CN111624291B - 一种利用hplc测定爱普列特片中杂质含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用HPLC测定爱普列特片中杂质含量的方法，属于药物分析技术领域。该方法包括以下步骤：1)配置供试品溶液和对照溶液；2)设置高效液相检测条件：色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂，规格为250mm×4.6mm，填料粒径为5μm，柱温为35℃，以水、冰醋酸、二乙胺的混合液为流动相A，以甲醇为流动相B，流速为1.0mL/min进行梯度洗脱；3)分别精密吸取供试品溶液和对照溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。本申请能够快速、有效、准确和可靠的分离检测出爱普列特片中有关物质，有利于提高爱普列特片的产品质量，提高患者用药安全性。

Description

一种利用HPLC测定爱普列特片中杂质含量的方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种利用HPLC测定爱普列特片中杂质含量的方法。
背景技术
良性前列腺增生是男性最为常见的一种泌尿系统疾病，是由前列腺实质细胞数量增多导致前列腺体积增大所致，临床上以排尿困难、尿频、尿急、尿线无力、尿间断或滴沥等为主要表现，严重者可导致急性尿潴留、充盈性尿失禁，严重影响患者的生活质量。目前手术治疗是最为有效的治疗方法，然而良性前列腺增生患者一般都为高龄老人，其生理功能较弱，易给患者生理心理带来负担。因此，寻找积极有效的治疗措施是极为重要的。
爱普列特片为新型的非竞争性5α还原酶抑制剂，可专一性或选择性抑制II型酶，而对I型酶作用较弱，因此该药主要在前列腺发挥作用，可有效降低双氢睾酮含量。
根据爱普列特工艺路线，在制备中间体过程中会产生工艺副产物杂质A和杂质B；终产品爱普列特片在生产和贮存过程中可能会产生杂质C和杂质D，而针对杂质A、B、C、D分离测定的相关文献报道极少，因此，提供一种测定爱普列特片中杂质含量的方法对于原料制剂的生成和贮存具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种利用HPLC测定爱普列特片中杂质含量的方法，能够快速、有效、准确和可靠的分离检测出爱普列特片中有关物质，有利于提高爱普列特片的产品质量，提高患者用药安全性。
为了解决上述问题，本发明采用的技术方案为：
一种利用HPLC测定爱普列特片中杂质含量的方法，包括以下步骤：
1)配置供试品溶液和对照溶液；
2)设置高效液相检测条件：色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂，规格为250mm×4.6mm，填料粒径为5μm，柱温为35℃，以水、冰醋酸、二乙胺的混合液为流动相A，以甲醇为流动相B，流速为1.0mL/min进行梯度洗脱；
3)分别精密吸取供试品溶液和对照溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。
进一步的，水、冰醋酸、二乙胺的体积比为1000∶25∶1。
进一步的，梯度洗脱的条件为：0-30min，流动相A的体积百分比为30％，流动相B的体积百分比为70％；30-50min，流动相A的体积百分比为17％，流动相B的体积百分比为83％。
进一步的，供试品溶液与对照溶液的进样量为10μL。
进一步的，液相色谱仪的紫外检测器的的检测波长为260nm。
进一步的，供试品溶液的制备方法为：精密称定爱普列特细粉，加甲醇溶解稀释成每mL含爱普列特2mg的溶液，离心，取上清液作为供试品溶液；所述对照溶液的制备方法为：精密量取供试品溶液，加甲醇稀释成每mL含爱普列特4μg的溶液，作为对照溶液。
进一步的，供试品溶液的色谱图中，如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液的主峰面积，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的5倍。
有益效果：与现行检测标准WS1-(X-075)-2003Z相比，采用本申请方法，在260nm检测波长下，爱普列特与各杂质之间能很好分离；辅料峰及溶剂峰不干扰主成分及杂质的检测；且各条件下破坏样品经峰纯度检测，光谱纯度均大于990，各条件下破坏产生的杂质均能与主峰很好地分离，有关物质检测专属性良好；同时对色谱条件参数发生微小变化时对爱普列特片有关物质杂质分离与检查结果没有影响，耐用性良好；使用该高效液相色谱法能够快速、有效、准确和可靠的分离检测出爱普列特片中有关物质，有利于提高爱普列特片的产品质量，提高患者用药安全性。
