CN111592693A - 一种高强度甲壳素复合水凝胶材料及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医用材料领域，公开了一种高强度甲壳素复合水凝胶材料及其制备方法与应用。本发明的复合水凝胶材料由甲壳素为基体和表面呈负电性的甲壳素晶须为增强填料组成；所述的表面呈负电性的甲壳素晶须作为增强填料与甲壳素基体复合，晶须表面带有负电荷的基团可形成强静电排斥力，有效促进甲壳素晶须在甲壳素基体中的均匀分散，同时与基体能实现良好的界面结合，从而充分发挥晶须的增强效果，赋予甲壳素复合水凝胶材料优异的力学性能；同时，本发明的甲壳素复合水凝胶材料具有良好的生物相容性和成骨活性，在骨组织修复等生物医学领域具有良好的应用前景。

Description

一种高强度甲壳素复合水凝胶材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种高强度甲壳素复合水凝胶材料及其制备方法与应用。
背景技术
由于创伤、遗传疾病和进行性衰老，骨损伤已成为普遍且日益严重的问题，特别是由高能创伤引起的骨缺损通常伴有骨膜缺损。研究表明，骨膜在骨再生中起着非常关键的作用，没有骨膜可能会损害骨再生的进程，导致骨损伤处愈合时间延长甚至不愈合。因此，开发一种具有骨骼修复特性的先进骨膜生物材料具有十分重要的意义。甲壳素是一种来源丰富的半结晶天然多糖，广泛分布于虾、蟹等甲壳动物的外壳中，是地球上第二大可再生资源。因其具有良好的生物相容性、可生物降解性、高亲水性以及良好的抗菌性能和成骨活性等优异性质，被广泛应用于生物医用材料领域。然而，甲壳素分子间以及分子内部都存在着很强的氢键作用，从而难以在常用溶剂下溶解，故对其进行深加工存在困难。经研究，可采用离子液体溶解甲壳素，这对于扩大甲壳素在生物医用材料领域中的应用具有重大意义(CN103059320A)。
拥有良好的物理化学性质和生物学功能的水凝胶是构建骨膜生物材料的首要选择，它能够保持大量的水分，具有与天然细胞外基质相似的亲水性。因此，制备甲壳素水凝胶，可以综合天然多糖甲壳素和水凝胶的性能优势，作为骨膜生物材料是一个很好的选择；然而，使用单一的甲壳素水凝胶作为骨膜修复材料仍然存在机械强度和弹性较弱的缺陷。
为了改善甲壳素水凝胶的力学性能，添加纳米填料如埃洛石纳米管、羟基磷灰石颗粒、氧化石墨烯是常用方法；然而，所制备的甲壳素水凝胶的力学强度仍然不够理想，未能实现力学性能的大幅提升。甲壳素晶须(CHWs)，一种通过酸解甲壳素得到的针棒状纳米单晶，不仅具有甲壳素的优异性质，而且具有高强度、高模量以及一定的长径比，近年作为聚合物增强填料引起了广泛的关注。但是，目前用于聚合物增强填料的甲壳素晶须通常为酸解等方法制备的表面呈正电性的甲壳素晶须，它们仅在酸性条件下分散稳定，在碱性环境下分散性会受到影响，易于团聚。而常用溶解甲壳素的离子液体呈现强碱性并带有较高的离子强度，这不利于带正电性甲壳素晶须在基体溶液中的分散，因此，未见使用甲壳素晶须增强甲壳素基水凝胶的研究报道。
因此，寻求一种有效的方法使甲壳素晶须在甲壳素基质液体溶液中能够实现良好的分散性，从而更为有效地发挥甲壳素晶须的力学增强效果具有现实意义。
甲壳素晶须是棒状胶体颗粒，其分散稳定性类似于其他胶体体系，在很大程度上主要取决于两种稳定机制：由表面电荷基团引起的静电稳定和由表面吸附或接枝的聚合物链贡献的空间稳定。有研究报道，在甲壳素纳米纤维上接枝丙烯酸，可提高其在碱性水溶液中的分散性(Carbohydrate polymers,2012,90(1):623-627)。但该方法较复杂且需要用到引发剂和有毒试剂。
因此，设计一种绿色、简单的方法获得表面带负电性的甲壳素晶须，从而改善其在甲壳素离子液体中的分散性，以赋予所制备的甲壳素晶须增强甲壳素基体水凝胶更为优异的力学性能具有重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的主要目的是提供一种高强度甲壳素复合水凝胶材料，该复合水凝胶材料由甲壳素为基体和表面呈负电性的甲壳素晶须为增强填料组成，所述表面呈负电性的甲壳素晶须在甲壳素基体中具有良好的分散性，且与基体具有良好的界面结合，甲壳素晶须优异的力学增强效果可以充分发挥，从而赋予复合水凝胶材料优异的力学性能。
本发明的另一目的在于提供上述高强度甲壳素复合水凝胶材料的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述高强度甲壳素复合水凝胶材料的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种高强度甲壳素复合水凝胶材料，由包括甲壳素为基体和表面呈负电性的甲壳素晶须为增强填料组成。
