CN111607666A - 狗牙根est-ssr分子标记引物及应用 - Google Patents

狗牙根est-ssr分子标记引物及应用 Download PDF

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陈志坚
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Abstract

本发明公开了狗牙根EST‑SSR分子标记引物及应用，所述引物包括50个引物对，序列如SEQ ID NO：1～100所示；所述的引物在狗牙根核心种质群体分析中的应用。本发明从125对狗牙根EST‑SSR引物中筛选出50对引物，筛选出的引物数量大、多态性好，条带清晰，主带明显，该50对EST‑SSR引物在66份狗牙根供试材料中均能扩增出多态性较好的条带，且扩增稳定、重复性好，可用于狗牙根核心种质群体遗传多样性和群体结构分析，对于种质资源创新和有效保护利用以及品种改良、新品种选用等具有十分重要的意义和应用前景。

Description

狗牙根EST-SSR分子标记引物及应用
技术领域
本发明属于SSR分析标记技术领域，具体涉及狗牙根EST-SSR分子标记引物及应用。
背景技术
狗牙根(Cynodon Richard)属于禾本科画眉草亚科虎尾草族的C4型多年生草本植物，是世界三大暖季型草坪草之一，也是一种优良牧草(Harlan，1969)狗牙根属植物分为9种10变种(Taliaferro，1995)。大部分狗牙根起源于非洲地区，主要分布在温暖潮湿的热带或亚热带地区，也有部分狗牙根分布在温带地区(Rochecouste，1962；Wofford andBaltensperger，1985；Harlan，1970)。其中普通狗牙根(C.dactylon var.dactylon)属于世界广布种，水平分布范围为53°N-45°S；垂直分布上，既能生长在海平面以下也能生长在海拔4000m的喜马拉雅山上。中国有2种1变种，分布是普通狗牙根(C.dactylon)和弯穗狗牙根(C.radiatus)2个种，以及双花狗牙根(C.dactylon var.biforus)1个变种(Flora of(China Editorial Committee，2006))。
简单重复序列(SSR)广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，由于SSR的重复次数不同和重复程度不同，使其呈现高度的多态性。与其它分子标记技术相比，SSR标记具有多态信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特点，被认为是可靠性最高的分子标记类型之一。但是使用该技术的前提是要有相应的SSR引物。SSR标记可分为基因组SSR(gSSR)和转录组SSR(EST-SSR)，与gSSR标记相比，从EST数据库中获得SSR建立EST-SSR标记更经济，效率更高。EST-SSR标记来源于DNA的转录区域，相比于gSSR标记，EST-SSR种间通用性更高，即基于一种材料开发的EST-SSR引物，往往在一个属内甚至属间均能适用。更重要的是，该标记能直接和功能基因相关，在分子标记辅助育种的相关研究如遗传连锁图构建、重要性状相关标记关联分析、分离和鉴定新基因等中都有极高的应用价值。
经检索，尚未有EST-SSR分子标记对狗牙根核心种质分析的研究。因此，筛选出狗牙根EST-SSR分子标记引物将其应用于核心种质的研究，对于种质资源创新和有效保护利用以及品种改良、新品种选用等具有十分重要的意义和应用前景。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种狗牙根EST-SSR分子标记引物；
本发明的另一目的在于提供EST-SSR分子标记引物在狗牙根核心种质群体分析中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：狗牙根EST-SSR分子标记引物，所述引物包括50个引物对，序列如SEQ ID NO：1～100所示。
上述引物在狗牙根核心种质群体分析中的应用。
进一步地，所述应用为核心种质群体遗传多样性分析中的应用。
进一步地，所述应用为核心种质群体结构分析中的应用。
包含SEQ ID NO：1～100所示任一引物的EST-SSR反应体系，所述反应体系总体积为12μL，其中DNA模板用量为80～100ng，正向引物为1×10-6mmol/L，反向引物为1×10- 6mmol/L，2×Supermix为6μL，ddH2O为3μL。
进一步地，PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性50s，55～60℃变性45s，72℃延伸1min，共循环30～35次。
一种分析狗牙根核心种质群体遗传多样性和群体结构的方法，它包括以下步骤：
S1.提取狗牙根核心种质的DNA，并进行质量和纯度的检测；
S2.应用SEQ ID NO：1～100所示的引物对核心种质的DNA进行EST-SSR的PCR扩增；
S3.对扩增结果进行EST-SSR数据统计，在相同迁移位置上，有带赋值为1，无带赋值0，缺失记为9，建立数据库，进行群体遗传多样性和群体结构分析。
群体遗传多样性分析具体为：应用Popgene软件对狗牙根遗传多样性指标进行统计分析，计算观察等位基因数(Observed number of alleles，na*)、有效等位基因数(Effective numberof alleles，ne*)、Nei's基因多样性(H)、Shannon's信息指数(I*)、多态性信息含量(PIC range，PIC)等。
群体结构分析具体为：利用Sturcture2.3.4软件对狗牙根群体结构进行亚群划分，计算出Q值(第i参试样本其基因组变异源于第k群体的概率)，将其作为关联分析时的协变量。Q的阈值为75％。以Q值为基础绘制出群体结构图。先设定不同的划分群体数目，从K＝2到K＝7，并假定位点都是独立的，将MCMC开始时的不作数迭代(Lengthof burn-inperiod)设为50000次，再将不作数迭代后的MCMC设为100000次，每个K值重复计算3次。K值的确定是将Sturcture软件运行的结果result文件夹用zip格式压缩后打包上传至Sturcture Harverster(网站网址：http://taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/)自动进行计算，得到最佳K值和整理好的Clummp输入格式文件。然后利用CLUMPP软件对选定K值的3次重复运算结果进行Q值综合，将综合结果利用Structure软件进行群体遗传结构作图。