附图说明
图1是使用不同方法检测爱普列特片有关物质的色谱图，其中，图1a为爱普列特片有关物质-现行标准方法-系统适用性(无辅料)色谱图，图1b为爱普列特片有关物质-本申请方法-系统适用性(无辅料)色谱图，图1c为爱普列特片有关物质-现行标准方法-辅料色谱图，图1d为爱普列特片有关物质-本申请方法-无辅料色谱图，图1e为爱普列特片有关物质-现行标准方法-系统适用性(加辅料)色谱图，图1f为爱普列特片有关物质-本申请方法-系统适用性(加辅料)色谱图；
图2是本发明测定爱普列特片中杂质含量的系统适用性溶液图谱；
图3是破坏性试验中测试色谱图，其中，图3a为爱普列特片-酸破坏图谱，图3b为爱普列特片-碱破坏图谱；图3c为爱普列特片-光破坏图谱，图3d为爱普列特片-热解破坏图谱，图3e为爱普列特片-高温坏图谱，图3f为爱普列特片-氧化破坏图谱；
图4是爱普列特片-对照品溶液稳定性色谱图，其中，图4a为0H爱普列特片-对照品溶液稳定性图谱；图4b为14H爱普列特片-对照品溶液稳定性图谱；
图5是爱普列特片-供试品溶液稳定性色谱图，其中，图5a为0H爱普列特片-供试品溶液稳定性图谱；图5b为14H爱普列特片-供试品溶液稳定性图谱；
图6是爱普列特片-耐用性色谱图，其中，图6a为爱普列特片-耐用性-正常条件色谱图，图6b为爱普列特片-耐用性-不同初始比例(水相∶甲醇＝32∶68)色谱图，图6c为爱普列特片-耐用性-不同初始比例(水相∶甲醇＝28∶72)色谱图，图6d为爱普列特片-耐用性-不同流速(0.95mL/min)色谱图，图6e为爱普列特片-耐用性-不同流速(1.05mL/min)色谱图，图6f为爱普列特片-耐用性-不同柱温(30℃)色谱图，图6g为爱普列特片-耐用性-不同柱温(37℃)色谱图，图6h为爱普列特片-耐用性-不同色谱柱(LC-125)色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明，但这些实施例并不用来限制本发明。
实施例1
爱普列特原料生产工艺过程中会产生工艺副产物杂质A和杂质B；终产品爱普列特片在生产和贮存过程中可能会产生杂质C和杂质D，通过HPLC法同时检测爱普列特及其杂质A、B、C、D的含量。
1、杂质的限度制定
爱普列特每日最大使用剂量为20mg，根据ICH Q3D及《化学药物杂质研究的指导原则》我们将杂质A、杂质B、杂质C、杂质D及最大单杂限度初步拟定为0.2％。
2、现行标准与本申请HPLC方法的比较
表1物质检测方法的比较
Figure BDA0002539986810000031
Figure BDA0002539986810000041
本申请方法中，梯度洗脱的条件为：0-30min，流动相A的体积百分比为30％，流动相B的体积百分比为70％；30-50min，流动相A的体积百分比为17％，流动相B的体积百分比为83％。
3、取分别使用爱普列特工艺变更前原料和工艺变更后原料生产的各三批样品，分别按照现行标准方法和本申请方法进行了有关物质检样，结果见表2，详见附图1。
表2本申请方法与现行标准检测结果比较
Figure BDA0002539986810000042
Figure BDA0002539986810000051
由图谱可以看出，现行标准中杂质B和杂质C无法有效分离，且杂质B和杂质C与未知杂质无法有效分离，且现行标准方法的色谱图中空白辅料峰与杂质峰无法有效分离，在计算杂质时将空白辅料峰均归属为杂质，因此，现行标准方法中单个杂质和总杂检查结果均高于本申请方法检查结果(空白辅料约有0.08％，见附图1)；本申请方法采用梯度洗脱方式，各杂质分离效果更好，杂质与辅料均能有效分离，单个杂质检出含量低于现行标准检出结果；由表2可以看出，扣除辅料峰后，现行标准中和本申请方法的有关物质杂质总量检查结果基本一致，本申请有关物质检查方法更优。
实施例2
1、系统适用性
取杂质A、杂质B、杂质C及杂质D分别置20mL容量瓶，加甲醇稀释制成含各杂质为500μg/mL的杂质储备液。吸取杂质储备液各1mL置不同10mL容量瓶中，加甲醇稀释制成含各杂质均为50μg/mL的杂质定位溶液。
取爱普列特片样品粉末约920mg(含爱普列特约2mg)置20mL容量瓶中，加甲醇溶解制成含各爱普列特2mg/mL的爱普列特定位溶液。
取空白辅料约880mg置20mL容量瓶中，加甲醇溶解制成含空白辅料溶液。