所述的高强度甲壳素复合水凝胶材料中，甲壳素的含量为0.1-15wt％；表面呈负电性的甲壳素晶须与甲壳素的质量比为0.1:100-7:100，优选为1:100-5:100。
优选的，所述的表面呈负电性的甲壳素晶须为针棒状，长度为200-350nm，直径为15-25nm。
所述的表面呈负电性的甲壳素晶须可采用包括甲壳素和马来酸酐经酯化反应制备得到，可包括以下具体步骤：将甲壳素与马来酸酐在惰性气氛下于60-120℃酯化反应0.5-8h，分离得到表面呈负电性的甲壳素晶须。
优选的，甲壳素与马来酸酐的质量比为1:5-1:40，更优选为1:20。
优选的，得到的表面呈负电性的甲壳素晶须可用乙醇和水洗涤、碱处理、冷冻干燥并研磨。
优选的，所述碱处理指将反应后产物浸泡于碱液中；优选浸泡时间为0.5-12h；所述的碱液可为氢氧化钠等稀溶液，更优选为1mol/L NaOH水溶液。更具体可包括以下步骤：在室温下将反应产物浸泡在1mol/L NaOH水溶液中0.5-12h以完成碱处理。碱处理可使得反应产物表面修饰的羧基基团转化为羧酸盐基团，然后可用水反复离心以去除过量的NaOH。
优选的，所述的惰性气氛可为氮气、氩气等常规惰性气氛围；所述马来酸酐在55-100℃熔融后与甲壳素反应。
本发明还提供一种上述高强度甲壳素复合水凝胶材料的制备方法，包括以下步骤：将表面呈负电性的甲壳素晶须配成水悬浮液与甲壳素溶液混合后置于乙醇溶液中进行物理交联，得到高强度甲壳素复合水凝胶材料。
所述水悬浮液中，表面呈负电性的甲壳素晶须的浓度优选为0.1-7wt％。
进一步的，所述将表面呈负电性的甲壳素晶须配成水悬浮液，具体为将表面呈负电性的甲壳素晶须加入水中均化得到。
优选的，所述均化的时间可为0.5-5h；所述均化可采用细胞破碎机在100-500W功率下进行。
进一步的，所述的甲壳素溶液优选为将甲壳素溶于碱性离子液体中得到。更优选为由包括以下步骤方法制备得到：-50℃至-10℃下，将甲壳素加入碱性离子液体中，搅拌0.5-6h，转移到0-10℃下放置0.5-96h。
优选的，所述的甲壳素溶液中含有0.1-15wt％的甲壳素。
优选的，所述的碱性离子液体可由10-30wt％的强碱、1-10wt％的尿素和/或硫脲、以及水组成。
优选的，所述的强碱可包括KOH、NaOH、LiOH等中的至少一种。
所述的甲壳素优选进行纯化再使用，可包括以下具体步骤：将甲壳素粉末分别用强碱和强氧化剂溶液进行搅拌处理，每次搅拌处理后用水洗涤至洗涤液为中性，最后冷冻干燥、研磨。
优选的，所述的强碱溶液可包括NaOH、KOH、Ca(OH)2等中的至少一种。
优选的，所述的强碱溶液的浓度为0.5-3mol/L。所述的强碱溶液搅拌处理在常温下进行，处理时间为12-24h。
优选的，所述的强氧化剂可包括NaClO2、NaClO、H2O2等中的至少一种。
优选的，所述的强氧化剂溶液的浓度为0.01-0.5mol/L。所述的强氧化剂溶液可用醋酸调节pH至4。所述的强氧化剂溶液搅拌处理在60-90℃下进行，处理时间为1-8h。
进一步的，所述的混合可包括以下具体步骤：将表面呈负电性的甲壳素晶须水悬浮液逐滴加入甲壳素溶液中，在0-10℃下搅拌1-6h。
进一步的，所述的置于乙醇溶液中进行物理交联可包括以下具体步骤：将混合后的溶液浇铸在模具上，随后浸泡于-15～35℃的30-100wt％乙醇水溶液中进行物理交联0.5-24h，得到高强度甲壳素复合水凝胶材料。
所述模具可根据需要采用不同形状及厚度，如可采用用于制备膜材料的模具，从而制备得到高强度甲壳素复合水凝胶膜材料。
优选的，得到的高强度甲壳素复合水凝胶材料可用水多次冲洗，以除去碱性离子液体残留的化学物。
本发明采用甲壳素为基体和表面呈负电性的甲壳素晶须为增强填料制备得到甲壳素复合水凝胶材料。其中，表面呈负电性的甲壳素晶须在水凝胶体系中具有良好的分散性，并与甲壳素基体实现了良好的界面结合，显著增强了甲壳素水凝胶的力学性能。本发明制备得到的甲壳素复合水凝胶材料，不仅具有优异的力学性能，同时还具有高亲水性，良好的抗菌性能和成骨活性，在生物医学材料领域具有良好的应用前景。
相比于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明制备表面呈负电性的甲壳素晶须的方法具有低成本、易于净化和环境友好的特点，将其与甲壳素基体复合便可制得高强度的甲壳素复合水凝胶材料，操作简易、高效。
(2)相比于通常选用表面呈正电性的甲壳素晶须作为聚合物基体的增强填料，本发明中表面呈负电性的甲壳素晶须表面的羧基在强碱性甲壳素基体离子液体中电离，从而在晶须表面产生大量带有负电荷的羧酸根基团而形成强静电排斥力，有效促进甲壳素晶须在碱性甲壳素离子液体基体中的均匀分散，而不会造成絮凝现象。
(3)本发明采用表面呈负电性的甲壳素晶须作为增强填料，其与甲壳素基体的组成成分相同，可期望基体和晶须之间通过氢键和静电相互作用实现良好的界面结合。