进一步地，所述EST-SSR的反应体系的总体积为12μL，其中DNA模板用量为80～100ng，正向引物为1×10-6mmol/L，反向引物为1×10-6mmol/L，2×Supermix为6μL，ddH2O为3μL。
进一步地，所述PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性50s，55～60℃变性45s，72℃延伸1min，共循环30～35次。
本发明具有以下优点：本发明从125对狗牙根EST-SSR引物中筛选出50对引物，筛选出的引物数量大、多态性好，条带清晰，主带明显，该50对EST-SSR引物在66份狗牙根供试材料中均能扩增出多态性较好的条带，且扩增稳定、重复性好，可用于狗牙根核心种质群体遗传多样性和群体结构分析，对于种质资源创新和有效保护利用以及品种改良、新品种选用等具有十分重要的意义和应用前景。
附图说明
图1为狗牙根EST-SSR引物筛选电泳图(ES089-ES096)，图中，M是50bp marker；从左至右引物依次有ES089、ES090、ES091、ES092、ES093、ES094、ES095、ES096；
图2为引物ES036在66份狗牙根种质的EST-SSR电泳图，图中，1-66号为材料编号，M:50bp Plus DNA Ladder；
图3为引物ES060在66份狗牙根种质的EST-SSR电泳图，图中，1-66号为材料编号，M:50bp Plus DNA Ladder；
图4为引物ES006在66份狗牙根种质的EST-SSR电泳图，图中，1-66号为材料编号，M:50bp Plus DNA Ladder；
图5为基于EST-SSR分析的66份狗牙根UPGMA聚类图；
图6为66份狗牙根群体结构；
图7为主成分分析图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
实施例
1.试验材料
以中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所牧草研究中心种质圃保存的66份狗牙根核心种质为材料。
2.实验方法
2.1 DNA提取与检测
采集狗牙根嫩叶，将叶片剪碎后，在研钵中加入液氮研磨成粉末，根据改良的CTAB法提取狗牙根基因组DNA。然后采用1％的琼脂糖凝胶电泳方法来检测DNA样品的质量及DNA纯度，利用核酸蛋白测定仪测定DNA的样品浓度和OD值，在-20℃低温保存备用。
2.2引物筛选
参照文献，选狗牙根EST-SSR引物序列125对，由金斯瑞生物科技公司合成。选取了地理位置较远的6份材料B515、B521、B535、B567、B005，对引物进行筛选，筛选多态性好，条带清晰，主带明显的引物。
2.3 EST-SSR反应体系
EST-SSR反应体系为12μL体系中包含DNA80-100ng，正向引物Primer 1为1×10- 6mmol/L，反向引物Primer 2为1×10-6mmol/L，2×Supermix为6μL，ddH2O为3μL。
2.4 PCR扩增程序
PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性50s，55～60℃变性45s，72℃延伸1min，共循环30～35次，4℃保存。利用8％的非变性聚丙烯酰胺胶凝胶电泳方法将PCR扩增产物进行电泳检测。调节电压220V，电泳跑2h左右，电泳完成后快速银染、NaOH和甲醛溶液显色检测，在白光灯下用相机对电泳图进行拍照，记录结果。
2.5 EST-SSR数据统计分析
在相同迁移位置上，有带赋值为1，无带赋值0，缺失记为9，建立数据库，进行数据分析。
2.5.1群体遗传多样性分析
应用Popgene软件对狗牙根遗传多样性指标进行统计分析，计算观察等位基因数(Observed number of alleles，na*)、有效等位基因数(Effective numberof alleles，ne*)、Nei's基因多样性(H)、Shannon's信息指数(I*)、多态性信息含量(PIC range，PIC)等。
2.5.2群体结构分析
利用Sturcture2.3.4软件对狗牙根群体结构进行亚群划分，计算出Q值(第i参试样本其基因组变异源于第k群体的概率)，将其作为关联分析时的协变量。Q的阈值为75％。以Q值为基础绘制出群体结构图。先设定不同的划分群体数目，从K＝2到K＝7，并假定位点都是独立的，将MCMC开始时的不作数迭代(Lengthof burn-in period)设为50000次，再将不作数迭代后的MCMC设为100000次，每个K值重复计算3次。K值的确定是将Sturcture软件运行的结果result文件夹用zip格式压缩后打包上传至Sturcture Harverster(网站网址：http://taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/)自动进行计算，得到最佳K值和整理好的Clummp输入格式文件。然后利用CLUMPP软件对选定K值的3次重复运算结果进行Q值综合，将综合结果利用Structure软件进行群体遗传结构作图。
3 结果分析
3.1 引物筛选
选取了地理位置较远的6份材料B515、B521、B535、B567、B5，从125对EST-SSR引物中筛选出了50对多态性好、条带清晰、主带明显的引物，引物序列见表1。部分引物筛选结果见图1。引物筛选材料从左到右依次是B515、B521、B535、B567、B5，选用50bp的marker，将每对引物重复筛选2～3次。图1从左至右引物依次为ES089、ES090、ES091、ES092、ES093、ES094、ES095、ES096。
表1：筛选出的EST-SSR引物序列
Figure BDA0002590586050000051
Figure BDA0002590586050000061
3.2狗牙根EST-SSR标记的多态性分析
利用50对EST-SSR引物对66份狗牙根基因组DNA进行扩增，扩增结果见表2，从表2可知，共扩增得到184条较为清晰的条带，其中多态性较好的有154条，多态性比率(PPB)为约81.7％。引物扩增出的条带数在2～7条之间，扩增出的多态性条带数在1～7条之间，平均每个引物扩增出3.68个条带，平均每个引物扩增出的多态性条带为3.08条，其中引物ES011的多态性条带最多，为7条。所扩增出的DNA片段大部分集中在50bp～300bp之间。其中，多态性百分率(PPB)最高的为分子标记共有22个，分别为标记ES005、ES006、ES011、ES020、ES021、ES026、ES034、ES037、ES051、ES053、ES064、ES068、ES070、ES075、ES079、ES082、ES089、ES093、ES095、ES096、ES098、ES102，均为100％；多态性百分率(PPB)最低的的标记有3个，分别是ES039、ES048、ES069，多态性百分率均为50％。引物ES036的EST-SSR电泳图如图2所示，引物ES060的EST-SSR电泳图如图3所示，引物ES006的EST-SSR电泳图如图4所示。