吸取上述各单一杂质浓溶液2mL及爱普列特片样品粉末1.15g置同一25mL容量瓶中，加甲醇稀释制成含各杂质均为4μg/mL、爱普列特2mg/mL的混合溶液作为系统适用性溶液；分别取10μL注入高效液相色谱仪，检测波长为260nm，记录色谱图，进行检测，考察各成分的出峰时间及分离情况。结果见表3，详见附图2。
表3杂质定位及分离度
Figure BDA0002539986810000061
结果表明：在260nm检测波长下，爱普列特与各杂质之间之间的分离度均大于2.0，能很好分离；辅料峰及溶剂峰不干扰主成分及杂质的检测。
2、破坏性试验
(1)未破坏溶液
取样品粉末约920mg置20mL容量瓶中，加甲醇溶解定容后混匀，离心，取上清液作为供试品破坏前溶液。
取空白辅料约880mg置20mL容量瓶中，加甲醇溶解定容后混匀，离心，取上清液作为空白辅料破坏前溶液。
(2)酸破坏溶液
取样品粉末约920mg置20mL容量瓶中，加1mol/L盐酸2mL，置80℃水浴4小时，加1mol/L氢氧化钠2mL中和，加甲醇溶解定容后混匀，离心，取上清液作为供试品酸破坏溶液。
取空白辅料约880mg置20mL容量瓶中，加1mol/L盐酸2mL，置80℃水浴4小时，加1mol/L氢氧化钠2mL中和，加甲醇溶解定容后混匀，离心，取上清液作为空白辅料酸破坏溶液。
(3)碱破坏溶液
取样品粉末约920mg置20mL容量瓶中，加1mol/L氢氧化钠2mL，置室温2小时，加1mol/L盐酸2mL中和，加甲醇溶解定容后混匀，离心，取上清液作为供试品碱破坏溶液。
取空白辅料约880mg置20mL容量瓶中，加1mol/L氢氧化钠2mL，置室温2小时，加1mol/L盐酸2mL中和，加甲醇溶解定容后混匀，离心，取上清液作为空白辅料碱破坏溶液。
(4)氧化破坏溶液
取样品粉末约920mg置20mL容量瓶中，加30％的双氧水2mL，置80℃水浴2小时，加甲醇溶解定容后混匀，离心，取上清液作为供试品氧化破坏溶液。
取空白辅料约880mg置20mL容量瓶中，加30％的双氧水2mL，置80℃水浴2小时，加甲醇溶解定容后混匀，离心，取上清液作为空白辅料氧化破坏溶液。
(5)光照破坏溶液
取未离心供试品破坏前溶液5mL，置紫外灯下光照2小时，离心，取上清液作为供试品光照破坏溶液。
取未离心空白辅料破坏前溶液5mL，置紫外灯下光照2小时，离心，取上清液作为空白辅料光照破坏溶液。
(6)高温破坏溶液
取样品粉末约920mg置20mL容量瓶中，置105℃烘箱中4小时，取出冷却后加甲醇溶解定容后混匀，离心，取上清液作为供试品高温破坏溶液。
取空白辅料约880mg置20mL容量瓶中，置105℃烘箱中4小时，取出冷却后加甲醇溶解定容后混匀，离心，取上清液作为空白辅料高温破坏溶液。
(7)热解破坏溶液
取样品粉末约920mg置20mL容量瓶中，加溶剂溶解后，置105℃烘箱中4小时，取出冷却后加甲醇溶解定容后混匀，离心，取上清液作为供试品热解破坏溶液。
取空白辅料约880mg置20mL容量瓶中，加溶剂溶解后，置105℃烘箱中4小时，取出冷却后加甲醇溶解定容后混匀，离心，取上清液作为空白辅料热解破坏溶液。
(8)酸碱空白溶液：精密量取1mol/L盐酸2mL及1mol/L氢氧化钠2mL，置同一20mL量瓶中，加甲醇定容后摇匀，作为酸碱空白。
(9)氧化空白溶液：精密量取30％H2O2 2mL，置20mL量瓶中，加甲醇定容后摇匀，作为氧化空白。
分别取以上供试液10μL注入色谱仪，记录色谱图。用归一化法计算各杂质峰的量。有关物质数据见下表，详见附图3。
上述样品粉末的制备方法为爱普列特片研磨而成。
3、峰纯度
对各种破坏条件下的供试品溶液，采用二极管阵列测定，进行了峰纯度测定，峰纯度结果见表4。
表4峰纯度结果
破坏条件 破坏前 酸 碱 热解 氧化 光照 高温
峰纯度 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
结论：各条件下破坏样品经峰纯度检测，峰纯度大于990。
4、物料平衡考察
表5物料平衡考察结果
Figure BDA0002539986810000081
通过样品物料平衡数据分析，本品经光照破坏主峰破坏减少量大于其归一化含量下降量(6.2％)，但在可接受标准以内(±10％)；其余破坏条件主峰破坏减少量与其归一化含量下降量基本一致，各相同浓度的样品经不同条件破坏后检出的总峰面积基本相似，说明本申请方法能将降解杂质均有效地检出。
5、破坏降解杂质研究
表6爱普列特片破坏性试验杂质谱(按归一化法统计)
Figure BDA0002539986810000082
Figure BDA0002539986810000091
注：“/”代表未检出。
