CN101246164A - 阿尔茨海默病早期诊断液相芯片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种阿尔茨海默病早期诊断液相芯片，主要包括有：包被微球：含有分别包被了t－tau捕获抗体的微球，包被了p－tau231捕获抗体的微球，包被了p－tau181捕获抗体的微球，包被了p－tau199捕获抗体的微球，和包被了Aβ_1－42捕获抗体的微球，上述微球具有不同颜色编码；分别用生物素标记的检测抗体；链亲和素藻红蛋白。本发明所提供的阿尔茨海默病早期诊断液相芯片具有检测效率高，所需样本量少，特异性强，灵敏度高等优点。同时，各项神经生化损伤标志物可自由组合，使用方便。同时，由于所有反应均处在液相环境，更有利于保持蛋白质的天然构象，使探针和被检测物的反应更快更完全，因此检测灵敏度和线性范围均得到极大的提高。

Description

阿尔茨海默病早期诊断液相芯片及其制备方法

技术领域

本发明涉及医学体外诊断技术，具体的是涉及阿尔茨海默病早期诊断液相芯片及其制备方法。

背景技术

老年性痴呆(又称阿尔茨海默病，Alzheimer disease，AD)是一种以认知功能减退、生活功能下降及精神行为异常为临床表现的神经系统退行性疾病。AD的典型病理特征是神经元内出现神经原纤维缠结(NFT)，细胞外有老年斑(SP)沉积及神经元数量减少。随着老龄人口的增加，AD的患病率逐年增加。目前，全世界约有1800万人罹患阿尔茨海默病，其中50％发生在发展中国家。另据WHO估计，到2050年，全世界患该病的人数将增加一倍，达到3400万人。统计资料显示，我国老年性痴呆患病率在65岁以上老人中所占的比例为6.6％，85岁以上老人为30％。老年性痴呆的患病率会随着年龄的增长而上升，从而严重威胁着老年人的生命健康并给社会带来了巨大的负担。2001年有研究者预测，在美国对AD进行早期临床确诊，每年可节省约一千亿美元的医疗费用。

AD早期患者的生理和心理与正常衰老之间没有明显的界限，很难及时为患者确诊，因此目前仍缺乏特异的诊断及有效的治疗。而理想的诊疗应在大量突触和神经元丧失以前，所以目前对于该病的研究重点转移到了对于AD早期或极早期的诊断和治疗上。然而，除了在患者死后通过大脑中衰老斑和神经纤维混乱的出现这些指标进行疾病确认外还没有公认的诊断标准。临床诊断主要根据病人的病史，大脑影像学以及心理学，认知和神经学测试。实验室辅助诊断方法主要是检测体液中含有的可溶性标志物。

近年，众多AD研究专家及机构投入大量精力研究生物学检测指标，并从AD患者的脑脊液或血液中发现一些具鉴别诊断意义的生化指标，如tau蛋白、β淀粉样蛋白(Aβ)、载脂蛋白E(ApoE)、Aβ前体蛋白(APP)、早老素(PS-1，PS-2)和天冬氨酸转氨酶(AST)等。t-tau(总tau蛋白)，p-tau(磷酸化tau蛋白)和Aβ_1-42是用于AD辅助诊断的3种重要生物学标记物。在脑脊液中对这3种标记物及它们的亚型(p-tau231、p-tau181、p-tau404、p-tau396等)已经有很多研究(彭丹涛，2005)。脑脊液中β淀粉样蛋白的浓度可以部分反映脑组织中β淀粉样蛋白的沉积与清除情况；而脑脊液中tau蛋白和磷酸化tau蛋白(p-tau蛋白)浓度能够反映大脑神经原纤维缠结形成的情况，作为神经元和神经轴变性的指标。