表2：EST-SSR引物扩增结果
Figure BDA0002590586050000071
Figure BDA0002590586050000081
3.3遗传多样性分析
遗传多样性分析结果如表3所示，由表3可知，共扩增出184个位点，每对引物检测到2～7个等位基因，平均每对EST-SSR引物检测到3.68个等位基因。其中观察等位基因(Na)最多的是ES011，最少的是ES039、ES048、ES053、ES068和ES076。50个多态性EST-SSR标记的观察等位基因(Na)变异范围为2～6个，平均值为3.720；有效等位基因(Ne)变异范围1.031～3.638，平均值为2.175；Nei’s基因多样性平均值为0.481，变异范围0.030～0.725；Shaanno信息指数(I)变异范围0.079～1.390，平均值为0.876；PIC值的变异范围为0.029～0.676，平均值为0.433。各遗传多样性参数均表示ES093的多态性最高，ES076的多态性最低。
表3：66份狗牙根种质遗传多样性EST-SSR分析
Figure BDA0002590586050000082
Figure BDA0002590586050000091
3.4遗传相似系数分析
基于50个多态性EST-SSR标记的带谱，利用NTSYS软件分析66份狗牙根材料的遗传多样性，研究显示，供试材料间的遗传相似系数介于0.5556～0.9730，平均为0.7542。其中B398与B399的遗传相似性系数最大(0.9730)，而B114与A084的遗传相似性系数最小(0.5556)。从各狗牙根种质间平均相似系数来看，B491与其他材料的平均相似性系数最低，为0.6256，表明B491与其他材料的亲缘关系最远；B48与与其他材料的平均相似性系数最高，为0.8293，其次为B522，为0.8283。
3.5聚类分析
对供试的66份狗牙根材料通过UPGMA法进行聚类分析，如图5所示，由图5可以看出，在0.736处将66份狗牙根材料可以划分为四大类群。第Ⅰ类群有55份材料。又将第Ⅰ类群分为A、B和C三个亚类。其中A类包括B525、B567、B494和B506等52份材料，这些材料主要分布在国外，华东地区和华南地区，其中B525和B567聚在一起，它们都分布在国外，B类有B499，A084这2份材料，从地理位置来看，它们相距较远，B499来自国外，A084来自陕西，从形态特征观察，它们外部形状比较相似。C类有B194这1份材料，来自华南地区。第Ⅱ类有3份材料，分别是B398、B399、A432，其中B398和B399都分布在湖南长沙，地理来源一致，其中来自美国的A432划分在这一组。第Ⅲ类有2份材料，分别是B535、B450，这两份材料分布来自西南地区和来自南非，从地域来看，来源相距较远，可能这两份材料存在一致的类型。第Ⅳ类有5份材料，分别是B035、B114、B180、B491、B518。在形态特征上观察它们都属于弯穗狗牙根，其中B114和B180聚在一起，从地域条件上它们都分布在海南地区；这些材料外部性状类似，以标记手段进行聚类的结果与表型的聚类具有较好的一致性。从聚类结果也可以看出，EST-SSR标记对材料的区分能力及鉴别的准确性比较好。
3.6群体结构分析
根据实验所得的EST-SSR数据，使用Sturcture2.3.4软件对供试66份狗牙根材料的184个EST-SSR位点信息进行分析，群体结构分析结果将66份狗牙根材料划分为3个类群。66份狗牙根的遗传结构图如图6所示，图中1代表类群1、2代表类群2、3代表类群3这3个群体，参照刘丽华等(2009)的研究，将Q值＞0.6的共有61份材料(92.42％)材料划归到相应的类群中，说明其遗传结构较其他材料相对单一：而剩余5份狗牙根材料可能具有较复杂的遗传结构来源，对其类群不能准确划分，可将其划归为混合类群，如表4所示，由表4可知，类群1的狗牙根材料有14份(22.95％)，其次类群2的狗牙根材料最多，有42份(68.85％)，类群3的材料最少只有5份(8.20％)。在所有的狗牙根材料中，同种狗牙根材料遗传组分及划分类群也存在差异，比如弯穗狗牙根有7份材料，其中6个被划分到3个不同的类群中，1个则划分到混合类群中；双花狗牙根材料被划归到类群2中，栽培品种有3份，这些材料全被划归到类群2中，说明这些狗牙根材料间遗传结构差别较大。
表4：66份狗牙根分成3个不同类群的Q值
Figure BDA0002590586050000101
Figure BDA0002590586050000111
Figure BDA0002590586050000121
“—”代表混合群体。
3.7主成分分析
基于遗传相似性系数，对66分狗牙根种质进行主成分分析，按照主成分选取原则，选取了3个主成分，如图7所示，主成分1、主成分2和主成分3的特征值分别是50.79、1.78和1.15，贡献率分别是76.96％、2.70％和1.74％，累积贡献率分别是76.96％、79.66％和81.40，如表5所示。与UPGMA的分析结果大体相似。
表5：主成分分析的特征值和累积贡献率
Figure BDA0002590586050000122
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所
<120> 狗牙根EST-SSR分子标记引物及应用
<130> 1
<160> 100
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 1
tctgagtacc gctgctgcta 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 2
aacacaacag ccagcgaag 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 3
cctcctcgtc ttctcctcct 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 4
caaagttcgg taggcttcca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 5
aaaccctaac cccaaaacca 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 6