(4)本发明采用表面呈负电性的甲壳素晶须作为增强填料与甲壳素基体复合，晶须在基体中的分散性良好，且与基体有良好的界面结合，从而可以充分发挥晶须的增强效果，赋予甲壳素复合水凝胶材料优异的力学性能，其拉伸强度可达2-7MPa。
(5)本发明制备的高强度甲壳素复合水凝胶材料具有良好的生物相容性，并能实现良好的成骨活性，可望作为人造骨膜在骨组织修复等生物医学材料领域中有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1的表面呈负电性的甲壳素晶须(mCHWs)的透射电镜照片。
图2为实施例9的高强度甲壳素复合水凝胶材料的微观形貌扫描电镜照片；其中(A)为甲壳素复合水凝胶材料的表面微观形貌，(B)为甲壳素复合水凝胶材料的断面微观形貌。
图3为实施例9和对比例1的高强度甲壳素复合水凝胶材料的应力-应变曲线图。
图4为实施例9和对比例1、对比例2的甲壳素复合水凝胶材料的应力-应变曲线图。
图5为实施例9和对比例1的甲壳素复合水凝胶材料的细胞增殖情况图。
图6为实施例9和对比例1的甲壳素水凝胶材料的碱性磷酸酶分泌情况图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步阐述，但本发明的实施方式不限于此。基于本发明的实施例，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权力要求书所限定的范围。如无特别说明，本发明中所有原料和试剂均为市购常规的原料、试剂。
实施例中各组分的用量以质量体积份计，g、mL。
实施例1：高强度甲壳素复合水凝胶材料的制备
步骤一：将甲壳素粉末在常温下浸泡于0.5mol/L的NaOH溶液中搅拌处理24h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。然后，再将甲壳素粉末在90℃下浸泡于0.01mol/L的NaClO2溶液(醋酸调节pH至4)中搅拌处理4h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。最后将其冷冻干燥并研磨可获得纯化的甲壳素粉末。在-25℃条件下，按照2wt％的浓度将甲壳素粉末溶解在碱性离子液体(16wt％KOH、7wt％尿素)中，搅拌4h后，转移到4℃下放置30h，然后在0℃下离心15min排除气泡，得到甲壳素溶液。
步骤二：将80质量份固体马来酸酐于70℃熔融，然后加入4质量份甲壳素粉末，在N2气氛100℃下搅拌反应6h。反应结束后，将所得沉淀物用乙醇洗涤，并用水离心5次以完全除去残留的马来酸酐。随后，在室温下将沉淀物浸泡在1mol/L NaOH水溶液中3h以完成碱处理，接着用水离心6次以去除过量的NaOH。最后，通过冷冻干燥并研磨获得表面呈负电性的甲壳素晶须(mCHWs)。通过透射电镜对所制备的mCHWs的形貌进行观察，结果见附图1。由图1可以看到mCHWs呈现针棒状，形貌较均匀，分散较好，其长度和直径主要集中在200-350nm和15-25nm范围内。将上述制备的mCHWs用水配制成1wt％的水悬浮液，然后用细胞破碎机在100W功率下超声分散5h，得到表面呈负电性的甲壳素晶须水悬浮液。
步骤三：将步骤二得到的表面呈负电性的甲壳素晶须水悬浮液逐滴加入到步骤一得到的甲壳素溶液中(甲壳素晶须与甲壳素质量比为4:100)，在4℃下搅拌6h。然后，将所制备的混合溶液浇铸在模具上，随后浸泡于-10℃的65wt％的乙醇水溶液中10h。最后，用水多次冲洗以去除碱性离子液体残留的化学物，从而得到高强度甲壳素复合水凝胶材料。
将实施例1制得的甲壳素复合水凝胶材料切割成10mm×40mm的矩形样品进行拉伸性能测试，该甲壳素复合水凝胶的拉伸强度为3.08±0.65MPa，杨氏模量为2.73±0.49MPa。
实施例2：高强度甲壳素复合水凝胶材料的制备
步骤一：将甲壳素粉末在常温下浸泡于1mol/L的NaOH溶液中搅拌处理20h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。然后，再将甲壳素粉末在80℃下浸泡于0.05mol/L的NaClO2溶液(醋酸调节pH至4)中搅拌处理5h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。最后将其冷冻干燥并研磨可获得纯化的甲壳素粉末。在-30℃条件下，按照5wt％的浓度将甲壳素粉末溶解在碱性离子液体(18wt％KOH、4wt％尿素)中，搅拌3h后，转移到6℃下放置20h，然后在0℃下离心15min排除气泡，得到甲壳素溶液。