(1)t-tau总tau蛋白存在于正常脑组织神经元轴突中，参与微管交联，又称微管相关tau蛋白。脑脊液中tau蛋白可能来自死亡的或退化变性的神经细胞。约85％的AD患者脑脊液中tau蛋白水平显著升高，约为健康对照组及其它神经系统疾病对照组的3倍(李华芳，1999；薛海波，2007)。因此，监测高危人群脑脊液tau蛋白浓度的变化，对早期明确阿尔茨海默病诊断大有裨益。升高的脑脊液t-tau可预示轻度认知功能障碍(MCI，一种介于老年痴呆和正常老年人认知功能减退的状态，也是认知障碍进行预防性干预的最佳阶段)患者中潜在的神经轴索损伤和神经变性。这一指标主要预示在许多不同疾病中全面神经损伤。但tau蛋白过度磷酸化则导致神经纤维缠结，是AD的主要病理特点之一。在几个研究中，一个重要发现是这一改变也出现在早期痴呆中。因此脑脊液中t-tau可以鉴别AD和正常老化，平均敏感度75％，特异性85％。随着年龄增加，没有精神神经疾病的人群也有t-tau增加。因此和年龄相关的脑脊液t-tau浓度水平应被诊断采用。21-50岁，t-tau浓度小于300pg/ml；51-70岁，t-tau浓度小于450pg/ml；70-93岁，t-tau浓度小于500pg/ml(Sjogren M，2001)。

脑脊液中t-tau在鉴别AD和其他疾病造成的痴呆有一定的局限性。该实验的敏感性为81％，但特异性仅为57％(Parnetti，2001)。t-tau增加也出现在血管性痴呆(VD)、额颞叶痴呆(fron-totemporal dementia，FTD)、路易体痴呆(lewy body disease，LBD)的一些病患中，某些语言性痴呆也出现t-tau增加(Fabre F，2001；姚洁，2007)。因此，t-tau在鉴别AD的其他类型痴呆的特异性不高，不能被当作AD鉴别诊断的标志物。

(2)异常磷酸化的tau蛋白(p-tau)正常tau蛋白是一种含磷蛋白质，每摩尔tau蛋白中含磷酸2～3mol。在AD患者中，tau蛋白被异常过度磷酸化。这种异常磷酸化的tau蛋白是AD患者脑神经元中双股螺旋丝的主要成分。采用免疫印迹定量测定，发现AD患者脑中正常tau蛋白含量明显降低，而tau蛋白总量则显著高于同龄正常人，且增加的tau蛋白中以异常过度磷酸化的形式为主。2001年多个国家学者联合对570例AD患者脑脊液磷酸化tau监测分析后，认为其是诊断AD的一个可靠生物标识。磷酸化的tau诊断阿尔茨海默病的灵敏度达85.2％，特异度达85％(Leclerc S，2001)。因此，AD特异性磷酸化tau的含量是检测AD的特异性生化指标。

在人体中有6种tau蛋白异构体和多于21种磷酸化位置的tau蛋白。用单克隆抗体可以检出t-tau的磷酸化物及异构体。p-tau蛋白的多个国际临床研究中心的研究主要集中在tau蛋白不同的磷酸化位点：tau蛋白在丝氨酸199磷酸化(p-tau199)；在苏氨酸231磷酸化(p-tau231)；在苏氨酸181磷酸化(p-tau181)；在丝氨酸396和404磷酸化(p-tau396/404)。不同的磷酸化位点检测可以极大提高诊断的准确性。

Augustinack等通过组织化学研究显示，脑脊液tau蛋白的第231位的苏氨酸磷酸化(p-tau231)在疾病早期甚至在成对螺旋丝形成之前就已出现，且敏感度可达85％(Augustinack J，2002)。

免疫学研究指出tau蛋白在苏氨酸231磷酸化对于AD是特异的，并在疾病发展早期即可出现，甚至早于微管的形成。因此，p-tau231在当前被普遍认为是AD诊断的一个特异性生物学标志物。脑脊液p-tau231检测在AD鉴别诊断中的作用在一个早期研究中，检测脑脊液p-tau231对鉴别AD和OND敏感性为85％，特异性为97％(总正确率为91％)(Buerger K，2006)。在一个192例病例的独立研究中，发现脑脊液p-tau231在AD鉴别诊断中优于总的tau蛋白。检测脑脊液p-tau231水平，鉴别AD和其他非AD病例具有85％敏感性和75％特异性。特别是AD和FTD的鉴别，p-tau231特异性和t-tau均为90.2％，但敏感性从t-tau的57.7％增加到90.2％。最近发表的研究中，AD病人的脑脊液p-tau231水平相对于老年抑郁症和健康对照有明显增加。鉴别可能的AD与MD，脑脊液p-tau231检测准确率达87％，轻度AD与MD鉴别，脑脊液p-tau231检测准确率达78％。p-tau231浓度变化和AD严重程度相关。AD病程中p-tau231下降，可能随着疾病进展，p-tau231变得难溶，难以进入脑脊液中，脑脊液中减少的p-tau231进入神经纤维缠结中；而t-tau仍保持可溶性，脑脊液中无明显变化。总之，这些数据显示脑脊液p-tau231可能是AD早期诊断和鉴别诊断及反映疾病进展的有效工具。