ggctcggagg agacgatg 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 7
gtgtgagggg agcgtgtaga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 8
ttgttcttgg ctttggtgtg 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 9
cttcgggccg tcaacaac 18
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 10
agccacgtcc cagagagat 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 11
acaccgcagt accaggagag 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 12
tgcatcgagt cacgtgagat a 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 13
tcgagcttaa tggctcggta 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 14
cggccattga ttatctgtga 20
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 15
tgattgtccg aggtcagca 19
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 16
ggtgtgaacc atcagcagtt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 17
tgctcaaact tgctttcctg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 18
ccgtgcaatc gtagtaccag 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 19
ttggccagtc atgtattttc c 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 20
aacatggagt ctggtgctca 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 21
gccgctctgt gaatatgctt 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 22
taacaccaca acgaccttcg 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 23
ggctctctcc ctctcacaca 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 24
ccagctcagc tacatgacca 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 25
acctctttgg attggtgcaa 20
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 26
tcttcctaag ccacatcaag g 21
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 27
gcctactcca tggaagagtc ag 22
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 28
cgaccactgc ttcatcacc 19
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 29
gcgcagctga tagaggttgt 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 30
acaggcggct ttcatcttct 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 31
aagtggtcag gatttcaacg a 21
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 32
gcaattacgc aatggacaaa 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 33
tcattgagca tgcagtacca 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 34
accctgcttt cctttggatt 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 35
gaggcatgtc gcttcttctt 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 36
ctgttggcac gaatgaatgt 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 37
tacagcagca gagcagcaag 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 38
catcttcctc ctccttgtcg 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 39
atgcattcca gactccatcc 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 40
gccgccagag atgaatacac 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 41
cggaatcgac ctcaacaaga 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 42
gaccatgcct tagccttagc 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 43