步骤二：将320质量份固体马来酸酐于60℃熔融，然后加入16质量份甲壳素粉末，在N2气氛115℃下搅拌反应4h。反应结束后，将所得沉淀物用乙醇洗涤，并用水离心5次以完全除去残留的马来酸酐。随后，在室温下将沉淀物浸泡在1mol/L NaOH水溶液中6h以完成碱处理，接着用水离心8次以去除过量的NaOH。最后，通过冷冻干燥并研磨获得表面呈负电性的甲壳素晶须(mCHWs)。将上述制备的mCHWs用水配制成3wt％的水悬浮液，用细胞破碎机在200W功率下超声分散3h，得到表面呈负电性的甲壳素晶须水悬浮液。
步骤三：将步骤二得到的表面呈负电性的甲壳素晶须水悬浮液逐滴加入到步骤一得到的甲壳素溶液中(甲壳素晶须与甲壳素质量比为5:100)，在6℃下搅拌5h。然后，将所制备的混合溶液浇铸在模具上，随后浸泡于0℃的90wt％的乙醇水溶液中16h。最后，用水多次冲洗以去除碱性离子液体残留的化学物，从而得到高强度甲壳素复合水凝胶材料。
将实施例2制得的甲壳素复合水凝胶材料切割成10mm×40mm的矩形样品进行拉伸性能测试，该甲壳素复合水凝胶的拉伸强度为5.35±0.34MPa，杨氏模量为5.11±0.52MPa。
实施例3：高强度甲壳素复合水凝胶的制备
步骤一：将甲壳素粉末在常温下浸泡于2mol/L的NaOH溶液中搅拌处理15h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。然后，再将甲壳素粉末在70℃下浸泡于0.25mol/L的NaClO2溶液(醋酸调节pH至4)中搅拌处理3h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。最后将其冷冻干燥并研磨可获得纯化的甲壳素粉末。在-35℃条件下，按照8wt％的浓度将甲壳素粉末溶解在碱性离子液体(20wt％KOH、5wt％尿素)中，搅拌2h后，转移到8℃下放置12h，然后在0℃下离心15min排除气泡，得到甲壳素溶液。
步骤二：将150质量份固体马来酸酐于80℃熔融，然后加入7.5质量份甲壳素粉末，在N2气氛100℃下搅拌反应2h。反应结束后，将所得沉淀物用乙醇洗涤，并用水离心5次以完全除去残留的马来酸酐。随后，在室温下将沉淀物浸泡在1mol/L NaOH水溶液中10h以完成碱处理，接着用水离心5次以去除过量的NaOH。最后，通过冷冻干燥并研磨获得表面呈负电性的甲壳素晶须(mCHWs)。将上述制备的mCHWs用水配制成5wt％的水悬浮液，用细胞破碎机在300W功率下超声分散2h，得到表面呈负电性的甲壳素晶须水悬浮液。
步骤三：将步骤二得到的表面呈负电性的甲壳素晶须水悬浮液逐滴加入到步骤一得到的甲壳素溶液中(甲壳素晶须与甲壳素质量比为5:100)，在8℃下搅拌3h。然后，将所制备的混合溶液浇铸在模具上，随后浸泡于10℃的85wt％的乙醇水溶液中20h。最后，用水多次冲洗以去除碱性离子液体残留的化学物，从而得到高强度甲壳素复合水凝胶材料。
将实施例3制得的甲壳素复合水凝胶材料切割成10mm×40mm的矩形样品进行拉伸性能测试，该甲壳素复合水凝胶的拉伸强度为4.52±0.24MPa，杨氏模量为4.46±0.52MPa。
实施例4：高强度甲壳素复合水凝胶材料的制备
步骤一：将甲壳素粉末在常温下浸泡于3mol/L的NaOH溶液中搅拌处理12h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。然后，再将甲壳素粉末在65℃下浸泡于0.45mol/L的NaClO2溶液(醋酸调节pH至4)中搅拌处理1h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。最后将其冷冻干燥并研磨可获得纯化的甲壳素粉末。在-20℃条件下，按照10wt％的浓度将甲壳素粉末溶解在碱性离子液体(16wt％KOH、6wt％尿素)中，搅拌1h后，转移到2℃下放置36h，然后在0℃下离心15min排除气泡，得到甲壳素溶液。
步骤二：将200质量份固体马来酸酐于100℃熔融，然后加入10质量份甲壳素粉末，在N2气氛100℃下搅拌反应8h。反应结束后，将所得沉淀物用乙醇洗涤，并用水离心5次以完全除去残留的马来酸酐。随后，在室温下将沉淀物浸泡在1mol/L NaOH水溶液中12h以完成碱处理，接着用水离心8次以去除过量的NaOH。最后，通过冷冻干燥并研磨获得表面呈负电性的甲壳素晶须(mCHWs)。将上述制备的mCHWs用水配制成7wt％的水悬浮液，用细胞破碎机在500W功率超声分散1h，得到表面呈负电性的甲壳素晶须水悬浮液。
步骤三：将步骤二得到的表面呈负电性的甲壳素晶须水悬浮液逐滴加入到步骤一得到的甲壳素溶液中(甲壳素晶须与甲壳素质量比为6:100)，在10℃下搅拌2h。然后，将所制备的混合溶液浇铸在模具上，随后浸泡于20℃的70wt％的乙醇水溶液中24h。最后，用水多次冲洗以去除碱性离子液体残留的化学物，从而得到高强度甲壳素复合水凝胶材料。
