CN116970730A - 一种鉴别不同结缕草种质亲缘关系的引物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别不同结缕草种质亲缘关系的引物，属于结缕草种质亲缘关系鉴定技术领域，引物序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.12所示，将该引物用于制备试剂盒，可以特定对结缕草的亲缘关系进行鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及结缕草种质亲缘关系鉴别技术领域，更具体地说是涉及一种鉴别不同结缕草种质亲缘关系的引物及应用。
背景技术
结缕草属(Zoysia Willd.)隶属于禾本科多年生低矮草本植物，一般分为11个种，多个变种以及变型，其中大多数结缕草可用于运动场草坪、休憩草坪及保土草坪等的建植。结缕草属植物在我国分布有5个种，2个变种和1个变型。5个种分别是结缕草(Z.japonicaSteud.)、细叶结缕草(Z.tenuiflia willd.exTrin.)、沟叶结缕草(Z.matrella(L.)Merr.)、大穗结缕草(Z.macorostachya Franch.etSva.)以及中华结缕草(Z.sinicaHance)；2个变种分别是青结缕草(Z.japon ica var.pollida Nakai et Honda)和长花结缕草(Z.sinica var.nipponica Ohwi.)；1个变型是大穗日本结缕草(Z.japonicaf.macrostachya H.D.Dung et L.J.Gong)。其中结缕草是该属中分布范围最广、应用面积最大的一个种，也是中国结缕草属的代表种。
近年来，分子标记技术在草坪草种质资源的研究中的应用越来越广泛。在结缕草属植物的研究中也有广泛的应用。EST-SSR(Expressed Sequence Tag-Simple sequencerepeat)是基于表达序列标签开发微卫星的一种分子标记，与基因组SSR标记相比具有更高的转译能力。由于EST-SSR标记是一类功能标记，是以推测出EST序列功能为基础获得的。目前，EST-SSR被广泛应用于植物基因组学研究，遗传图谱的构建、比较作图、遗传多样性的评价等方面。很少应用于结缕草属种质资源的研究。
因此，如何将EST-SSR应用于结缕草的分子标记中，并开发鉴定不同结缕草种质亲缘关系的引物是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，基于EST-SSR分子标记的诸多优越性，本发明采用EST-SSR分子标记的方法对不同地理来源的结缕草属种质进行遗传变异研究，从分子水平上探讨了结缕草种质资源的遗传多样性，为结缕草属种质资源的研究奠定了良好的基础。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种鉴别不同结缕草种质亲缘关系的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.11～SEQID NO.12所示；
上游引物F：5’-TGCTCAAACTTGCTTTCCTG-3’，如SEQ ID NO.11所示；
下游引物R：5’-CCGTGCAATCGTAGTACCAG-3’，如SEQ ID NO.12所示。
优选地，所述引物序列还包括：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.40所述的引物中的任意两组引物。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的引物在制备鉴别不同种质结缕草亲缘关系的试剂盒中的应用。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种鉴别不同结缕草种质亲缘关系的试剂盒，包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.40所示引物中任意一组或三组的结合；具体为：
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种鉴别不同种质结缕草亲缘关系的方法，以所述试剂盒进行检测。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种鉴别不同结缕草种质亲缘关系的方法，过程包括：
1)利用筛选出的20对EST-SSR引物中的任意3对引物对43份结缕草属种质进行EST-SSR的PCR扩增，得到多态性条带，并观察每对引物扩增出的等位基因数量；
2)根据EST-SSR引物的多态性条带，利用NTSYS软件对43份结缕草属种质进行遗传多样性研究，确定遗传系数，分析亲缘关系的远近。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种鉴别不同种质结缕草亲缘关系的引物，该引物可以对不同种质结缕草间的亲缘关系进行鉴定，为后续研究结缕草的遗传性能奠定了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为EST-SSR分析的43份结缕草属UPGMA聚类图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1引物筛选
1)DNA的提取与验证
采用改良CTAB法提取43份结缕草属种质的DNA，将提取的DNA用1％的琼脂糖凝胶电泳检测提取的纯度和质量，利用核酸蛋白仪测定DNA浓度和OD值，将DNA稀释到约50ng/μL，最后放入-20℃冰箱中保存备用。