(3)脑脊液苏氨酸181磷酸化tau蛋白(p-tau181)大量研究显示，脑脊液p-tau181在AD中明显增加，而对照和FTD无此变化。在鉴别AD和LBD中，特异性相同，而p-tau181检测敏感性高于t-tau(Hampel H，2004)。根据接受操作特点(receiver operatingcharacteristics，ROC)曲线对AD和LBD正确分类可达80％。磷酸化tau蛋白反映tau蛋白磷酸化这一概念被证实，在严重创伤中，脑脊液t-tau增加，而p-tau181无变化。

(4)脑脊液丝氨酸199磷酸化tau蛋白(p-tau199)在一项p-tau199研究中显示，这项生物学标志检测对AD及非AD患者优于t-tau，p-tau199水平在AD组中升高，并和年龄、性别、认知状态及ApoE4携带状态无关。这项研究中，AD组和其他原因造成的痴呆及非痴呆病例，ROC分析显示p-tau199检测敏感性及特异性均达85％(Ishiguro K，1999)。

(5)β-淀粉样蛋白(Aβ)AD的主要病变之一是老年斑，其主要成分是淀粉样β蛋白前体(APP)。APP主要为淀粉样β蛋白40(Aβ_1-40)，也有部分为Aβ_1-42，43。相对而言，Aβ_{1-42， 43}更容易聚合形成淀粉样沉积，现在认为APP产生或降解途径受阻而使APP沉积是导致AD发生的重要机制。在疾病早期Aβ沉积增加，脑脊液中Aβ增加，而疾病中、晚期，Aβ大量沉积为老年斑，使得脑脊液中Aβ含量反而下降。因此，通过测定Aβ水平可监测AD进展情况并观察药物疗效。研究数据显示，脑脊液中Aβ_1-42浓度大于500pg/ml应作为鉴别AD和正常老化的分界线(Sjogren M，2001)。近30个研究显示AD患者脑脊液中Aβ_1-42浓度降低，在大多数研究中，敏感性和特异性都超过80％(姚洁，2007)。检测脑脊液Aβ_1-42，鉴别AD和正常老化的敏感性为78％～100％，特异性为47％～81％(Squitti R，2006；Andreasen N，2003)。根据阿尔茨海默病的病理改变，凡脑组织中β-淀粉样蛋白沉积性疾病如血管性痴呆、Lewy小体痴呆、进行性核上性麻痹及额叶痴呆患者，脑脊液Aβ_1-42浓度均呈不同程度降低。提示单纯脑脊液Aβ_1-42定量检测的特异性较低，不能单独作为阿尔茨海默病诊断的标准.但它对临床高度怀疑为阿尔茨海默病的患者具有辅助诊断意义(李毅，2004)。