将实施例4制得的甲壳素复合水凝胶材料切割成10mm×40mm的矩形样品进行拉伸性能测试，该甲壳素复合水凝胶的拉伸强度为3.58±0.42MPa，杨氏模量为4.26±0.33MPa。
实施例5：高强度甲壳素复合水凝胶材料的制备
步骤一：将甲壳素粉末在常温下浸泡于2.5mol/L的NaOH溶液中搅拌处理18h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。然后，再将甲壳素粉末在75℃下浸泡于0.15mol/L的NaClO2溶液(醋酸调节pH至4)中搅拌处理6h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。最后将其冷冻干燥并研磨可获得纯化的甲壳素粉末。在-35℃条件下，按照14wt％的浓度将甲壳素粉末溶解在碱性离子液体(25wt％KOH、7wt％尿素)中，搅拌5h后，转移到0℃下放置84h，然后在0℃下离心15min排除气泡，得到甲壳素溶液。
步骤二：将30质量份固体马来酸酐于90℃熔融，然后加入1.5质量份甲壳素粉末，在N2气氛110℃下搅拌反应3h。反应结束后，将所得沉淀物用乙醇洗涤，并用水离心5次以完全除去残留的马来酸酐。随后，在室温下将沉淀物浸泡在1mol/L NaOH水溶液中2h以完成碱处理，接着用水离心7次以去除过量的NaOH。最后，通过冷冻干燥并研磨获得表面呈负电性的甲壳素晶须(mCHWs)。将上述制备的mCHWs用水配制成5wt％的水悬浮液，用细胞破碎机在400W功率下超声分散1.5h，得到表面呈负电性的甲壳素晶须水悬浮液。
步骤三：将步骤二得到的表面呈负电性的甲壳素晶须水悬浮液逐滴加入到步骤一得到的甲壳素溶液中(甲壳素晶须与甲壳素质量比为3:100)，在2℃下搅拌4h。然后，将所制备的混合溶液浇铸在模具上，随后浸泡于-15℃的50wt％的乙醇水溶液中8h。最后，用水多次冲洗以去除碱性离子液体残留的化学物，从而得到高强度甲壳素复合水凝胶材料。
将实施例5制得的甲壳素复合水凝胶材料切割成10mm×40mm的矩形样品进行拉伸性能测试，该甲壳素复合水凝胶的拉伸强度为3.41±0.25MPa，杨氏模量为3.23±0.41MPa。
实施例6：高强度甲壳素复合水凝胶材料的制备
步骤一：将甲壳素粉末在常温下浸泡于1.5mol/L的NaOH溶液中搅拌处理22h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。然后，再将甲壳素粉末在60℃下浸泡于0.30mol/L的NaClO2溶液(醋酸调节pH至4)中搅拌处理7h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。最后将其冷冻干燥并研磨可获得纯化的甲壳素粉末。在-40℃条件下，按照12wt％的浓度将甲壳素粉末溶解在碱性离子液体(28wt％KOH、3wt％尿素)中，搅拌2.5h后，转移到5℃下放置8h，然后在0℃下离心15min排除气泡，得到甲壳素溶液。
步骤二：将360质量份固体马来酸酐于58℃熔融，然后加入18质量份甲壳素粉末，在N2气氛70℃下搅拌反应7h。反应结束后，将所得沉淀物用乙醇洗涤，并用水离心6次以完全除去残留的马来酸酐。随后，在室温下将沉淀物浸泡在1mol/L NaOH水溶液中1h以完成碱处理，接着用水离心8次以去除过量的NaOH。最后，通过冷冻干燥并研磨获得表面呈负电性的甲壳素晶须(mCHWs)。将上述制备的mCHWs用水配制成6wt％的水悬浮液，用细胞破碎机在350W功率下超声分散2h，得到表面呈负电性的甲壳素晶须水悬浮液。
步骤三：将步骤二得到的表面呈负电性的甲壳素晶须水悬浮液逐滴加入到步骤一得到的甲壳素溶液中(甲壳素晶须与甲壳素质量比为4:100)，在0℃下搅拌1h。然后，将所制备的混合溶液浇铸在模具上，随后浸泡于15℃的95wt％的乙醇水溶液中5h。最后，用水多次冲洗以去除碱性离子液体残留的化学物，从而得到高强度甲壳素复合水凝胶材料。
将实施例6制得的甲壳素复合水凝胶材料切割成10mm×40mm的矩形样品进行拉伸性能测试，该甲壳素复合水凝胶的拉伸强度为4.66±0.27MPa，杨氏模量为4.46±0.54MPa。
实施例7：高强度甲壳素复合水凝胶材料的制备
步骤一：将甲壳素粉末在常温下浸泡于0.8mol/L的NaOH溶液中搅拌处理16h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。然后，再将甲壳素粉末在85℃下浸泡于0.20mol/L的NaClO2溶液(醋酸调节pH至4)中搅拌处理2h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。最后将其冷冻干燥并研磨可获得纯化的甲壳素粉末。在-15℃条件下，按照4wt％的浓度将甲壳素粉末溶解在碱性离子液体(22wt％KOH、2wt％尿素)中，搅拌6h后，转移到9℃下放置60h，然后在0℃下离心15min排除气泡，得到甲壳素溶液。