ctgatggtga tgcaatggac 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 44
acattttcct gctcctgtgc 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 45
gtaagcagtc gcaaccacag 20
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 46
catactgccc acccatctg 19
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 47
tcaagaagcc accaccctac 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 48
tcgtgcttga tgaggatgtg 20
<210> 49
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 49
acggtgctgt gcttccac 18
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 50
tggtcatcac gtagctctgg 20
<210> 51
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 51
gggccgccat ctcattc 17
<210> 52
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 52
acgccatggc aggagac 17
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 53
cggtgagaag gagatcgaga 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 54
cctgctgtgc cattgtattg 20
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 55
ctcatcccac atataaccat cc 22
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 56
gcgaacaaag gagcaagaga 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 57
gccgtaccac tgaccgatta 20
<210> 58
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 58
catcgtccac aacccaatc 19
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 59
ccaagcatac aacccgtaca 20
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 60
taccgacgcc gaagacata 19
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 61
ctcctgaggg gttctcactg 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 62
cggagtaggt gctgctgatt 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 63
gatgcggcaa tgtgttctta 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 64
atggccaaaa ccgtagtaca 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 65
cggtccgcta gcttcaaata 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 66
cgtacaggcg gtgtacaaac 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 67
gggagagcta gcctggattc 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 68
gacttgcccc agaaaatcaa 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 69
gcgttccaga agttgcagtt 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 70
agatcttctc tccggccttg 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 71
gcaccttcct cttgctgtct 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 72
tgctgcaact acggtgatgt 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 73
gcgtgatgct gatgttgttc 20
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 74
gcatcacaat gctaagggaa t 21
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 75
catctctgct tcctcgctct 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 76
cggacaatgt tgatcacagc 20
<210> 77
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 77
cagaacttcc gcaacatcg 19
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 78
tatggatcca ccccataacg 20