本品经过高温破坏，已知杂质和未知杂质含量及杂质数量均无明显变化；经酸破坏、碱破坏、光照破坏及热解破坏均能降解出杂质D，经过氧化破坏降解出杂质C。
实施例3
1、定量限和检测限
因爱普列特片有关物质方法与爱普列特原料方法一致，因此定量限和检测限采用原料中的定量限和检测限。具体操作如下：
分别称取杂质C、杂质D及爱普列特适量，精密称定，置同一容量瓶中，加甲醇溶解并稀释制成每1mL中约含各已知杂质和爱普列特各约0.5mg的储备溶液，精密移取储备溶液2mL置200mL量瓶，用甲醇溶解并定容，得含、杂质C、杂质D及爱普列特各约5μg/mL的混合溶液，用稀释法测其定量限(信噪比≥10)、检测限(信噪比≥3)，结果见下表。
表7定量限检测限试验结果
Figure BDA0002539986810000101
结果表明：杂质C、杂质D及爱普列特的定量限与检测限符合有关物质检查要求。
2、线性和范围
储备液：精密称取杂质C、杂质D及爱普列特对照品适量，加甲醇制成含各杂质及爱普列特均为8μg/mL的混合溶液，作为储备液。
线性溶液的制备方法如下：
样品1：取1mL储备液加入20mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；
样品2：取1mL储备液加入10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；
样品3：取2mL储备液加入10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；
样品4：取5mL储备液加入10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；
样品5：储备液。
精密量取上述样品各10μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，以峰面积A为纵坐标、浓度C为横坐标作线性回归。结果见表8至表11。
表8杂质C线性测定结果
Figure BDA0002539986810000111
表9杂质D线性测定结果
Figure BDA0002539986810000112
表10爱普列特线性测定结果
Figure BDA0002539986810000113
表11已知杂质校正因子
名称 斜率 相对校正因子
爱普列特 0.39709 1.00
杂质C 0.07984 4.97
杂质D 0.39208 1.01
结果表明：杂质C在0.378～7.550μg/mL范围内，杂质D在0.444～8.879μg/mL范围内，爱普列特在0.473～9.456μg/mL范围内，峰面积与测定浓度呈良好线性关系。杂质C和杂质D的相对校正因子均在0.2～5范围内，通过在方法验证过程中使用代入校正因子的自身对照法计算有关物质含量。
3、进样精密度
精密称取杂质C、杂质D及爱普列特对照品适量，加甲醇制成含各杂质及爱普列特均为4μg/mL的混合溶液，作为进样精密度溶液。精密量取10μL注入液相色谱仪，连续进样6次，记录峰面积。结果见下表。
表12进样精密度试验结果
进样精密度 杂质C 杂质D 爱普列特
1 0.26051 1.53191 1.69308
2 0.26212 1.53521 1.68377
3 0.26112 1.52901 1.6851
4 0.26646 1.53191 1.68721
5 0.26051 1.51726 1.68936
6 0.26480 1.52342 1.67913
RSD(％) 0.95 0.43 0.28
结论：连续进样6针，主成分和各杂质进样精密度良好(相对标准偏差RSD＜2％)。
4、溶液稳定性
1)杂质溶液稳定性
取进样精密度溶液，精密量取10μl分别于0小时、2小时、6小时、10小时、14小时注入高效液相色谱仪，考察其日内稳定性。结果见表13，详见附图4。
表13杂质溶液稳定性
Figure BDA0002539986810000121
Figure BDA0002539986810000131
结论：上述各杂质及主成分在甲醇中于14小时内稳定性良好。
2)供试品溶液稳定性
取样品粉末，精密称定，加甲醇溶解稀释成每mL含爱普列特约2mg的溶液，离心，取上清液作为供试品溶液，分别在于0小时、7小时、14小时进样，考察其杂质日内稳定性。用归一化法计算各杂质的百分含量，结果见表14，详见附图5。
表14供试品溶液稳定性
Figure BDA0002539986810000132
结论：供试品溶液14小时内较稳定，供试品溶液稳定性良好。
5、重复性
取样品粉末，按照本申请方法，重复测定6次。检查结果见表15。