步骤二：将100质量份固体马来酸酐于95℃熔融，然后加入5质量份甲壳素粉末，在N2气氛95℃下搅拌反应5h。反应结束后，将所得沉淀物用乙醇洗涤，并用水离心6次以完全除去残留的马来酸酐。随后，在室温下将沉淀物浸泡在1mol/L NaOH水溶液中4h以完成碱处理，接着用水离心7次以去除过量的NaOH。最后，通过冷冻干燥并研磨获得表面呈负电性的甲壳素晶须(mCHWs)。将上述制备的mCHWs用水配制成0.5wt％的水悬浮液，用细胞破碎机在250W功率超声分散1.5h，得到表面呈负电性的甲壳素晶须水悬浮液。
步骤三：将步骤二得到的表面呈负电性的甲壳素晶须水悬浮液逐滴加入到步骤一得到的甲壳素溶液中(甲壳素晶须与甲壳素质量比为1:100)，在5℃下搅拌3.5h。然后，将所制备的混合溶液浇铸在模具上，随后浸泡于22℃的100wt％的乙醇水溶液中22h。最后，用水多次冲洗以去除碱性离子液体残留的化学物，从而得到高强度甲壳素复合水凝胶材料。
将实施例7制得的甲壳素复合水凝胶材料切割成10mm×40mm的矩形样品进行拉伸性能测试，该甲壳素复合水凝胶的拉伸强度为3.97±0.22MPa，杨氏模量为3.42±0.38MPa。
实施例8：高强度甲壳素复合水凝胶材料的制备
步骤一：将甲壳素粉末在常温下浸泡于2.6mol/L的NaOH溶液中搅拌处理14h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。然后，再将甲壳素粉末在72℃下浸泡于0.36mol/L的NaClO2溶液(醋酸调节pH至4)中搅拌处理8h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。最后将其冷冻干燥并研磨可获得纯化的甲壳素粉末。在-45℃条件下，按照6wt％的浓度将甲壳素粉末溶解在碱性离子液体(10wt％KOH、8wt％尿素)中，搅拌3.5h后，转移到10℃下放置5h，然后在0℃下离心15min排除气泡，得到甲壳素溶液。
步骤二：将250质量份固体马来酸酐于75℃熔融，然后加入12.5质量份甲壳素粉末，在N2气氛85℃下搅拌反应6h。反应结束后，将所得沉淀物用乙醇洗涤，并用水离心6次以完全除去残留的马来酸酐。随后，在室温下将沉淀物浸泡在1mol/L NaOH水溶液中0.5h以完成碱处理，接着用水离心6次以去除过量的NaOH。最后，通过冷冻干燥并研磨获得表面呈负电性的甲壳素晶须(mCHWs)。将上述制备的mCHWs用水配制成4wt％的水悬浮液，用细胞破碎机在150W功率下超声分散3h，得到表面呈负电性的甲壳素晶须水悬浮液。
步骤三：将步骤二得到的表面呈负电性的甲壳素晶须水悬浮液逐滴加入到步骤一得到的甲壳素溶液中(甲壳素晶须与甲壳素质量比为6:100)，在7℃下搅拌4h。然后，将所制备的混合溶液浇铸在模具上，随后浸泡于5℃的100wt％的乙醇水溶液中12h。最后，用水多次冲洗以去除碱性离子液体残留的化学物，从而得到高强度甲壳素复合水凝胶材料。
将实施例8制得的甲壳素复合水凝胶材料切割成10mm×40mm的矩形样品进行拉伸性能测试，该甲壳素复合水凝胶的拉伸强度为5.46±0.27MPa，杨氏模量为5.06±0.54MPa。
实施例9：高强度甲壳素复合水凝胶材料的制备
步骤一：将甲壳素粉末在常温下浸泡于1.2mol/L的NaOH溶液中搅拌处理18h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。然后，再将甲壳素粉末在85℃下浸泡于0.03mol/L的NaClO2溶液(醋酸调节pH至4)中搅拌处理3.5h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。最后将其冷冻干燥并研磨可获得纯化的甲壳素粉末。在-28℃条件下，按照6wt％的浓度将甲壳素粉末溶解在碱性离子液体(17wt％KOH、4wt％尿素)中，搅拌2.5h后，转移到5℃下放置24h，然后在0℃下离心15min排除气泡，得到甲壳素溶液。
步骤二：将110质量份固体马来酸酐于70℃熔融，然后加入5.5质量份甲壳素粉末，在N2气氛120℃下搅拌反应4h。反应结束后，将所得沉淀物用乙醇洗涤，并用水离心6次以完全除去残留的马来酸酐。随后，在室温下将沉淀物浸泡在1mol/L NaOH水溶液中2h以完成碱处理，接着用水离心6次以去除过量的NaOH。最后，通过冷冻干燥并研磨获得表面呈负电性的甲壳素晶须(mCHWs)。将上述制备的mCHWs用水分别配制成1wt％、3wt％、5wt％、7wt％的水悬浮液，然后用细胞破碎机在250W功率下超声分散2.5h，得到不同浓度的表面呈负电性的甲壳素晶须水悬浮液。