在鉴别AD和其他临床痴呆中，单独检测脑脊液Aβ_1-42或t-tau都是不充分的，多指标的联合检测可进一步提高AD诊断率特别是早期诊断率。Blennow指出在区别AD与健康老年人时，Aβ_1-42，t-tau及p-tau这三种脑脊液生物学标记物平均敏感性和特异性分别为81％～89％和89％～91％。t-tau联合p-tau的敏感性和特异性能达到96％和100％(Blennow K，2004)。Parnetti等的研究表明2种以上的脑脊液标记物的改变可以正确的预测MCI向AD的转变(Parnetti L，2006)。Hansson等对180例MCI患者的研究，在基线状态鉴别进展为AD的MCI患者，t-tau联合Aβ_1-42的敏感性和特异性为95％和83％(Hasson 0，2006)。在一个多样本多中心的研究中，236例中有93例AD患者，33例非AD，56例其他神经障碍，54例健康对照，应用脑脊液Aβ_1-42和t-tau联合检测，AD的检出率敏感性71％，特异性为83％。另一项研究中，AD和对照的鉴别敏感性为90％，特异性为80％。Galasko认为，在判断早期阿尔茨海默病方面，Aβ_1-42水平降低比tau蛋白水平升高更具临床意义。提示早期阿尔茨海默病患者可能先出现脑脊液Aβ_1-42浓度的降低；这种联合定量检测诊断早期阿尔茨海默病的敏感度为90.00％，特异度80.00％。由此可见，对脑脊液中相关生物学标志物进行联合检测，其诊断价值明显优于单一检测方法。若同时检测患者脑脊液中磷酸化tau蛋白浓度则可增加诊断的特异性。因为大多数额颞痴呆和Lewy体痴呆患者脑脊液中的磷酸化tau蛋白浓度均处于正常值范围。因此，联合检测脑脊液tau蛋白、Aβ_1-42和磷酸化tau蛋白等生物学标志物浓度，可提高阿尔茨海默病诊断的特异性。而目前，检测阿尔茨海默氏病的可溶性标志物基本上都采用酶联免疫(ELISA)的方法或免疫印迹方法。然而，这些早期标志物在脑脊液中浓度很低，用ELISA法无法准确检测其浓度。同时，ELISA法一次反应只能检测一个指标。如果要检测多个指标，则需要多个反应来完成，不仅浪费时间，同时还浪费标本，检测成本相对较高。因此，应用一次反应同时检测多个指标的技术平台检测阿尔茨海默病具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有阿尔茨海默病缺乏方便有效的早期诊断方法以及现有技术一次只能检测一个神经生化标志物的缺陷，提供一种可以五种标志物联检的阿尔茨海默病早期诊断液相芯片，该液相芯片为阿尔茨海默病的早期诊断提供一种高效，准确，简便的临床检测手段。

实现上述目的的技术方案如下：

一种阿尔茨海默病早期诊断液相芯片，包括有

1)包被微球：

含有分别包被了t-tau捕获抗体的微球，包被了p-tau231捕获抗体的微球，包被了p-tau181捕获抗体的微球，包被了p-tau199捕获抗体的微球，和包被了Aβ_1-42捕获抗体的微球，上述微球分别具有不同颜色编码；

2)生物素标记检测抗体：含有分别用生物素标记的t-tau、p-tau231、p-tau181、p-tau199及Aβ_1-42的检测抗体；和

3)链亲和素藻红蛋白。

优选为，每种包被捕获抗体的微球的使用浓度为110-140个/μl，更优选为120个/μl；每种生物素标记检测抗体的使用浓度为1-3ug/ml，更优选为2ug/ml。

液相芯片技术也叫流式荧光技术，该技术由一种微球作为反应载体，微球用聚苯乙烯材料制成，直径5.6um，表面有活性羧基可供化学偶连用，抗原、抗体等生物大分子可通过氨基与微球表面的羧基通过化学反应共价结合(即包被过程)。在微球制造过程中加入红外和远红外两种荧光染料，根据两种染料混合比例的不同将微球进行编码，可区分出上百种不同编码的微球。使用时，先将t-tau、p-tau231、p-tau181、p-tau199及Aβ1-42的捕获抗体分别包被于不同颜色编码的微球上，同时分别用生物素标记t-tau、p-tau231、p-tau181、p-tau199及Aβ1-42的检测抗体。将包被好的五种微球混合，悬浮于液相，再加入待检测标本，在悬液中微球上标记的捕获抗体与标本中相应的检测物的某一个表位异性地结合，之后加入生物素标记的检测抗体与标本中相应检测物的另一表位特异性结合，反应完全后加入荧光物质——藻红蛋白标记的链亲和素，由于链亲和素藻红蛋白(SA-PE)可以与生物素高度特异性结合，因此反应体系中最后形成“微球-捕获抗体+待检测物+生物素标记的检测抗体+SA-PE”的五种复合物，以微球为载体，通过Luminex系列液相芯片分析仪器检测，读取微球的色彩编号及SA-PE的荧光值。微球色彩编号可辨别检测项目，SA-PE荧光值与各检测物浓度呈正相关，通过测定t-tau、p-tau231、p-tau181、p-tau199及Aβ1-42标准品在不同浓度下的荧光值，可以获得各个检测指标标准品浓度-荧光值标准曲线以及标准曲线方程。将待测脑脊液样本检测所得荧光值代入标准曲线方程即可分别求得待测样本中的t-tau、p-tau231、p-tau181、p-tau199及Aβ1-42的量。