2)引物的筛选
选取EST-SSR引物共125对(表5)。选择来源不同的6份结缕草种质(4号、9号、31号、37号、40号、42号)，对125对引物进行筛选，最终筛选出了20对条带清晰、多态性好、主带明显的EST-SSR标记，引物序列见表1；
表1
3)PCR扩增和电泳检测
PCR反应体系见表2。扩增过程在PCR仪上进行，扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环35次；最后72℃延伸5min，4℃保存，PCR扩增产物用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳完成后，利用AgNO3染色、NaOH和甲醛显色，最后拍照记录。
表2 PCR扩增反应体系
结果为：利用筛选出来的20对EST-SSR引物对43份结缕草属种质DNA进行扩增，共得到91条条带，其中有多态性条带78条，多态性条带比例为86.65％(表3)，单个引物扩增出来的条带在1-8条之间，平均每个引物扩增出4.55个条带，平均每个引物扩增出3.90个多态性条带，其中，编号ES-091引物扩增的条带最多，为8条，多态性条带比例最高的引物有10个：ES-001、ES-007、ES-009、ES-013、ES-056、ES-066、ES-089、ES-092、ES-097、ES-100，均为100％，多态性条带比例最低的引物有1个：ES-021，多态性为50％。
表3 EST-SSR引物扩增结果
实施例2结缕草属种质EST-SSR群体遗传多样性分析
利用实施例1筛选出的20对EST-SSR引物对43份结缕草属种质进行EST-SSR的PCR扩增(表4)，统计清晰稳定的电泳条带，有带赋值1，无带赋值0，缺少则赋值9，建立数据库，用于条带多态性比较和聚类分析。利用POPGEN32软件对结缕草属种质遗传多样性进行统计分析，计算等位基因数(Na)、等位基因频率、Shannon信息指数(I)，观测杂合度Ho，期望杂合度He，Nei基因多样性指数(H)。采用NTSYS软件，对43份材料进行UPGMA系统聚类，分析材料间和地理种源间材料的遗传分化关系。
结果一共扩增出了75个等位基因，每对引物检测出1-6个等位基因，平均每对EST-SSR引物检测到3.75个等位基因。20对EST-SSR的观测杂合度的变化范围在：0-1，平均为0.193，期望杂合度的变化范围在：0-0.786，平均为0.559，其中ES-013的观测杂合度最大为1，ES-070的期望杂合度最大为0.786，20对EST-SSR引物的Shaanno信息指数变化范围为：0-1.561，平均为0.986，其中Shaanno信息指数最大的是ES-012，这说明ES-012具有很高的多态性检测效率。
表4 43份结缕草属种质EST-SSR遗传多样性分析
实施例3遗传相似系数分析
根据20对EST-SSR引物的多态性条带，利用NTSYS软件对43份结缕草属材料进行遗传多样性研究，结果表明，材料之间的遗传相似系数在0.530-0.864，平均为0.711，其中遗传系数最大(0.864)的两份材料是20号和19号，遗传系数最小(0.530)的两份材料是4号和36号。
实施例4聚类分析验证引物的功能
对供试的43份结缕草属种质通过UPGMA法进行聚类分析，如图1所示，在0.80处将43份结缕草属种质划分为4个类群：其中第Ⅰ类有编号1、编号13等28份材料，这些材料12份来自海南，9份来自山东，3份来自江苏，1份来自安徽，1份来自福建，1份来自广东，1份来自斯里兰卡，第Ⅱ类有编号30、编号31等13份材料，这些材料有5份来自山东，3份来自海南，江苏、广东各2份，1份来自浙江，第Ⅲ类有来自浙江的24号1份材料，第Ⅳ也只有来自上海的42号1份材料。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (6)
1.一种鉴别不同结缕草种质亲缘关系的引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ IDNO.11～SEQ ID NO.12所示；
上游引物F：5’-TGCTCAAACTTGCTTTCCTG-3’，如SEQ ID NO.11所示；
下游引物R：5’-CCGTGCAATCGTAGTACCAG-3’，如SEQ ID NO.12所示。
2.根据权利要求1所述的一种鉴别不同结缕草种质亲缘关系的引物，其特征在于，所述引物序列还包括：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.40所述的引物中的任意两组引物。
3.权利要求1或2所述的引物在制备鉴别不同结缕草种质亲缘关系的试剂盒中的应用。
4.一种鉴别不同结缕草种质亲缘关系的试剂盒，其特征在于，包括SEQ ID NO.1～SEQID NO.40所示引物中任意一组或三组的结合；具体为：
5.一种鉴别不同结缕草种质亲缘关系的方法，其特征在于，以所述试剂盒进行检测。
6.根据权利要求5所述的一种鉴别不同结缕草种质亲缘关系的方法，其特征在于，过程包括：
1)利用筛选出的20对EST-SSR引物中任意3对引物对43份结缕草属种质进行EST-SSR的PCR扩增，得到多态性条带，并观察每对引物扩增出的等位基因数量；
2)根据EST-SSR引物的多态性条带，利用NTSYS软件对43份结缕草属种质进行遗传多样性研究，确定遗传系数，分析亲缘关系的远近。
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