步骤三：将步骤二得到的表面呈负电性的甲壳素晶须水悬浮液逐滴加入到步骤一得到的甲壳素溶液中，在6℃下搅拌5.5h。然后，将所制备的混合溶液浇铸在模具上，随后浸泡于-5℃的95wt％的乙醇水溶液中15h。最后，用水多次冲洗以去除碱性离子液体残留的化学物，分别得到甲壳素晶须与甲壳素质量比为1:100、3:100、5:100、7:100的高强度甲壳素复合水凝胶材料，分别标记为1％mCHW/chitin、3％mCHW/chitin、5％mCHW/chitin和7％mCHW/chitin水凝胶，其表面和断面的微观形貌如附图2所示。从图中可以看出，随着晶须含量的增加，甲壳素复合水凝胶形成的网络结构更加紧密，孔隙减小，有利于提高复合水凝胶的力学强度和韧性。
将实施例9制得的四组水凝胶材料分别切割成10mm×40mm的矩形样品进行拉伸性能测试。测试得到的拉伸性能数据如表1所示，应力-应变曲线如附图3所示。
表1高强度甲壳素复合水凝胶材料的拉伸性能
样品 拉伸强度(MPa) 杨氏模量(MPa)
1％mCHW/chitin 5.23±0.19 5.08±0.41
3％mCHW/chitin 5.77±0.19 5.22±0.65
5％mCHW/chitin 4.33±0.23 4.46±0.44
7％mCHW/chitin 2.18±0.11 3.19±0.13
对比例1：纯甲壳素水凝胶材料的制备
步骤一：将甲壳素粉末在常温下浸泡于1.2mol/L的NaOH溶液中搅拌处理18h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。然后，再将甲壳素粉末在85℃下浸泡于0.03mol/L的NaClO2溶液(醋酸调节pH至4)中搅拌处理3.5h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。最后将其冷冻干燥并研磨可获得纯化的甲壳素粉末。在-28℃条件下，按照6wt％的浓度将甲壳素粉末溶解在碱性离子液体(17wt％KOH、4wt％尿素)中，搅拌2.5h后，转移到5℃下放置24h，然后在0℃下离心15min排除气泡，得到甲壳素溶液。
步骤二：将步骤一所制备的甲壳素溶液浇铸在模具上，随后浸泡于-5℃的95wt％的乙醇水溶液中15h。最后，用水多次冲洗以去除碱性离子液体残留的化学物，从而得到甲壳素水凝胶材料(chitin水凝胶)。
将对比例1制得的chitin水凝胶切割成10mm×40mm的矩形样品进行拉伸性能测试。测试得到的应力-应变曲线如附图3所示，该甲壳素水凝胶的拉伸强度为3.43±0.59MPa，杨氏模量为2.93±0.25MPa。同时，将其与实施例9制得的四组甲壳素复合水凝胶材料进行比较。从附图3的力学测试结果可以看出，相对于纯甲壳素水凝胶，加入mCHWs能显著提高甲壳素基体水凝胶材料的力学性能。随着mCHWs晶须含量的增加，复合水凝胶的拉伸强度和拉伸模量呈上升趋势。但是在mCHWs晶须与甲壳素的质量比为7:100时，力学性能有所下降，这可能是mCHWs含量较多时在基体中有所团聚而影响了甲壳素复合水凝胶的力学性能。
对比例2：表面呈正电性甲壳素晶须/甲壳素复合水凝胶材料的制备
步骤一：将甲壳素粉末在常温下浸泡于1.2mol/L的NaOH溶液中搅拌处理18h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。然后，再将甲壳素粉末在85℃下浸泡于0.03mol/L的NaClO2溶液(醋酸调节pH至4)中搅拌处理3.5h，随后用水过滤洗涤多次至洗涤液为中性。最后将其冷冻干燥并研磨可获得纯化的甲壳素粉末。在-28℃条件下，按照6wt％的浓度将甲壳素粉末溶解在碱性离子液体(17wt％KOH、4wt％尿素)中，搅拌2.5h后，转移到5℃下放置24h，然后在0℃下离心15min排除气泡，得到甲壳素溶液。
步骤二：将10质量份甲壳素粉末加入到3mol/L的HCl水溶液中，然后在N2气氛下加热至90℃搅拌反应4h。随后，将所得的悬浮液以3000r/min离心20min，然后用水稀释沉淀物。重复上述离心-稀释过程5次后，将所得产物用水渗析，直至透析液的pH约为7.0。最后，将所得产物冷冻干燥并研磨得到表面呈正电性的甲壳素晶须(CHWs)。将上述制备的CHWs用水配制成3wt％的水悬浮液，然后用细胞破碎机在250W功率下超声分散2.5h，得到表面呈正电性的甲壳素晶须水悬浮液。
步骤三：将步骤二得到的表面呈正电性的甲壳素晶须水悬浮液逐滴加入到步骤一得到的甲壳素溶液中(甲壳素晶须与甲壳素质量比为3:100)，在6℃下搅拌5.5h。然后，将所制备的混合溶液浇铸在模具上，随后浸泡于-5℃的95wt％的乙醇水溶液中15h。最后，用水多次冲洗以去除碱性离子液体残留的化学物，从而得到甲壳素复合水凝胶材料(3％CHW/chitin水凝胶)。