由于所有反应均处在液相环境，更有利于保持蛋白质的天然构象，使探针和被检测物的反应更快更完全，因此检测灵敏度和线性范围均得到极大的提高。

本发明另一需要解决的技术问题是提供上述阿尔茨海默病早期诊断液相芯片的制备方法。

一种阿尔茨海默病早期诊断液相芯片的制备方法，主要包括以下步骤：

(1)相应的捕获抗体包被微球：

-将50μL微球活化后，≥15000rpm，离心；

-吸弃上清，将微球重悬于pH5.0的230-280μL 50mM的MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)的溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理1min，后将微球于≥15000rpm，离心8-12min；重复该步骤；

-吸弃上清，将微球重悬于100μL 50mM pH5.0的MES的溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理1min；

-往悬浮的微球中加入相应的0.8-1.2μg抗体，用50mM的pH5.0的MES溶液将总体积补至450-550μL；

-用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5-2.5hr；

-偶联了抗体后的微球以≥12000g的速度，离心8-12min；

-吸弃上清，将微球重悬于500μL PBS-TBN溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理1min；

-室温避光振荡30min；再于≥12000g，离心8-12min；

-吸弃上清，将微球重悬于1mL PBS-TBN溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理1min；微球≥12000g，离心4-6min；重复该步骤一次；

-吸弃上清，将微球重悬于500-1000μL PBS-TBN溶液中；

-每种包被好的微球通过1uminex仪器计数后置于2-8℃避光单独保存，使用时，依据检测需要等比例混合，使混合液中每种捕获抗体偶联微球的浓度均为120个/μl；

(2)每种检测抗体的生物素标记：

-依据检测抗体浓度计算出检测抗体溶液稀释至1mg/ml的体积，视为目标体积；

-用DMSO(Dimethyl sulfoxide)溶解，配置10mg/ml的NHS-Biotin反应液；

-按摩尔比1∶100于反应管中分别加入检测抗体与NHS-Biotin反应液；

-加入体积为目标体积的1/10的pH8.9的NaHCO₃溶液；

-加入pH7.4的PBS补至目标体积；

-包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25℃恒温箱中避光孵育3-5小时，转速为800rpm-1000rpm；

-将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS-Biotin；

-使用时根据需要将标记好的每种检测抗体等比例混合。

所述活化微球的步骤如下：

-用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球；

-取50μL微球离心8-10min；

-去掉上清夜，将微球重悬于100μL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约30s，≥15000rpm离心1-2min；

-吸弃上清，加入80μL的磷酸盐缓冲液(pH6.2)，涡漩振荡约20s，超声波悬浮微球约1min；

-加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀，超声处理1min；

-加入10μL 50mg/mL EDC，用涡漩振荡器轻轻地混匀；

-室温震荡反应约20min。

本发明方法结合液相芯片平台高通量多指标并行检测的特性与双抗体夹心法高灵敏度的特性，同步检测5种神经生化标志物，能提高阿尔茨海默病早期诊断的准确率，同时为阿尔茨海默病的病情监测及预后判断提供依据。

本发明所公开的阿尔茨海默病早期诊断液相芯片可一次反应同时完成多种神经生化标志物的定量检测，从而达到对阿尔茨海默病的早期准确诊断。本发明所提供的阿尔茨海默病早期诊断检测液相芯片还具有检测效率高，所需样本量少，特异性强，灵敏度高等优点。

