比较聚集，尺寸相对较大。这些不同点可以帮助我们区分外泌体来自于健康志愿者还是阿尔茨海默病患者。外泌体形状和数量的差异可以为阿尔茨海默病的诊断提供一些依据。
(2)纳米颗粒跟踪分析图：
如图2所示，NTA结果显示了阿尔茨海默病患者尿液来源外泌体(47.83-909.17nm)的直径范围要大于年龄匹配的健康志愿者(44.50-722.50nm)。健康志愿者尿液来源外泌体的总数量(999601690.50±420672013.60个)整体上小于阿尔茨海默病患者(1899510882.00±1401625927.00个)。由于细胞外囊泡基于他们的大小通常被分为3种类型：凋亡小体(500nm-3μm)，微管(100nm-1μm)和外泌体(30-100nm)，所以我们比较分析了30-100nm的外泌体的数量。阿尔茨海默病患者尿液来源的外泌体直径在30-100nm的外泌体数量(48344698.33±37986746.54个)整体小于正常人(100299953±78597516.639个)。对于直径在30-100nm的外泌体数量占外泌体总数的比例，阿尔茨海默病患者直径在30-100nm的外泌体数量占外泌体总数的比例(0.048±0.046)明显小于正常人(0.128±0.133)。阿尔茨海默病患者尿液来源外泌体的直径平均数(187.733±8.204nm)明显高于年龄匹配的健康志愿者(163.150±27.506nm)。阿尔茨海默病患者尿液来源外泌体的直径众数(139.667±3.786nm)高于正常对照(114.000±11.314nm)。阿尔茨海默病患者尿液来源外泌体的直径的10分位(108.967±9.861nm)和50分位数(164.233±7.950nm)大于年龄匹配的健康志愿者(100.050±15.344nm)、(137.250±19.163nm)。阿尔茨海默病患者外泌体直径的90分位数(294.267±14.257nm)大于年龄匹配的健康志愿者(255.850±47.305nm)的趋势。
因此，总的来说，阿尔茨海默病患者尿液来源外泌体总数量大于正常人，且阿尔茨海默病来源的外泌体尺寸总体上大于年龄匹配的健康志愿者。阿尔茨海默病患者尿液来源外泌体的直径范围总体上大于年龄匹配的健康志愿者，但直径在30-100nm的外泌体数量总体上少于年龄匹配的健康志愿者。
(3)粒径测量结果：
如图3所示，可以看出，阿尔茨海默病患者和年龄匹配的健康志愿者外泌体的图像均为多峰,健康志愿者第一个峰出现得比阿尔茨海默病患者早,且峰值较小,之后出现的峰也都基本上早于阿尔茨海默病患者。健康志愿者和阿尔茨海默病患者出现的第一个峰的峰值均较其余峰的峰值大，表明相对于年龄匹配的健康志愿者的外泌体,阿尔茨海默病患者的尿液外泌体数量较多,直径较大,直径分布范围较广。同时,阿尔茨海默病患者和年龄匹配的健康志愿者的尿液外泌体均在较小直径范围最聚集,在几个特定的较大直径范围比较聚集，归因于尿液外泌体包含了代谢废物,可以推测阿尔茨海默病患者较年龄匹配的健康志愿者来讲,代谢废物相对较多。
(4)纳米颗粒跟踪分析视频图片：
如图4所示，我们从NTA视频图上可以看到，健康志愿者来源的外泌体比阿尔茨海默病患者来源的外泌体运动更快，但阿尔茨海默病患者尿液来源的外泌体更加饱满。这些不同点对诊断阿尔茨海默病具有非同寻常的意义。
(5)病理蛋白分析图：
如图5所示，我们用ELISA试剂盒来定量测量尿液来源的神经元外泌体的病理蛋白Aβ1-42，P-S396-Tau和Aβ42的水平。结果显示与年龄匹配的健康志愿者相比，阿尔茨海默病患者尿液来源的神经元外泌体中病理蛋白Aβ1-42和P-S396-Tau的水平明显高于健康志愿者，表明阿尔茨海默病患者尿液来源的神经元外泌体中可能存在这些病理蛋白的聚集,结合上文提到的阿尔茨海默病患者尿液外泌体的直径整体上大于年龄匹配的健康志愿者，据此我们推断可能是由于阿尔茨海默病患者体液中病理蛋白水平比较高，即需要排出的废物相对较高，所以相应的外泌体直径较大。阿尔茨海默病患者尿液来源的神经元外泌体中病理蛋白Aβ42与年龄匹配的健康志愿者相比无明显差异，但是阿尔茨海默病患者尿液来源的神经元外泌体中病理蛋白Aβ1-42/Aβ42的比值(0.309±0.061)明显大于年龄匹配的健康志愿者(0.020±0.011)。过去的研究已经表明，以后转化为阿尔茨海默病的轻度认知功障碍患者可通过脑脊液中Aβ1-42的升高和tau的降低来辨认。这些研究暗示，脑脊液中Aβ1-42和tau在检测阿尔茨海默病的早期阶段是有价值的。此外，阿尔茨海默病两大病理特征之一是Aβ沉积形成的老年斑。之前的研究已经表明，Aβ1-42的外泌体水平从临床前的较高水平到诊断阿尔茨海默病的更高水平，预示着外泌体中Aβ1-42的水平作为一个生物标记物是有价值的，且具有比较好的特异性。Tau是一种微管相关蛋白，tau病变涉及20余种疾病，包括阿尔茨海默病、进行性核上性麻痹、额颞叶痴呆和帕金森病相关染色体17(FTDP-17)，其特征在于丝状tau的细胞内积累。因此，尽管tau水平在疾病中的变化比较大，有较高的敏感性，但特异性不太好，所以单独使用时不能作为诊断阿尔茨海默病的生物标记物。然而，这些指标的联合使用可以很大地提高阿尔茨海默病诊断的敏感性和特异性。