将对比例2制得的3％CHW/chitin水凝胶切割成10mm×40mm的矩形样品进行拉伸性能测试。测试得到的应力-应变曲线如附图4所示，该甲壳素复合水凝胶的拉伸强度为3.76±0.21MPa，杨氏模量为3.21±0.10MPa。同时，将其与实施例9制得的3％mCHW/chitin水凝胶材料和对比例1制得纯甲壳素水凝胶材料进行比较。从附图4的力学测试结果可以看出，选用CHWs或mCHWs作为增强填料均能改善纯甲壳素水凝胶的力学性能，但3％mCHW/chitin水凝胶材料的拉伸强度和拉伸模量约分别为相应的3％CHW/chitin水凝胶材料的154％和163％。这说明相对于CHWs，采用mCHWs作为增强填料与甲壳素基体复合，mCHWs在基体中的分散性更加良好，且与基体有良好的界面结合，从而可以充分发挥晶须的增强效果，赋予甲壳素复合水凝胶材料更加优异的力学性能。
细胞增殖实验
将实施例9所制得的四组甲壳素复合水凝胶材料和对比例1所制得的纯甲壳素水凝胶材料置于24孔板，用70wt％的酒精浸泡2h灭菌后再用PBS缓冲液浸洗2次，以每孔1×104的密度接种成骨细胞(MC3T3-E1)后加入1mL培养液(含有89wt％的基础培养基、10wt％的胎牛血清(FBS)以及1wt％的青霉素/链霉素)。将孔板放置于37℃培养箱内培养1、4、7天后分别使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖水平，其结果见附图5。
从图中可以看出，随着时间的增加，MC3T3-E1细胞在各组水凝胶材料上的吸光度值逐渐增加。相比于纯甲壳素水凝胶，加入了mCHWs的甲壳素复合水凝胶的吸光度值显著提升，表明mCHWs的添加有利于成骨细胞的增殖和生长。随着mCHWs含量增加至5wt％，其相对应的甲壳素复合水凝胶上细胞增殖效果最佳。
细胞碱性磷酸酶实验
将实施例9所制得的四组甲壳素复合水凝胶材料和对比例1所制得的纯甲壳素水凝胶材料置于24孔板，用70wt％的酒精浸泡2h灭菌后再用PBS缓冲液浸洗2次，以每孔1×104的密度接种成骨细胞(MC3T3-E1)后加入1mL培养液(含有89wt％的基础培养基、10wt％的胎牛血清(FBS)以及1wt％的青霉素/链霉素)。将孔板放置于37℃培养箱内培养14天后分别使用BCA蛋白试剂盒和ALP试剂盒检测细胞分泌碱性磷酸酶的水平，其结果见附图6。
从图6中可以看出，相比于纯甲壳素水凝胶，本发明加入了mCHWs的甲壳素复合水凝胶，细胞分泌碱性磷酸酶的活性具有显著的增长；相对于纯甲壳素水凝胶最高可提高50％，说明本发明加入了mCHWs的甲壳素复合水凝胶更有利于细胞的成骨分化。
上述实施例为本发明探索的最优实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高强度甲壳素复合水凝胶材料，其特征在于由包括甲壳素为基体和表面呈负电性的甲壳素晶须为增强填料组成。
2.根据权利要求1所述的高强度甲壳素复合水凝胶材料，其特征在于：甲壳素的含量为0.1-15wt％；表面呈负电性的甲壳素晶须与甲壳素的质量比为0.1:100-7:100。
3.根据权利要求1所述的高强度甲壳素复合水凝胶材料，其特征在于：所述的表面呈负电性的甲壳素晶须为针棒状，长度为200-350nm，直径为15-25nm。
4.根据权利要求1所述的高强度甲壳素复合水凝胶材料，其特征在于：所述的表面呈负电性的甲壳素晶须采用包括甲壳素和马来酸酐经酯化反应制备得到。
5.根据权利要求4所述的高强度甲壳素复合水凝胶材料，其特征在于包括以下具体方法步骤：将甲壳素与马来酸酐在惰性气氛下于60-120℃酯化反应0.5-8h，分离得到表面呈负电性的甲壳素晶须。
6.根据权利要求1-5任一项所述的高强度甲壳素复合水凝胶材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将表面呈负电性的甲壳素晶须配成水悬浮液与甲壳素溶液混合后置于乙醇溶液中进行物理交联，得到高强度甲壳素复合水凝胶材料。
7.根据权利要求6所述的高强度甲壳素复合水凝胶材料的制备方法，其特征在于：所述的水悬浮液中，表面呈负电性的甲壳素晶须的浓度为0.1-7wt％。
8.根据权利要求6所述的高强度甲壳素复合水凝胶材料的制备方法，其特征在于：所述的甲壳素溶液为将甲壳素溶于碱性离子液体中得到。
9.根据权利要求6所述的高强度甲壳素复合水凝胶材料的制备方法，其特征在于所述的置于乙醇溶液中进行物理交联包括以下具体步骤：将混合后的溶液浇铸在模具上，随后浸泡于-15～35℃的30-100wt％乙醇水溶液中进行物理交联0.5-24h，得到高强度甲壳素复合水凝胶材料。
10.权利要求1-5任一项所述的高强度甲壳素复合水凝胶材料在生物医学材料领域的应用。
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