另外，本发明的制备方法简单易行，稳定性好，其技术方案中的各种工艺参数如微球和抗体的量、反应过程等均是在大量试验基础上得出的，为制备过程最佳的参数值。

附图说明

图1是检测t-tau的标准曲线示意图；

图2是检测p-tau231的标准曲线示意图；

图3是检测p-tau181的标准曲线示意图；

图4是检测p-tau199的标准曲线示意图；

图5是检测β_1-42的标准曲线示意图。。

具体实施方式

实施例1阿尔茨海默病早期诊断液相芯片的制备及抗原的检测

本发明所述的捕获抗体为分别能对应与t-tau、p-tau231、p-tau181、p-tau199及Aβ_1-42特异性结合的单克隆抗体；所述的检测抗体为分别能与t-tau、p-tau231、p-tau181、p-tau199及Aβ_1-42特异性结合的单克隆抗体或多克隆抗体。

本实施例所用的t-tau、p-tau231、p-tau181、p-tau199及Aβ_1-42的捕获抗体与检测抗体购自晶美生物工程有限公司。

本实施例中，所述各种溶液的配方如下：

1.50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：

试剂	来源	终浓度	每250ml的用量
				MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonicacid)	Sigma M-2933	0.05M	2.44g
5MNaOH	Fisher SS256-500	---	5滴

2.PBS配方：

试剂	目录号	终浓度	每1L的用量
				PBS	Sigma-3813	138mM NaCl2.7mM KCl	1包

3.PBS-TBN配方(即PBS中含0.1％BSA，0.02％Tween-20，0.05％Na3N，pH7.4)

试剂	目录号	终浓度	每1L的用量
				PBS pH7.4	Sigma P-3813	138mM NaCl2.7mM KCl	1包
BSA	Sigma A-9647	0.1％	1g
				Tween-20	Sigma P-9416	0.02％	0.2ml

Sodium Azide

Sigma S-8032

0.05％Azide

500mg

1.阿尔茨海默病早期诊断液相芯片试剂盒，包括有：

1)5-plex包被微球：含有分别包被了t-tau捕获抗体的20号微球，包被了p-tau231捕获抗体的32号微球的偶联体，包被了p-tau181捕获抗体的34号微球，包被了p-tau199捕获抗体的36号微球，包被了Aβ_1-42捕获抗体的38号微球。

2)5-plex生物素标记检测抗体：含有分别用生物素标记的t-tau、p-tau231、p-tau181、p-tau199及Aβ1-42的检测抗体；

3)链亲和素藻红蛋白(SA-PE，10ug/ml)；还按照现有技术配套有

4)分析缓冲液；

5)5-plex标准品；

6)质控液I；

7)质控液II；

8)基质液；

9)封口膜；

10)滤板。

2.制备上述液相芯片试剂盒，包括有如下步骤：

(1)按上述试剂盒的组成，每种捕获抗体包被相应的微球，制备方法相同：

-分别选取20号、32号、34号、36号、38号微球(美国Luminex公司)，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球，大约30s；

-各取50μL微球于1.5ml的离心管中，15000rpm离心10min；

-小心去掉上清夜，将微球重悬于100μL的双蒸水中，涡漩振荡约30s，超声处理1min；15000rpm离心10min；

-吸弃上清，加入80μL的磷酸盐缓冲液(pH6.2)，涡漩振荡约30s，超声处理1min；

-加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀，超声处理1min；

-加入10μL 50mg/mL EDC，用涡漩振荡器轻轻地混匀；

-室温震荡反应约20min；

-活化后的微球，≥15000rpm，离心10min；

-吸弃上清，将微球重悬于250μL 50mM的MES(pH5.0)的溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理1min；微球≥15000rpm，离心10min；重复该步骤一次；

-吸弃上清，将微球重悬于100μL 50mM的MES(pH5.0)的溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理1min；

-往悬浮的微球中加入1μg抗体，用50mM的MES(pH5.0)溶液将总体积补至500μL；

-用涡漩振荡器混匀，25℃避光振荡2hr(转速900rpm)；

-偶联抗体后的微球以≥12000g的速度，离心10min；

-吸弃上清，将微球重悬于500μL PBS-TBN溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理1min；

-室温避光振荡30min；

-微球≥12000g，离心10min；

-吸弃上清，将微球重悬于1mL PBS-TBN溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理1min；微球≥12000g，离心5min；重复该步骤一次；