表15重复性结果
Figure BDA0002539986810000141
结论：样品按重复性要求测定6次，重复性良好。
6、加样回收率
分别称取杂质C及杂质D适量，精密称定，置同一容量瓶中，加甲醇溶解并稀释制成每1mL中杂质C及杂质D各约8μg/mL的回收率储备液。精密称取样品粉末约920mg置各20mL量瓶中，精密吸取上述混合储备液按下表稀释制成50％、100％和200％浓度的溶液，每个浓度配制3份。具体配置方法如下：
50％浓度的回收率溶液：取5mL回收率储备液加入到20mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。
100％浓度的回收率溶液：取10mL回收率储备液加入到20mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。
200％浓度的回收率溶液：取回收率储备液溶解并稀释至刻度，摇匀。
吸取上述样品各10μL进样，记录各已知杂质峰面积，并计算各已知杂质回收率及RSD。结果表16-表17。
表16杂质C加样回收率实验结果
Figure BDA0002539986810000142
Figure BDA0002539986810000151
表17杂质D加样回收率实验结果
Figure BDA0002539986810000152
其中：
原始量＝称样量×杂质含量(以重复性数据计)
测得加入量＝测得总量-已知量
回收率＝〔测得加入量/加入量〕×100％
结果表明：杂质C回收率平均值为98.1％，RSD值为5.8％，杂质D回收率平均值为94.2％，RSD值为2.5％，结果在可接受的范围内。
7、耐用性
将本申请测定方法色谱条件分别作微小变动(柱温、流速、流动相初始比例及色谱柱)，考察在不同条件下分离度及本品杂质含量测定情况。具体试验内容及结果详见表18-表19，详见图6。
表18耐用性试验分离度结果
Figure BDA0002539986810000161
表19耐用性试验检样结果
Figure BDA0002539986810000162
结果表明，本申请方法色谱条件参数发生微小变化时对爱普列特片有关物质杂质分离与检查结果没有影响，耐用性良好。
8、中间精密度
取爱普列特样品粉末，由同一操作人员，于不同时间对同一批号样品进行有关物质检查；由不同操作人员，于不同时间对同一批号样品进行有关物质检查；由同一操作人员，于不同仪器、不同时间对同一批号样品进行有关物质检查，检查结果见表20。
表20中间精密度试验结果
Figure BDA0002539986810000171
结果表明，由不同人员、不同仪器、在不同时间测定本品有关物质，测定结果几乎没有变化，中间精密度良好。
需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种利用HPLC测定爱普列特片中杂质含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）配置供试品溶液和对照溶液；所述供试品溶液的制备方法为：精密称定爱普列特细粉，加甲醇溶解稀释成每mL含爱普列特2mg的溶液，离心，取上清液作为供试品溶液；所述对照溶液的制备方法为：精密量取供试品溶液，加甲醇稀释成每mL含爱普列特4μg的溶液，作为对照溶液；
2）设置高效液相检测条件：色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂，规格为250mm×4.6mm，填料粒径为5μm，柱温为35℃，以体积比为1000:25:1的水、冰醋酸、二乙胺的混合液为流动相A，以甲醇为流动相B，流速为1.0 mL/min进行梯度洗脱；所述梯度洗脱的条件为：0-30min，流动相A的体积百分比为30%，流动相B的体积百分比为70%；30-50min，流动相A的体积百分比为17%，流动相B的体积百分比为83%；
3）分别精密吸取供试品溶液和对照溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图；所述供试品溶液与对照溶液的进样量为10μL；所述液相色谱仪的紫外检测器的检测波长为260nm。
2.根据权利要求1所述的利用HPLC测定爱普列特片中杂质含量的方法，其特征在于，供试品溶液的色谱图中，单个杂质峰面积不得大于对照溶液的主峰面积，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的5倍。
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