综上所述，外泌体已经被证明有传播疾病和阻碍疾病的能力，可以作为阿尔茨海默病早期诊断的生物标记物，虽然外泌体的研究仍然处于初级阶段，但是我们相信外泌体最终会给患者带来益处。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种尿液外泌体ELISA的检测方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
(1)收集健康志愿者/阿尔茨海默病患者尿液样本，并将其存放于超低温冰箱里，保存备用；
(2)从超低温冰箱里取出健康志愿者/阿尔茨海默病患者尿液样本，在2-6℃条件下解冻，然后将尿液样本分别转移到试管中，离心，去除细胞和细胞碎片，将上清液分别转移到无菌试管中；
(3)在步骤(2)的上清液中各加入经Exo Quick提取的外泌体沉淀，通过反转或轻弹试管使其混合均匀，在低温冰箱中冷藏过夜，离心，吸取上清液，再次离心，去除所有的上清液，注意吸取上清液的过程中不要触碰到试管底部的白色外泌体沉淀；
(4)在步骤(3)的白色外泌体沉淀中加入蛋白裂解液和蛋白抑制剂，涡旋，将沉淀重悬于溶液中，将溶液置于超低温冰箱里放置5min，然后置于25℃水浴锅中5min，如此重复数次，将溶液存放于超低温冰箱里，在需要的时候拿出来溶化；
(5)从在室温条件下平衡后的铝箔袋中取出所需板条，在板条上设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品，样本孔中加入待测样本，标准品孔和样本孔中分别加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体，用封板膜封住标准品孔和样本孔，置于水浴锅或恒温箱中温育一定时间后，弃去液体，吸水纸上拍干，在标准品孔和样本孔中加满洗涤液，静置，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗涤板条数次；
(6)在步骤(5)中的标准品孔和样本孔中分别加入健康志愿者尿液来源的外泌体、阿尔茨海默病患者尿液来源的外泌体，避光孵育一定时间后，在标准品孔和样本孔中均加入终止液，15min内在450nm波长处测定各孔的OD值，对尿液来源的神经元外泌体中的3种蛋白质进行检测，包括Aβ42、P-S396-Tau、Aβ1-42，除了所用的检测试剂不同，检测步骤均相同。
2.根据权利要求1所述的一种尿液外泌体ELISA的检测方法，其特征在于，所述超低温冰箱的温度为-80℃，所述低温冰箱的温度为-4℃。
3.根据权利要求1所述的一种尿液外泌体ELISA的检测方法，其特征在于，步骤(2)中离心力为3000×g，离心时间为15minutes。
4.根据权利要求1所述的一种尿液外泌体ELISA的检测方法，其特征在于，步骤(3)中第一次离心的离心力为1500×g，离心时间为30minutes；第二次离心的离心力为1500×g，离心时间为5minutes。
5.根据权利要求1所述的一种尿液外泌体ELISA的检测方法，其特征在于，步骤(4)中涡旋时间为15s。
6.根据权利要求1所述的一种尿液外泌体ELISA的检测方法，其特征在于，步骤(4)中重复3个循环。
7.根据权利要求1所述的一种尿液外泌体ELISA的检测方法，其特征在于，步骤(5)中在37℃水浴锅或恒温箱中温育60minutes。
8.根据权利要求1所述的一种尿液外泌体ELISA的检测方法，其特征在于，步骤(5)中重复洗涤板条5次。
9.根据权利要求1所述的一种尿液外泌体ELISA的检测方法，其特征在于，步骤(6)中孵育温度为37℃，孵育时间为15minutes。
10.一种检测尿液外泌体的ELISA检测方法在阿尔茨海默病的评估和防治方面的应用。
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