-吸弃上清，将微球重悬于600μL PBS-TBN溶液中；

-包被好的微球通过luminex仪器计数；

-包被好的微球置于2-8℃避光保存，每种抗体偶联的微球单独保存，使用时，依据检测项目选择等比例混合。

(2)按上述试剂盒的组成，每种检测抗体的生物素标记：

-依据蛋白浓度计算反应体系；

-依据蛋白浓度计算抗体溶液稀释至1mg/ml的体积，视为目标体积(V)；

-配置NHS-Biotin反应液(用DMSO溶解，使其浓度为10mg/ml)；

-按摩尔比1∶100于反应管中分别加入检测抗体与NHS-Biotin(10mg/ml)反应液；

-加入1/10目标体积的NaHCO₃(pH8.9)溶液；

-加入PBS(pH7.4)补至目标体积；

-包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25℃恒温箱中避光孵育4h，转速为900rpm；

-将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS-Biotin；

-测定蛋白浓度。

3.用于检测，包括如下步骤：

1)使用前先取出所有试剂，放置平衡至室温。

2)标准品的稀释：每个标准品设6个稀释度，然后等比例混合，使各自得终浓度为所需的浓度。各管稀释方法及理论浓度(同下表中的预期浓度)：

注意：每个浓度标准品稀释完后均必须用涡旋混合仪彻底混匀后才可用于下一浓度的稀释。混匀过程避免产生泡沫。

3)设置96孔板布局，确定96孔板上标准品、质控品、待测样品及空白孔的位置。考虑到仪器读数的顺序是按照从第1列到第12列、从第A行到第H行的顺序纵向读数，在设置96孔板布局时应遵循从第1列到第12列、从第A行到第H行的顺序排列。

4)按照设置好的96孔板布局，每孔加25μl分析缓冲液，再分别加入25ul标准品、质控品到各自孔中，空白孔加25ul分析缓冲液。

5)分别取出上述制备的针对五种神经生化标志物检测的捕获抗体偶联微球，用涡旋混合仪混匀30钞，超声处理30秒，按等比例混合，使混合液中每种捕获抗体偶联的微球浓度均为120个/μl。往每孔中加入的五种捕获抗体偶联微球的混合悬液25μl。包被微球应在临用前混匀，且混匀后应立即使用，否则放置过久微球会再沉淀。

6)用封口膜封住所有加样孔口，并用锡箔纸包住96孔板以避光，25℃放置在微孔板振荡器上以600转速度震荡，孵育60分钟。

7)孵育完成后每孔加入25ul上述制备的生物素标记的检测抗体的混合液(其中所述五种生物素标记的检测抗体事先按等比例混合，使每种检测抗体最终浓度达到2ug/ml，摇匀)，用封口膜封住所有加样孔口，并用锡箔纸包住96孔板以避光，25℃放置在微孔板振荡器上以600转速度震荡，再孵育60分钟。

8)孵育完成后每孔加入25ul链亲和素藻红蛋白，用封口膜封住所有加样孔口，并用锡箔纸包住96孔板以避光，25℃放置在微孔板振荡器上以600转速度震荡，再孵育30分钟。

9)于Luminex系列液相芯片分析仪上读取结果。仪器可自动绘制标准曲线，并计算出待测样品的测值。

4.实验结果分析：

请参见表1-表3和图1-图5。

本发明所公开的阿尔茨海默病早期诊断液相芯片只需25μL的脑脊液样本即可一次反应同时完成五种神经生化标志物的定量检测。同时，与放射免疫，化学发光检测及酶联免疫吸附等方法相比，液相芯片平台检测范围更宽，灵敏度更高，重复性更好。由于所有反应均处在液相环境，更有利于保持蛋白质的天然构象，使探针和被检测物的反应更快更完全，因此检测灵敏度和线性范围均得到极大的提高。

通过对t-tau、p-tau231、p-tau181、p-tau199及Aβ_1-42捕获抗体和检测抗体的配对，我们找到了适用于这五种神经生化标志物检测的最优抗体对。通过标准曲线的分析，可以看到本发明所提供的阿尔茨海默病早期诊断液相芯片对神经生化标志物的检测具有很高的检测灵敏度和特异性。其中，t-tau与Aβ_1-42标准曲线的线性在9.77pg/ml～10ng/ml的浓度范围内R²≥0.99，最低检测限可达9.77pg/ml。p-tau231，p-tau181及p-tau199的标准曲线在2.44pg/ml～2.5ng/ml的浓度范围内R²≥0.99，最低检测限可达2.44pg/ml，且各个标准点的实测浓度与预期浓度的相对误差不超过8％。因此，本发明提供的阿尔茨海默病早期诊断液相芯片能对脑脊液中五种神经生化标志物极微量的变化进行检测，并且能一次性检测五种具有早期诊断及不同鉴别诊断价值的神经生化标志物，从而提高阿尔茨海默病诊断的准确率，同时为阿尔茨海默病的病情监测及预后判断提供重要依据。