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 79
aacacactct cgaaccagac c 21
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 80
cctgagatgt ggcaacagtg 20
<210> 81
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 81
cgcgctatct ccacaacc 18
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 82
gtctccatgc gtgaggtgta 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 83
aaggttgtgg acaaggatgg 20
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 84
ggggtccaac aactcaaaag 20
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 85
aacgtccatc ctctcatcca 20
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 86
tcgagttcga gtcgagttgt 20
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 87
caagctcagc aatttcacca 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 88
atccacctgt gtagcccaga 20
<210> 89
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 89
gagatcgggg tggggaag 18
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 90
cagagcaggt catggtgttg 20
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 91
caggaacgtg aagtgacgag 20
<210> 92
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 92
agaggaatcg cacgtaccc 19
<210> 93
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 93
ccgcccatcc gtttc 15
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 94
cgaagatctg catcttgacg 20
<210> 95
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 95
gccgcctcct acctcaagt 19
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 96
gatgagtcgg tccttcttgg 20
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 97
gaggcctctt ggtggataaa 20
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 98
agctcgctct tgagctatgg 20
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 99
ccctctatag aagcttttgt 20
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 100
ctcttgccaa taattacacg 20

Claims (9)

1.狗牙根EST-SSR分子标记引物，其特征在于，所述引物包括50个引物对，序列如SEQID NO：1～100所示。
2.权利要求1所述的引物在狗牙根核心种质群体分析中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为核心种质群体遗传多样性分析中的应用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为核心种质群体结构分析中的应用。
5.包含权利要求1中SEQ ID NO：1～100所示任一引物的EST-SSR反应体系，其特征在于，所述反应体系总体积为12μL，其中DNA模板用量为80～100ng，正向引物为1×10-6mmol/L，反向引物为1×10-6mmol/L，2×Supermix为6μL，ddH2O为3μL。
6.根据权利要求5所述的EST-SSR反应体系，其特征在于，PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性50s，55～60℃变性45s，72℃延伸1min，共循环30～35次。
7.一种分析狗牙根核心种质群体遗传多样性和群体结构的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
S1.提取狗牙根核心种质的DNA，并进行质量和纯度的检测；
S2.应用SEQ ID NO：1～100所示的引物对核心种质的DNA进行EST-SSR的PCR扩增；
S3.对扩增结果进行EST-SSR数据统计，在相同迁移位置上，有带赋值为1，无带赋值0，缺失记为9，建立数据库，进行群体遗传多样性和群体结构分析。
8.根据权利要求7所述的一种分析狗牙根核心种质群体遗传多样性和群体结构的方法，其特征在于，所述EST-SSR的反应体系的总体积为12μL，其中DNA模板用量为80～100ng，正向引物为1×10-6mmol/L，反向引物为1×10-6mmol/L，2×Supermix为6μL，ddH2O为3μL。
9.根据权利要求7所述的一种分析狗牙根核心种质群体遗传多样性和群体结构的方法，其特征在于，所述PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性50s，55～60℃变性45s，72℃延伸1min，共循环30～35次。
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