表1

表2

表3

Claims (5)

1. 一种阿尔茨海默病早期诊断液相芯片，其特征是，主要包括有：

1)包被微球：含有分别包被了t-tau捕获抗体的微球，包被了p-tau231捕获抗体的微球，包被了p-tau181捕获抗体的微球，包被了p-tau199捕获抗体的微球，和包被了Aβ_1-42捕获抗体的微球，上述微球分别具有不同颜色编码；

2)生物素标记检测抗体：含有分别用生物素标记的t-tau、p-tau231、p-tau181、p-tau199及Aβ1-42的检测抗体；和

3)链亲和素藻红蛋白。

2. 根据权利要求1所述的阿尔茨海默病早期诊断液相芯片，其特征是，每种包被捕获抗体的微球的使用浓度为110-140个/μl；每种生物素标记检测抗体的使用浓度为1-3ug/ml。

3. 根据权利要求2所述的阿尔茨海默病早期诊断液相芯片，其特征是，每种包被捕获抗体的微球的使用浓度为120个/μl；每种生物素标记检测抗体的使用浓度为2ug/ml。

4. 一种制备权利要求1所述阿尔茨海默病早期诊断液相芯片的方法，主要包括以下步骤：

(1)每种相应的捕获抗体包被微球：

-将50μL微球活化后，≥15000rpm，离心；

-吸弃上清，将微球重悬于pH5.0的230-280μL 50mM的MES的溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理1min，后将微球于≥15000rpm，离心；重复该步骤；

-吸弃上清，将微球重悬于100μL 50mM pH5.0的MES的溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理1min；

-往悬浮的微球中加入相应的0.8-1.2μg抗体，用50mM的pH5.0的MES溶液将总体积补至450-550μL；

-用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5-2.5hr；

-偶联了抗体后的微球以≥12000g的速度，离心8-12min；

-吸弃上清，将微球重悬于500μL PBS-TBN溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理1min；

-室温避光振荡30min；再于≥12000g，离心8-12min；

-吸弃上清，将微球重悬于1mL PBS-TBN溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理1min；微球≥12000g，离心4-6min；重复该步骤一次；

-吸弃上清，将微球重悬于500-1000μL PBS-TBN溶液中；

-每种包被好的微球通过luminex仪器计数后置于2-8℃避光单独保存，使用时，依据检测需要等比例混合，使混合液中每种捕获抗体偶联微球的浓度均为110-140个/μl；

(2)每种检测抗体的生物素标记：

-依据检测抗体浓度计算出检测抗体溶液稀释至1mg/ml的体积，视为目标体积；

-用DMSO溶解，配置10mg/ml的NHS-Biotin反应液；

-按摩尔比1∶100于反应管中分别加入检测抗体与NHS-Biotin反应液；

-加入体积为目标体积的1/10的pH8.9的NaHCO₃溶液；

-加入pH7.4的PBS补至目标体积；

-包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25℃恒温箱中避光孵育3-5小时，转速为800rpm-1000rpm；

-将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS-Biotin；

-使用时根据需要将标记好的每种检测抗体等比例混合，使每种检测抗体最终浓度达到1-3ug/ml。

5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征是：所述活化微球的步骤如下：

-用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球；

-取50μL微球离心8-10min；

-去掉上清夜，将微球重悬于100μL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约30s，超声处理1min，≥15000rpm离心8-12min；

-吸弃上清，加入80μL的磷酸盐缓冲液，涡漩振荡约20s，超声波悬浮微球约1min；

-加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀，超声处理1min；

-加入10μL 50mg/mL EDC，用涡漩振荡器轻轻地混匀；

-室温震荡反应约20min。

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